專利名稱：用于生物材料提取的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。本發(fā)明包括將生物微粒在樣品室中暴露到交替電場下，并且還可以包括在提取后對生物材料進(jìn)行后續(xù)的分析。
背景技術(shù)：
針對生物恐怖的威脅，進(jìn)行生物戰(zhàn)劑的快速和精確檢測變得越來越重要。炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)細(xì)菌是形成蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)群內(nèi)生孢子的成員。炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)是高度致命的生物戰(zhàn)劑，其容易獲得、儲藏并作為生物武器進(jìn)行應(yīng)用。為了對炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)進(jìn)行可靠的檢測，必須要對DNA進(jìn)行分析，因?yàn)橄灎钛挎邨U菌(Bacillus cereus)群成員的表型差異在某些情況下小于1％。
作為例子，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)與炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)的區(qū)別僅僅在于因?yàn)楹笳吆袃蓚€(gè)另外的被稱作pXO1和pXO2的質(zhì)粒。缺少pXO1和pXO2的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)無毒性株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)實(shí)質(zhì)上是難以區(qū)分的。理論上，將pXO1和pXO2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)群的膜內(nèi)會將這些細(xì)菌變成有功能性的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)。由于這個(gè)原因，如果所檢測的生物是炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)的話，通過DNA雜交、測序或者PCR進(jìn)行DNA分析以及對質(zhì)粒pXO1和pXO2的辨別是進(jìn)行確定的唯一可行的方法。
由于它們對惡劣環(huán)境的抵抗能力，從內(nèi)生孢子中釋放和提取DNA是困難的任務(wù)。在檢測炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)中所使用的通常程序是在培養(yǎng)基質(zhì)中使孢子發(fā)育，收集細(xì)菌，以及接著從無性細(xì)菌中提取DNA，程序會耗費(fèi)幾個(gè)小時(shí)最多達(dá)到1天的時(shí)間(Levi等人2003)。其它的方法包括精巧的技術(shù)例如機(jī)械破碎、凍/融循環(huán)或者化學(xué)處理(Johns等人1994)。然而，芽孢的外殼和皮層是為長期的休眠所發(fā)育的生化結(jié)構(gòu)，其能夠持續(xù)數(shù)千年。著名的例子是在琥珀中所包含蜜蜂的腸道中所發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生孢子所復(fù)蘇的細(xì)菌(Cano和Borucki1995)。而且，機(jī)械破碎(使用珠子進(jìn)行打碎(bead beating))會導(dǎo)致所釋放DNA的質(zhì)量差(Levi等人2003)。使用目前的技術(shù)通過結(jié)合物理、機(jī)械和化學(xué)處理有可能在5～10分鐘內(nèi)從內(nèi)生孢子中釋放DNA，但是當(dāng)該應(yīng)用是檢測由浮質(zhì)所攜帶的生物恐怖襲擊時(shí)，即使是5分鐘對于DNA提取也被認(rèn)為是時(shí)間長的。使用精巧的多步驟程序在可能的炭疽襲擊的緊迫情況下不是最佳的。由于這個(gè)原因，需要一種技術(shù)其能夠快速(幾秒鐘內(nèi))無干涉的單一步驟從革蘭氏陽性菌的內(nèi)生孢子提取DNA。
芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的革蘭氏陽性菌能夠在對數(shù)生長期的末期能夠經(jīng)歷被稱作形成孢子的過程。在形成孢子的過程中，細(xì)菌形成了有皺紋的孢子，其能夠忍受惡劣的環(huán)境。孢子是休眠的結(jié)構(gòu)，其只有幾種代謝活性的酶，當(dāng)將孢子暴露到營養(yǎng)物時(shí)這些酶會誘導(dǎo)發(fā)育。
如表1所示，孢子在生化組成上非常不同。
表I.在芽孢桿菌屬(Bacillus)種類的孢子和無性細(xì)胞之間所存在的生化組成上的區(qū)別。

生化結(jié)構(gòu)和休眠的生理狀態(tài)使內(nèi)生孢子成為對機(jī)械、化學(xué)和熱極端抵抗的整體，這對快速制備樣品和生物戰(zhàn)劑的DNA提取以快速鑒定提出了特別的問題。這些孢子可以抵抗例如長時(shí)間的煮沸而不破裂。對于孢子的環(huán)境歸宿(environmental fate)知道得并不詳細(xì)。孢子可以“不確定地”在干燥和受保護(hù)的環(huán)境中存活。在南非Kruger國家公園中的挖掘顯示了壽命為200年以上的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)孢子(通過14C方法確定日期)，其仍能夠在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)育。
檢測細(xì)菌和病毒的最靈敏的方法依賴獲得得到生物細(xì)胞內(nèi)組分(例如遺傳材料)的途徑。
US 2003/0,146,100公開了通過雙向電泳從血中分離細(xì)胞，接著對所分離的細(xì)胞在流動室的帶有電極陣列的芯片上進(jìn)行電裂解以及消化。在10KHz的正弦電場中進(jìn)行電泳，裂解通過一系列400個(gè)500V和持續(xù)時(shí)間50μs的脈沖或者40個(gè)200V和持續(xù)時(shí)間10μs的脈沖(矩形波)進(jìn)行的。
US 2002/0115201公開了使用2.45～310GHz范圍內(nèi)的微波裂解細(xì)胞，進(jìn)而從液體懸浮液的細(xì)胞中釋放DNA。其還公開了帶有平行的平面外電極的室用于施加微波，該室具有流體通道以提供室內(nèi)的樣品。
US 4,970,154公開了一種使用脈沖射頻將外源基因注入細(xì)胞內(nèi)的方法。其還描述了使用室內(nèi)電極之間的脈沖射頻震蕩電場對懸浮在室中溶液內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔和融合。頻率在60Hz～10MHz之間變化，電場強(qiáng)度為100-400V/cm。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及提供用于提取的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)，即得到生物細(xì)胞的生物材料的途徑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及提供用于以高釋放率提取生物細(xì)胞的生物材料的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)，即從高百分比的生物細(xì)胞中提取或者釋放出生物材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及提供用于從生物細(xì)胞中提取生物材料而不損傷生物材料的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及提供能夠容易對所提取的生物材料進(jìn)行進(jìn)一步分析的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的涉及提供在相同的結(jié)構(gòu)中(優(yōu)選相同的室中)進(jìn)行生物材料的提取以及對所提取生物材料進(jìn)行后續(xù)分析的方法、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)。
通過閱讀說明書和實(shí)施例，本發(fā)明的其它目的將變得清楚。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，其中第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細(xì)胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還包括對部分暴露的液體樣品進(jìn)行分析的步驟(d)，所述部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。該分析可以例如包括遺傳分析或者蛋白質(zhì)分析。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的芯片，該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設(shè)備的流體連接；以及-第一電極和第二電極，其被安置在樣品室相對的兩側(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的設(shè)備，該設(shè)備包括-芯片位點(diǎn)，芯片位于此處以便能夠功能上與該設(shè)備相連；-設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設(shè)備實(shí)現(xiàn)進(jìn)行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-檢測芯片是否與該設(shè)備功能上相連；
-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細(xì)胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進(jìn)行分析，其中該部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括與這里所述設(shè)備功能上相連的所述芯片。


通過參考附圖將對本發(fā)明的下面一些實(shí)施方式進(jìn)行描述，其中圖1表示暴露到交替電場的持續(xù)時(shí)間對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實(shí)時(shí)PCR和熒光進(jìn)行檢測)，圖2表示長時(shí)間暴露到交替電場對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實(shí)時(shí)PCR和熒光進(jìn)行檢測)，圖3表示更長的暴露時(shí)間對目標(biāo)DNA的質(zhì)量也沒有負(fù)面影響，圖4表示交替電場的頻率對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實(shí)時(shí)PCR和熒光進(jìn)行檢測)，圖5表示交替電場的強(qiáng)度對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實(shí)時(shí)PCR和熒光進(jìn)行檢測)，表6表示芯片兩個(gè)實(shí)施方式的截面。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，其中第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細(xì)胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還包括對部分暴露的液體樣品進(jìn)行分析的步驟(d)，所述部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。該分析可以例如包括遺傳分析或者蛋白質(zhì)分析。
遺傳分析可以例如包括諸如使用限制性酶的孵化處理、諸如PCR的核酸擴(kuò)增反應(yīng)、電泳以及檢測諸如例如熒光檢測或者電化學(xué)檢測。PCR處理以及檢測可以根據(jù)例如審理中的PCT申請“用于增強(qiáng)嵌套式PCR的方法、試劑盒和系統(tǒng)(Method，kit and system for enhanced nested PCR)”(其申請?zhí)枮镹o.YYYYYYY)的方法和使用試劑盒來進(jìn)行，這里將其引入作為參考。
在發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，對其進(jìn)行進(jìn)一步遺傳分析的部分所暴露的液體樣品，包括樣品室中液體樣品的至少20％，例如樣品室中液體樣品的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中液體樣品的至少幾乎100％。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“提取”涉及釋放一種或者多種生物細(xì)胞的生物材料，也就是說例如使可以得到的生物材料進(jìn)行液體樣品的進(jìn)一步分析。術(shù)語“提取”還涉及例如將生物細(xì)胞的細(xì)胞壁或者細(xì)胞載體充分地打開和/或破碎以使生物材料溢出進(jìn)入周圍液體。在提取生物材料后，其可能仍位于生物細(xì)胞的附近或者可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到其它位置例如通過電泳力。生物材料可以例如在電泳轉(zhuǎn)運(yùn)后被吸附到電極上。
在本文中，術(shù)語“生物細(xì)胞”涉及包括例如微生物、病毒、真核細(xì)胞或其碎片的顆粒。
真核細(xì)胞可以為例如植物細(xì)胞、植物孢子、動物細(xì)胞例如哺乳動物細(xì)胞。所述哺乳動物細(xì)胞可以為例如人細(xì)胞諸如白細(xì)胞或者有核的紅細(xì)胞。
所述微生物可以是例如選自古微生物、真核細(xì)菌微生物或者真核微生物。
例如微生物可以選自由細(xì)菌、細(xì)菌孢子、病毒、真菌和真菌孢子所組成的組。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物細(xì)胞是氣生微生物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物細(xì)胞是細(xì)菌孢子。
例如，細(xì)菌孢子可以由選自芽孢桿菌屬(Bacillus)和/或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的細(xì)菌形成。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)菌孢子是由炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)所形成的孢子。生物細(xì)胞可以例如包括是由炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)所形成的細(xì)菌孢子。同時(shí)，生物細(xì)胞可以基本上由一種或者多種由炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)所形成的細(xì)菌孢子組成。
同時(shí)，生物細(xì)胞可以是無性細(xì)菌或者孢子。
從生物細(xì)胞中所提取的生物材料通常包括選自細(xì)胞器官、遺傳材料以及蛋白質(zhì)所組成的組的組分。
遺傳物質(zhì)可以例如包括染色體DNA和/或質(zhì)粒DNA和/或任何類型的RNA。
蛋白質(zhì)可以例如選自由酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、離子通道、毒素、激素以及受體所組成的組。
優(yōu)選地，生物材料包括DNA和/或RNA。
根據(jù)本發(fā)明術(shù)語“液體樣品”涉及液體物質(zhì)、溶液或者懸浮液，其可以包括或者不包括一種或者多種有關(guān)的化合物。液體樣品可以是例如生物樣品或者非生物樣品。
生物樣品可以例如為選自由皮膚拭子、腦脊液、血液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、支氣管吸出物、肺組織和尿所組成的組。
非生物樣品可以例如為一種液體懸浮液，其含有來自空氣樣品的粉末、顆粒以及來自土壤樣品和表面清掃(surface swipes)的顆粒。
可以對生物樣品或者非生物樣品進(jìn)行培養(yǎng)。接著可以使用本發(fā)明的方法、試劑盒、芯片、設(shè)備以及系統(tǒng)來評估該培養(yǎng)是否出現(xiàn)例如微生物諸如炭疽芽孢桿菌(B.Anthracis)。
另外，液體樣品可以含有一種或者多種需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增的試劑。
液體樣品可以含有一種或者多種從下列所組成組選擇的試劑引物、核酸、三磷酸脫氧核苷酸以及核酸聚合酶。
該液體樣品可能還含有添加劑例如2-巰基乙醇例如濃度為10mM、BSA例如濃度為1mg/ml和/或濃度為例如0.5％～6％(w/v)的去污劑。去污劑可以選自由下列所組成的組Triton X-100、Triton X-114、NP-40、吐溫-20、吐溫-80以及類似的非離子去污劑。
在本文中，術(shù)語“核酸”、“核酸序列”或者“核酸分子”應(yīng)當(dāng)被廣義解釋，可以例如為核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)及其模擬物的寡聚物或者多聚物。該術(shù)語包括含有自然出現(xiàn)的核苷、糖和共價(jià)核苷酸間鍵合(骨架)以及功能相似的具有非自然出現(xiàn)的核苷、糖和共價(jià)核苷酸間鍵合(骨架)的分子或其組合。這樣的被修飾和被取代的核酸可以比原始形式要優(yōu)選，因?yàn)槠淦谕男阅苤T如例如核酸目標(biāo)分子的增強(qiáng)的親和力，以及在有核酸酶和其它酶存在的情況下的提高的穩(wěn)定性，在本文中使用術(shù)語“核酸類似物”或者“核酸模擬物”來描述被修飾和被取代的核酸。核酸模擬物的優(yōu)選例子是含有肽核酸(PNA-)、鎖定核酸(Locked Nucleic Acid，LNA-)、木糖-LNA-(xylo-LNA-)、硫代磷酸、2’-甲氧基、2’-甲氧乙氧基、嗎啉和氨基磷酸酯的分子或者功能相似的核酸衍生物。
術(shù)語“核酸聚合酶”涉及依賴DNA-或者RNA-的DNA聚合酶，其優(yōu)選是熱穩(wěn)定性的，即該酶催化與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的形成，并且在對于雙鏈模板核酸的變性所必要的提高的溫度下一段時(shí)間內(nèi)不會發(fā)生不可逆的變性。通常，在每條引物的3′末端開始合成并按照5′到3′的方向沿著模板鏈進(jìn)行。已經(jīng)從嗜熱或者極端嗜熱菌株中分離了熱穩(wěn)定的聚合酶，例如Thermusflavus、T.ruber、T.thermophilus、T.aquaticus、T.lacteus、T.rubens、Thermococcus litoralis、Pyrococcus furiosus、Bacillus stearothermophilus和Methanothermus fervidus。但是盡管如此，不是熱穩(wěn)定的聚合酶也能夠用于核酸擴(kuò)增中，只要進(jìn)行補(bǔ)充該酶。
液體樣品還可以含有可以被5′-3′核酸外切酶降解的寡聚核酸探針，所述核酸探針的降解會導(dǎo)致釋放氧化還原活性組分。
氧化還原活性組分可以例如為金屬茂諸如例如二茂絡(luò)鐵。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，第一和第二電極被分開最多20mm的距離，優(yōu)選的是最多20mm，例如最多15mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm或者最多4mm，更優(yōu)選的是最多3mm，更加優(yōu)選的是最多0.5mm例如最多0.3mm、0.2mm和0.1mm例如最多0.05mm。
例如第一和第二電極可以被分開0.05-20mm范圍內(nèi)的距離，例如在0.05-0.1mm、0.1-0.2mm、0.2-0.3mm、0.3-0.4mm、0.4-0.5mm、0.5-1mm、1-2mm、2-5mm、5-10或者10-15mm的范圍內(nèi)，例如15-20mm的范圍內(nèi)。
通常第一和第二電極被分開至少0.02mm的距離，例如至少0.03mm或者0.05mm。
通常至少部分樣品室中的液體樣品被置于第一電極和第二電極之間。例如，至少液體樣品體積的40％被置于第一電極和第二電極之間，例如，至少液體樣品體積的50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％被置于第一電極和第二電極之間，例如至少液體樣品體積的100％被置于第一電極和第二電極之間。
優(yōu)選的是，在步驟(c)的過程中將生物細(xì)胞安置在第一電極和第二電極之間。甚至可以至少在步驟(c)的開始并可能在步驟(c)的過程中，將生物細(xì)胞附著在第一電極或者第二電極上。
本文在“X和/或Y”中所使用術(shù)語“和/或”應(yīng)當(dāng)被解釋為“X”或“Y”或“X和Y”。
本發(fā)明的芯片包括帶有第一開口的樣品室。
第一開口可以用于將樣品倒入樣品室中。第一開口可以與樣品(例如周圍空氣)以流體連接?？梢赃x擇的是，第一開口被連接到一個(gè)或者多個(gè)閥門上，這些閥門可以被打開以將樣品室與樣品流體相連。
在本發(fā)明重要的實(shí)施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)帶有第二開口。第二開口可以例如用于通過將樣品室的空氣或者樣品排出而輔助將新樣品導(dǎo)入樣品室中。第二開口也可以用于將第一液體試劑導(dǎo)入樣品室中?？梢蕴鎿Q的是，第一液體可以通過第一開口進(jìn)入樣品室。
樣品室(例如芯片的樣品室)通常是微量樣品室。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，樣品室的體積為最多500μL，例如最多400μL、300μL、200μL、100μL、50μL、25μL、15μL、10μL、5μL、4μL、3μL或者最多2μL，例如最多1μL。例如樣品室的體積可以為最多500nL，例如最多400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、15nL、10nL、5nL、4nL、3nL或者最多2nL，例如最多1nL。
通常，樣品室的體積為至少10nL。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品室的體積在1μL-50μL的范圍內(nèi)，例如5μL-30μL。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，一對相對的壁之間的最小距離為最多20mm，例如最多15mm、10mm、8mm、6mm、4mm、3mm或者2mm，例如最多1mm。例如，一對相對的壁之間的最小距離為最多800μm，例如最多600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、50μm、25μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm或者最多2μm例如最多1μm。
通常，一對相對的壁之間的最小距離為至少5μm。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，一對相對的壁之間的最小距離在50μm-500μm的范圍內(nèi)，例如100μm-400μm和150μm-350μm。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的長度在1mm～50mm的范圍內(nèi)，例如在1mm-10mm、10mm-20mm、20mm-30mm、30mm-40mm或者40mm-50mm的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品室的長度在2mm-8mm、例如3mm-7mm或者4mm-6mm的范圍內(nèi)。例如樣品室的長度為大約4.5mm。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的寬度在0.2mm-10mm的范圍內(nèi)，例如在0.2mm-1mm、1mm-3mm、3mm-5mm、5mm-7mm或者7mm-10mm的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品室的寬度在0.2mm-2mm的范圍內(nèi)，例如在0.5mm-1.5mm和0.75mm-1.25mm的范圍內(nèi)。例如樣品室的寬度可以為大約1mm。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的高度在50μm-2mm的范圍內(nèi)，例如在100μm-1mm、200μm-900μm、300μm-800μm、500μm-700μm的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，樣品室的高度在100μm-400μm的范圍內(nèi)，例如200μm-300μm的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，樣品室例如芯片的樣品室的長度度為大約4.5mm，樣品室的寬度為大約1mm，樣品室的高度為300μm。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，芯片還包括第一和第二電極。
第一和/或第二電極可以具有不同的外形或者尺寸。例如，第一和/或第二電極可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀、棒狀或其任意組合中所選擇的實(shí)質(zhì)的形狀。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一電極和第二電極可以例如為薄片電極。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一電極和第二電極相對。例如它們可以被安置在樣品室的對邊上。
第一電極和/或第二電極可以例如被安置在樣品室的內(nèi)部，不貼著樣品室或者附著到樣品室的一個(gè)或者多個(gè)壁上。
第一和/或第二電極可以植入樣品室的壁中。例如，第一和第二電極可以植入樣品室中的壁中。可以選擇的是，第一和/或者第二電極可以被安置在芯片的外表面中。
優(yōu)選的是，第一電極和第二電極安置在樣品室相對的兩邊。
第一電極和第二電極之間的電勢差可在一個(gè)范圍內(nèi)，該范圍引起相同或不同尺寸的顆粒被捕獲至一個(gè)表面或偏離某個(gè)給定的方向，這樣可以提供選擇或捕獲感興趣的粒子。
電極，如第一電極和/或第二電極可以由許多種不同的材料構(gòu)成。典型地，電極是由金屬或合金構(gòu)成。第一電極和第二電極可以例如包含從由下列金屬所組成的組中選擇的金屬銀、金、鉑、銅、碳、鐵、石墨、鉻、鎳、鈷、鈦、水銀或者其合金。
也可以預(yù)想到，電極可包含一種導(dǎo)電的液體，甚至基本上由一種導(dǎo)電的液體組成。導(dǎo)電的液體可以是例如水銀。
電極的尺寸或/和結(jié)構(gòu)通常依賴于樣品室的尺寸和/或結(jié)構(gòu)。電極的長度和寬度與樣品室的長度和寬度具有相同的數(shù)量級。
電極可以由小至幾個(gè)原子層的表面的導(dǎo)電材料構(gòu)成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，電極如第一和/或第二電極具有在0.001μm-2000μm范圍內(nèi)的厚度，如0.001μm-1μm、1μm-20μm、20μm-200μm和200μm-2000μm。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，芯片的樣品室還包括一組檢測電極如兩個(gè)或者三個(gè)檢測電極，用于檢測氧化還原活性組分的出現(xiàn)或者缺失，該氧化還原活性組分可以是如從探針中釋放出來的。兩個(gè)檢測電極可分別作為工作電極和反電極。該組檢測電極還可以包括一個(gè)參比電極。通常，檢測電極是由金屬或合金構(gòu)成。電極可以如包括從有下列所組成的組中選擇的材料碳、銀、金或鉑。檢測以后，在電極表面會有膜形成。為了允許進(jìn)一步檢測所消化的探針，可以在芯片的樣品室內(nèi)安置更多組檢測電極。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，第一電極和第二電極可以是檢測電極組。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，芯片還包括一種溫度敏感元件，其例如可以是溫度敏感的金屬基的電阻器(電熱調(diào)節(jié)器)，具有正溫度系數(shù)(PTC)，即隨著環(huán)境溫度的增加，電熱調(diào)節(jié)器表現(xiàn)出電阻增加；隨著環(huán)境溫度的降低，電熱調(diào)節(jié)器的電阻減小。
電熱調(diào)節(jié)器可以是例如從包含下列材料的組中選出的銅、鎳、鐵、鋁、鉑或其合金。
電熱調(diào)節(jié)器可以有不同的形狀或維度，例如，電熱調(diào)節(jié)器可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀的組中選擇的實(shí)質(zhì)形狀。
電熱調(diào)節(jié)器可以是例如線狀的電極。
加熱電極可以有不同的形狀或者尺寸，例如，加熱電極可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀的組中選擇的實(shí)質(zhì)形狀。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，加熱電極可以是例如薄片狀電極。本發(fā)明中優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，加熱電極可以被安置成能夠從反應(yīng)室的至少一邊進(jìn)行加熱。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或者多個(gè)補(bǔ)充的加熱電極可以被安置在反應(yīng)室的對邊上。
加熱電極由電導(dǎo)材料制成，優(yōu)選為從鎳鉻合金(NiCr)、鐵鉻鋁合金(FeCrAl)、鐵鎳鉻合金(FeNiCr)或者其它加熱元素合金的組中選取的材料。
本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，芯片包括一個(gè)或者多個(gè)導(dǎo)電接觸襯墊，該襯墊與芯片的電極電接觸。芯片可包括與芯片的第一電極電接觸的導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括與芯片的第二電極電接觸的導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括與加熱電極的每個(gè)末端電接觸的兩個(gè)導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括兩個(gè)或三個(gè)導(dǎo)電接觸襯墊，并且與該組檢測電極的每個(gè)電極電接觸。
在圖1中，表示了兩個(gè)代表性的芯片實(shí)施方式。在圖1A)中，芯片(1)包含樣品室(2)、第一電極(3)和第二電極(4)。第一電極(3)附著到芯片的上部(5)，第二電極(4)附著到在芯片的下部(6)。第一電極和第二電極都被電絕緣層(7)覆蓋，以防止樣品室(2)中的液體成分的不必要電解。加熱電極被植入第二電極頂部的絕緣層。通過間隔部分(9)形成樣品室，間隔部分被夾在芯片(1)的第一部分(5)和第二部分(6)的中間。檢測電極和溫度敏感元件在圖1中沒有被示出。
芯片可以含有大批不同的材料?？梢岳绨ㄓ袡C(jī)聚合物如塑料，金屬和半導(dǎo)體(如硅、玻璃和陶瓷)等。
關(guān)于圖1，第一部分和第二部分可能如包括諸如塑膠、半導(dǎo)體(如硅、玻璃和陶瓷)的材料。第一電極和第二電極可以例如含有金屬如金或銅。絕緣層可以例如是二氧化硅或聚酰亞胺的薄膜。加熱電極可以例如是NiCr電極，間隔層可以例如是聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性體的鑄件。
圖1B)中，第一電極和第二電極并不被包括在芯片里，但可以如包括在操作芯片的設(shè)備中。
芯片可以僅包括單一的樣品室或者它可以包括多個(gè)樣品室。
芯片通常具有在0.5mm-50mm范圍內(nèi)的厚度，優(yōu)選在2mm-8mm的范圍內(nèi)。
芯片通常具有在10mm-500mm范圍內(nèi)的長度或者直徑，優(yōu)選在40mm-200mm的范圍內(nèi)。
芯片通常具有在5mm-200mm范圍內(nèi)的寬度，優(yōu)選在20mm-100mm的范圍內(nèi)。
在步驟c)中，液體樣品被暴露到交替電場下，其由第一電極和第二電極提供。重要的是交替電場具有充分的強(qiáng)度并被施加充分的持續(xù)時(shí)間以從生物細(xì)胞中提取生物材料。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“交替電場”涉及隨時(shí)間變化的電場。交替電場可以例如為通過在正/負(fù)以及負(fù)/正之間周期性地改變兩個(gè)電極極性而出現(xiàn)的電場，例如通過將交流電源連接到電極上。交替電場可以例如包括或者是交流電場。交替電場可以例如包括一個(gè)或者多個(gè)直流脈沖。
重要的是交替電場具有充分的強(qiáng)度并被施加充分的持續(xù)時(shí)間以提取生物材料。同時(shí)重要的是交替電場還具有充分的頻率以提取生物材料。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，交替電場的頻率為至少5kHz，優(yōu)選為至少20kHz，更優(yōu)選為至少50kHz。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，交替電場的頻率為至少100kHz，例如至少250kHz，更優(yōu)選為至少500kHz。
例如交替電場的頻率可以為至少5kHz，例如至少10kHz、20kHz、50kHz、100kHz、200kHz、300kHz或者400kHz，例如至少500kHz。也能夠預(yù)想到更高的頻率例如1000kHz、2000kHz或者5000kHz。
交替電場的頻率優(yōu)選為最多750kHz，例如最多500kHz。
這樣，交替電場的頻率可以例如在5-750kHz的范圍內(nèi)，例如在5-10kHz、10-20kHz、20-50kHz、50-100kHz、100-200kHz、200-300kHz、300-400kHz、400-500kHz的范圍內(nèi)，例如在500-750kHz的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過調(diào)節(jié)兩個(gè)電極的極性來提供交替電場。
交替電場可以具有從由下列所組成的組中選擇的實(shí)質(zhì)形式矩形、正弦、鋸齒、不對稱三角形、對稱三角形或者其任何組合。
同時(shí)，頻域中的交替電場可以至少含有第一頻率分量和第二頻率分量。
交替電場的強(qiáng)度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差通常為最多30V，例如最多25V、20V、15V、10V、8V、6V、5V、4V、3V或2V例如最多1V。
交替電場的強(qiáng)度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差可以例如在1-100V的范圍內(nèi)，例如在1-2V、2-3V、3-4V、4-5V、5-6V、6-8V、8-10V、10-15V、15-20V或者20-30V的范圍內(nèi)，例如在30-100V的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，第一電極和第二電極之間的最大電勢差在5-50V的范圍內(nèi)，例如10-25V。
對生物材料提取產(chǎn)量的可用性測試是DNA/RNA釋放百分率?！癉NA/RNA釋放百分率”是樣品室中由于在步驟c)中暴露到交替電場中而釋放其染色體DNA和/或染色體RNA的生物細(xì)胞的百分率。DNA/RNA釋放百分率是根據(jù)實(shí)施例5中所描述的標(biāo)準(zhǔn)化的方法確定的。
在樣品室或者帶有樣品室的芯片中的生物細(xì)胞的提取百分率或者DNA/RNA釋放百分率強(qiáng)烈依賴于第一電極和第二電極的設(shè)計(jì)和之間的距離、樣品室的結(jié)構(gòu)和材料以及施加到第一電極和第二電極上的電勢。
在本發(fā)明高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進(jìn)而第一電極和第二電極之間的交替電場進(jìn)行調(diào)節(jié)以得到至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選為至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如大約100％。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進(jìn)而第一電極和第二電極之間的交替電場進(jìn)行調(diào)節(jié)以得到樣品室中細(xì)菌孢子的至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如樣品室中細(xì)菌孢子的至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選為樣品室中細(xì)菌孢子的至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中細(xì)菌孢子的大約100％。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將液體樣品暴露到交替電場中的持續(xù)時(shí)間最多為3600秒，例如最多3000秒、2000秒、1000秒、500秒、250秒、100秒、50秒、40秒、30秒、20秒、10秒、5秒、4秒或者3秒，例如最多1秒。
例如，將液體樣品暴露到交替電場中的持續(xù)時(shí)間為0.01-3600秒的范圍內(nèi)，例如在0.1-1秒、1-5秒、5-10秒、10-25秒、25-50秒、50-100秒、100-250秒、250-500秒、500-1000秒或者1000-2000秒的范圍內(nèi)，例如在2000-3600秒的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，將液體樣品暴露到交替電場中的持續(xù)時(shí)間為5-100秒的范圍內(nèi)，例如6-90秒、7-80秒、8-70秒、9-60秒和10-50秒的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，液體樣品被暴露到交替電場中最多250秒，優(yōu)選為最多100秒，例如最多30秒。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的芯片，其中該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設(shè)備的流體連接；-第一電極和第二電極，其被安置為在樣品室相對的兩側(cè)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，芯片的樣品室還包括含有生物細(xì)胞的液體樣品。
該芯片還包括通過第一電極和第二電極提供的在第一電極和第二電極之間的交替電場，所述交替電場具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，芯片的第一電極和第二電極被安置在樣品室的第一開口和第二開口之間。
生物細(xì)胞優(yōu)選位于芯片的第一電極和第二電極之間。
需要注意的是在本發(fā)明一個(gè)方面中所描述的實(shí)施方式和特征也可以用于本發(fā)明的其他方面。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的設(shè)備，該設(shè)備包括-芯片位點(diǎn)，芯片位于此處以便能夠功能上與該設(shè)備相連；-設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設(shè)備實(shí)現(xiàn)進(jìn)行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-檢測芯片是否與該設(shè)備功能上相連；-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細(xì)胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進(jìn)行分析，其中該部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。
在本發(fā)明中，術(shù)語“功能上相連”的意思是指該芯片與該設(shè)備相連接，因此該設(shè)備可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)影響該芯片的行為。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)該設(shè)備能影響樣品室中成分的電場時(shí)，該芯片是與該設(shè)備功能上相連。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)該設(shè)備能控制該芯片至少一個(gè)電極的電勢時(shí)，該芯片是與該設(shè)備功能上相連。例如，當(dāng)該設(shè)備能控制第一電極和/或第二電極的電勢時(shí)，該芯片是與該設(shè)備功能上相連。
功能上相連還可以包括該芯片的樣品室用流體控制裝置以流體相連。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該設(shè)備包括一組收集電極，并且當(dāng)電極與該組收集電極之間的電場功能上相連時(shí)，會輔助在樣品室中收集氣體樣品的生物細(xì)胞。在這個(gè)實(shí)施方式中，芯片不必包括該組收集電極。
該設(shè)備也可以包括一個(gè)接受和/或儲藏第一液體試劑的第一試劑室。通常，第一試劑室有至少一個(gè)開口，當(dāng)芯片與設(shè)備功能性相連時(shí)，該開口與樣品室流體連接?？梢蕴鎿Q的是，第一試劑室的至少一個(gè)開口與樣品室是流體連接，如通過使用控制流體的裝置。在貯存期間，可以通過一個(gè)可移動的障礙物來關(guān)閉第一試劑室。當(dāng)使用該設(shè)備時(shí)，所述的障礙物被可逆或者不可逆地移開。
該設(shè)備還可以包括一個(gè)用于提供能量的電能供應(yīng)器，如產(chǎn)生流動的裝置、和/或給可編程的單元、第一電極和第二電極。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，芯片是通過芯片位點(diǎn)與該設(shè)備功能上相連的。芯片位點(diǎn)可以例如包括一個(gè)塑料界面，該塑料界面既可以當(dāng)作連接材料，也可以當(dāng)作襯墊，該襯墊保證芯片口和裝置口緊密連接，以消除漏氣和漏液現(xiàn)象。芯片位點(diǎn)可以如包括表面和/或接受芯片的支架。通常，芯片位點(diǎn)包括至少一個(gè)導(dǎo)電的接觸襯墊。優(yōu)選的是，芯片位點(diǎn)包括至少一個(gè)導(dǎo)電的接觸襯墊，該接觸襯墊提供與芯片第一電極的電接觸，和提供與第二電極的電接觸。
可編程的單元包含指令，優(yōu)選計(jì)算機(jī)可以讀取的，如可適合利于控制、監(jiān)視的軟件，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控設(shè)備的軟件。
可編程單元優(yōu)選包括至少一個(gè)在所連接的存儲設(shè)備上儲存了一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)，該計(jì)算機(jī)可適合用于控制該設(shè)備。本發(fā)明中的可編程單元可以是從以下非詳盡組中選擇通用計(jì)算機(jī)、個(gè)人計(jì)算機(jī)(PC)、可編程的邏輯控制單元(PLC)、軟程序的邏輯控制單元(soft-PLC)、硬程序邏輯控制單元(hard-PLC)、工業(yè)個(gè)人計(jì)算機(jī)或一個(gè)專用的微處理器。
本發(fā)明也涉及計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，該產(chǎn)品適合使具有至少一個(gè)在其連接的存儲設(shè)備上儲存了計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)能控制、監(jiān)視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控該設(shè)備。本發(fā)明還涉及一種計(jì)算機(jī)可讀取的存儲了一套工藝路線的媒介，該套工藝路線適應(yīng)性使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)能控制、監(jiān)視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控該設(shè)備，該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括至少一個(gè)在其連接的存儲設(shè)備上儲存了計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)。
在操作之前、在操作中和/或在操作后，用于控制、監(jiān)控和/或調(diào)控該設(shè)備的程序單元，優(yōu)選能適應(yīng)在惡劣的條件下操作，如北方氣候、熱帶氣候和戰(zhàn)斗環(huán)境，特別是，遭受原子、生物和/或化學(xué)戰(zhàn)(ABC-戰(zhàn)爭)攻擊的戰(zhàn)斗地區(qū)。優(yōu)選的是，可編程的單元應(yīng)遵照該單元的相關(guān)軍事說明書。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可編程的單元包括軟件，如果芯片與設(shè)備功能上相連的話，該軟件還可實(shí)現(xiàn)設(shè)備檢查。
可編程的單元包括能夠進(jìn)一步使該設(shè)備完成一種或者更多種行為的軟件，例如從由下列所組成的組中選擇的2或3個(gè)行為-提供樣品室中的液體樣品；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料；-對所暴露的液體樣品的生物材料進(jìn)行分析。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操作用于提供氣體樣品的流動產(chǎn)生裝置，設(shè)備提供樣品室中的氣體樣品。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即設(shè)備對第一電極施加第一電勢，對第二電極施加第二電勢。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過調(diào)節(jié)至少兩個(gè)電極的電勢(例如這里所述的第一電極和第二電極或者交替電場專用的其他電極組)，設(shè)備將反應(yīng)混合物暴露到所述樣品室的交替電場中。
可編程的單元包括包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操縱這里所述的加熱電極，設(shè)備進(jìn)行目標(biāo)核酸序列的核酸擴(kuò)增。
可編程的單元包括包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操縱涉及差值脈沖伏安法的檢測電極，設(shè)備檢測是否出現(xiàn)了所擴(kuò)增的目標(biāo)核酸序列和/或檢測來自目標(biāo)核酸序列擴(kuò)增的產(chǎn)物。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，該設(shè)備還包括設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的第一和電極之間施加交替電場。
裝置另外可測量參比信號，即來自于包括沒有生物細(xì)胞的樣品或包括確定量的給定生物細(xì)胞的樣品的信號。該參比信號可以例如被從距樣品室較遠(yuǎn)的另一個(gè)室中得到，例如位于芯片另一個(gè)位置的室或者位于另一個(gè)芯片的室。
裝置還可以包括一個(gè)內(nèi)部的能量供應(yīng)。
內(nèi)部的能量供應(yīng)可以例如包括電池。在PCR反應(yīng)期間使用的能量，可以根據(jù)加熱一定體積的水所需熱量來估計(jì)，該體積的水應(yīng)等同于在PCR循環(huán)中最小和最大溫度之間的流體樣品的量。溫度的差別大約為50K，因此對于30μl的樣品，每個(gè)循環(huán)的轉(zhuǎn)移的熱量大約為6焦耳。例如運(yùn)行60個(gè)循環(huán)，一個(gè)PCR反應(yīng)的總能量消耗達(dá)到60×6＝360焦耳。使用與商業(yè)熱循環(huán)器(即每秒2℃)相差不大的等變率(ramping time)，能量需要量為360×2/50＝14.4W。
電池電壓被認(rèn)為是電池的定額電壓，如每個(gè)鎳-鉻(NiCr)和鎳-金屬氫(NiMH)電池電壓為1.2伏，每個(gè)鋰離子(Li離子)電池電壓為3.6伏。電池的蓄電量通常以毫安-小時(shí)(mAh)為單位，并且稱為電池的C-定額(C-rating)。例如，一個(gè)具有C-定額1200mA-小時(shí)的電池的負(fù)載電流1C，就是指1200毫安。當(dāng)電池電量耗盡至負(fù)載電流低于0.1C時(shí)(Linden D.1984，電池和燃料電池手冊，紐約McGraw-Hill)，一個(gè)電池可以看作是理想的(即保持固定的電容量)。因而，當(dāng)釋放出14.4W的能量如用一個(gè)電池釋放10.8V時(shí)，該電池的C-定額應(yīng)該在14.4/(10.8*0.1)＝13300mAh范圍，以避免劇烈減小電池容量的峰值電量消耗。
為了使能量消耗和電量釋放，以及進(jìn)一步確保真正的可攜帶，可充電池是優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可充電池可以從由下列所組成的組中選擇鎳金屬氫(NiMH)類電池和鋰離子(Li離子)類電池。
同時(shí)，內(nèi)部的電量供應(yīng)可以包括發(fā)電機(jī)例如可攜帶的發(fā)電機(jī)?？蓴y帶的發(fā)電機(jī)可以用作外部的能量供應(yīng)?？蓴y帶的發(fā)電機(jī)可以是日光模塊、電池充電器(例如交流或者汽車電池充電器)、燃料燃燒發(fā)電機(jī)等進(jìn)行充電或者只是由其所組成。
可以替換的是，來自外部能量供應(yīng)的電能可被提供到該設(shè)備，例如使用備用電池進(jìn)行補(bǔ)充。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，設(shè)備還包括一個(gè)流動產(chǎn)生裝置，如為提供芯片樣品室中的氣體樣品，和當(dāng)芯片插入設(shè)備中時(shí)，與樣品室的第二開口流體連接。
流動產(chǎn)生裝置可包括泵，如活塞泵、膜泵或者正排量泵。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在選擇加樣(在10ml/min-500ml/min的范圍內(nèi))的過程中，泵能夠釋放適量的氣流通過芯片。優(yōu)選的是，泵應(yīng)該按照以下一個(gè)或者多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來選擇尺寸小、重量輕、沒有脈沖流動、通過改變馬達(dá)的極性使媒介可逆流動、通過控制電壓可調(diào)節(jié)流量。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，流動產(chǎn)生裝置可以包括用于制造小滴試劑的噴射分配器，或者是類似的微分配設(shè)備。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，能夠以通過芯片的被動流提供氣體樣品。這將要求在芯片和作為樣品的周圍氣體之間的一個(gè)流速差。例如芯片可以被移動通過空氣，如按第一開口與周圍空氣是流動相連的方式安裝在飛機(jī)上，最佳的是與飛行方向相反?？梢蕴鎿Q的是，如果空氣在芯片周圍移動，芯片與空氣相比沒有速度，如安置在出氣口，會發(fā)生這種情況。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，設(shè)備還包括用于控制的裝置，如通過樣品室的流動。
流動可以是，如液體流動或者氣體流動。
控制流動的裝置通常包括一個(gè)或者是多個(gè)閥。閥可以是，如從由下列所組成的組中選擇單向閥、兩路閥、多位置閥和夾管閥。
閥可以是例如微型組裝的閥，在實(shí)施方式中閥被集成在芯片上。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，第一試劑液體能夠使用噴墨微分配工藝進(jìn)行釋放。噴墨色帶盒含有一個(gè)或多個(gè)隔間，隔間里包含有第一液體試劑或者第一液體試劑的分開組分，噴墨色帶盒以這樣一種方式安裝，該種方式能使液體微分配到反應(yīng)室中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，將第一液體試劑或者其分開的各個(gè)組分裝入塑料聚合物組成的密封的封套。塑料聚合物封套配置有一個(gè)內(nèi)置的加熱電極，可以通過使用適當(dāng)?shù)碾娏魇顾芰暇酆衔锶诨?，接著將封套里的液體釋放到芯片中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，從密封的塑料聚合物封套中釋放液體，能夠通過機(jī)械的或者物理方式破裂封套如用尖的東西刺破來進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)備可以裝備一個(gè)視覺上讀出結(jié)果的顯示器，顯示器可以是光發(fā)射源形式的(LED，燈泡或者類似物)、顯示屏、數(shù)字的讀取器或者是上述的任何組合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，讀取器可以以聲音信號來交流。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，設(shè)備包括可以允許無線通訊的組件。無線通訊的例子是802.11移動無線局域網(wǎng)，蜂窩通訊、藍(lán)牙(Bluetooth)、全球定位系統(tǒng)(GPS)、和超寬頻帶。通訊可以是單向的如從設(shè)備傳輸數(shù)據(jù)或者是給設(shè)備傳輸數(shù)據(jù)，或者是通訊可以是組合的如雙向的。建立的通訊可進(jìn)一步擴(kuò)展為互聯(lián)網(wǎng)和設(shè)備之間的通訊，如建立一個(gè)ad-hoc網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)可以使一個(gè)設(shè)備觸發(fā)另一個(gè)設(shè)備的樣品，因此有利于監(jiān)控如氣霧云的進(jìn)程。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，設(shè)備為重量輕和/或可攜帶的設(shè)備。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，設(shè)備重量至多10kg，如至多8kg、6kg、4kg、3kg或2kg，如至多1kg。甚至更為優(yōu)選的設(shè)備的重量至多800g、如至多600g、500g、400g、300g、200g、150g、100g、80g、60g、50g、40g、30g、20g、10g或5g，如至多1g。
通常，設(shè)備總重量在20g-1kg的范圍，如20g-50g、50g-100g、100g-250g、250g-500g或500g-1000g。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括與這里所述設(shè)備功能上相連的所述芯片。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的芯片和設(shè)備被集成在一起，并且不意味著互相物理上分開。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的芯片和設(shè)備被集成在一起以便他們不能夠被相互物理上分開而不損壞芯片或者設(shè)備。
在本發(fā)明重要的實(shí)施方式中，該設(shè)備是一次性系統(tǒng)例如只能使用一次。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，系統(tǒng)的芯片是一次性的，但是該設(shè)備可以被重復(fù)使用。
在本發(fā)明另一個(gè)重要的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的芯片是一次性的，但是該設(shè)備可以被重復(fù)使用。
本發(fā)明特定的方面涉及方法和微結(jié)構(gòu)，其簡化了從來自芽孢桿菌屬(Bacillus)群細(xì)菌的內(nèi)生孢子提取DNA的方法。
本發(fā)明的目的是從高度機(jī)械、化學(xué)、熱抗性的革蘭氏陽性菌(包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis))的內(nèi)生孢子中快速提取DNA，以能夠進(jìn)行快速DNA檢測。
該目的是通過包括對孢子結(jié)合使用脈沖電場的方法和結(jié)構(gòu)而獲得的，所述用法包括被植入電場之間或者與電場相鄰的含有孢子溶液的流體結(jié)構(gòu)，所述電場可以以一定頻率和強(qiáng)度變換并施加可變的時(shí)間，以及一組用于所述用法的最佳參數(shù)設(shè)置。
本發(fā)明描述了一種方法，其能夠?qū)墟咦拥娜芤菏┘用}沖電場。所述方法的結(jié)果是在開始所述方法5秒鐘的時(shí)間內(nèi)釋放出DNA。
在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于快速從孢子提取DNA的方法，其利用兩個(gè)電極結(jié)構(gòu)以及插入的含有內(nèi)生孢子的溶液。所述電極被連接到電壓源和頻率發(fā)生器，這使得在溶液上可以誘導(dǎo)產(chǎn)生脈沖電場。
在另外特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明利用微流體設(shè)備，該設(shè)備能夠進(jìn)行與上面相同的功能，并能夠被集成為用于快速提取DNA的樣品制備系統(tǒng)的一部分。
在本發(fā)明再一個(gè)特定的實(shí)施方式中，作為應(yīng)用所述方法的結(jié)果，在通過后續(xù)的進(jìn)行PCR或者視覺觀察DNA的質(zhì)量(在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和染色之后)，所釋放DNA的質(zhì)量不受影響。
在使用兩個(gè)電極結(jié)構(gòu)以對細(xì)胞或者孢子溶液施加電穿孔電壓的微結(jié)構(gòu)中，關(guān)于在溶液中實(shí)際出現(xiàn)的所施加電勢的量是特別重要的。由于這一點(diǎn)，在電極-溶液界面上的壓降與所施加的電壓相比是顯著的。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，公知的是在實(shí)驗(yàn)中所使用的溶液對勢能隨時(shí)間的斜率設(shè)定了限制。例如低施加電壓(＜2V)導(dǎo)致在電極中有非常小的電壓斜率，即使在長脈沖時(shí)間內(nèi)(＞100μs)，這產(chǎn)生了峰狀的斜率。在溶液中所施加電壓的最大強(qiáng)度可以通過繪制設(shè)備提高時(shí)間和充電時(shí)間的指數(shù)函數(shù)來計(jì)算。例如，8μs的設(shè)備提高時(shí)間和20-40μs范圍內(nèi)的充電時(shí)間會提供最大15-18％的所施加強(qiáng)度。在應(yīng)用脈沖后的約10-15μs后達(dá)到最大值。50-75μs后，壓降有效地為零，因?yàn)樗兴┘拥碾妷撼霈F(xiàn)在電極-溶液界面。在更高的電壓下，界面的阻抗會成為不可忽視的，并且在電極之間通過的電流受到溶液電導(dǎo)系數(shù)的限制。
通常發(fā)現(xiàn)距離大于10μm的100mM KCl溶液的電阻在30±3kΩ的范圍內(nèi)。
孢子的表層由蛋白質(zhì)組成，其為整個(gè)孢子結(jié)構(gòu)提供機(jī)械保護(hù)。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)具有由一種蛋白質(zhì)組成的孢子表層，而枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在表層中已經(jīng)被鑒定出了20種以上的蛋白質(zhì)。而且，表層是功能性分子篩，其保護(hù)孢子內(nèi)部免受除最小的分子外的全部的影響，盡管該孢子表層與對鹵素(如氯和碘)的抗性相關(guān)。表層還參與發(fā)育，已經(jīng)表明孢子中帶有突變的孢子表層也會大部分在發(fā)育方面有缺陷。
在芽孢桿菌(Bacillus)類的無性細(xì)胞中，細(xì)胞壁肽聚糖由通過β-1，4連接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)組成。肽鏈(開始為L-丙氨酸-D-谷氨酸酯-內(nèi)消旋-二胺基庚二酸[Dpm]-D-丙氨酸-D-丙氨酸)附著到NAM殘基上；在無性細(xì)胞中全部PG的大約35％參與交聯(lián)。與無性細(xì)胞PG(其表現(xiàn)出與芽孢桿菌(Bacillus)種類之間顯著的不同)相反，皮質(zhì)PG結(jié)構(gòu)的基本特征在全部種類中是相似的。皮質(zhì)PG的結(jié)構(gòu)在兩個(gè)主要方面與無性細(xì)胞PG有區(qū)別。
1.位于皮質(zhì)的大約50％的NAM殘基作為胞壁酸-ρ-內(nèi)酯出現(xiàn)，其中大部分MAL殘基被多糖鏈中的每兩個(gè)胞壁酸位置隔開。
2.大約25％的NAM殘基只帶有一個(gè)L-丙氨酸，并且由于MAL殘基不帶有肽側(cè)鏈，因此與生長中的細(xì)胞相比，只能有1/4的Dpm殘基用于參與孢子皮質(zhì)中交聯(lián)的形成。結(jié)果是，孢子PG比無性細(xì)胞中的交聯(lián)要少得多。然而，孢子皮質(zhì)中確切的分子排布是未知的。已經(jīng)顯示孢子皮質(zhì)參與到孢子的滲透性吸水和孢子的收縮。
作為所施加和交替電勢的結(jié)果，由于在電極上的氧化反應(yīng)或者還原反應(yīng)，會出現(xiàn)DNA核苷酸堿基的化學(xué)變化。這可能會導(dǎo)致通過熱穩(wěn)定的DNA聚合酶在后續(xù)的DNA擴(kuò)增、產(chǎn)生降低的擴(kuò)增效率或者核苷酸的錯誤插入的差的核苷酸識別。
因此，本發(fā)明的特定方面涉及通過采用高頻率交替電場使細(xì)胞內(nèi)組分可以從孢子得到的方法。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法可以例如針對提取DNA和/或純化DNA。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法也可以針對用于DNA檢測，例如在診斷分析中。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法可以例如針對PCR中的應(yīng)用，例如用于集成的PCR設(shè)備。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法可以例如針對用于可移動的PCR設(shè)備或者生物戰(zhàn)劑檢測。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法可以例如針對細(xì)菌孢子。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對來自革蘭氏陽性菌的孢子。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對來自芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的孢子。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對來自蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)群的孢子。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)類的孢子在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對檢測原核細(xì)胞。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對從細(xì)菌細(xì)胞中釋放DNA。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對熱抗性細(xì)菌細(xì)胞。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對嗜熱或者極端嗜熱細(xì)菌。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法針對通過PCR檢測熱抗性細(xì)菌。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對檢測熱裂解抗性細(xì)菌。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對分枝桿菌(Mycobacteria)的應(yīng)用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對真核細(xì)胞的應(yīng)用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，這里所描述的方法針對哺乳動物細(xì)胞的應(yīng)用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法用于人類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或者病毒。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法用于毛細(xì)管設(shè)計(jì)，其中細(xì)胞或者孢子懸浮液含在兩個(gè)或者多個(gè)電極表面之間。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，所述裂解是通過應(yīng)用高頻率交替電場所誘導(dǎo)的。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，對高頻率交替電場所施加的頻率在8000-200,000Hz的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，在1和60秒之間的脈沖順序施加交替電場。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法包括應(yīng)用脈沖之間的短暫間隔。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，所施加的電壓在6-40V之間。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，將該方法用于懸浮在去離子水中的細(xì)胞或者孢子。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞或者孢子被懸浮在PCR緩沖液配方中。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法與捕獲設(shè)備結(jié)合使用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法與孢子捕獲設(shè)備結(jié)合使用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法與細(xì)胞捕獲設(shè)備結(jié)合使用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，該方法與靜電捕獲設(shè)備結(jié)合使用。
在本發(fā)明特定的實(shí)施方式中，靜電捕獲設(shè)備是集成的孢子捕獲和裂解設(shè)備的一部分。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)不用于電穿孔和/或生物細(xì)胞的融合。
需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明的一個(gè)方面中所描述的實(shí)施方式和特征也可以用于本發(fā)明的其它方面。
實(shí)施例實(shí)施例1通過應(yīng)用交替電勢檢測DNA質(zhì)量使用含有緩沖液、dNTP的和Taq聚合酶集成溶液的TaqMan UniversalPCR Master Mix系統(tǒng)(Applied Biosystems)，在Opticon DNA設(shè)備(MJ research)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。以900nM的最終濃度加入兩條引物269-16-23間隔子1 5’-TAT GAG CTA CAC TGT TAT CTA GTT TTC AAA GAA-3’(SEQID NO 1)和270-16-23間隔子2 5’-TTT CCG TGT TTC GTT TTG TTCAG-3’(SEQ ID NO 2)，和以100mM的濃度加入熒光TAQMAN探針(FAM-ACT TCT CTC ATA TAT AAA TGT-MGB-NFQ)(SEQ ID NO 3)，其全部針對擴(kuò)增蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurgiensis)16S和23S tRNA基因的基因間隔子。標(biāo)準(zhǔn)PCR使用15μl樣品體積，并通過在95℃下孵育15分鐘活化Taq聚合酶以開始PCR。接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的兩步PCR反應(yīng)94℃下解鏈15秒以及60℃下退火和延伸結(jié)合的步驟60秒。在每個(gè)循環(huán)的最后，在線檢測熒光以分析PCR產(chǎn)物的形成。
使用Boe等人的方法(Boe等人1989)從2ml(大約109個(gè)細(xì)胞/ml)過夜培養(yǎng)的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurgiensis)亞種kurstaki分離染色體DNA。將所純化的DNA溶解在75μl TE緩沖液中，即進(jìn)行10-6稀釋，其應(yīng)該含有來自大約27個(gè)細(xì)胞/μl的DNA。
使用10-6稀釋的染色體DNA溶液中的4μl(相當(dāng)于~100個(gè)基因組拷貝)分析高頻率電場對所稀釋DNA樣品可能的損傷影響。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的檢測PCR以探測所施加電場的影響。詳細(xì)的說，將10-6稀釋的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)染色體DNA溶液中的20μl進(jìn)行10V，100kHz高頻率電解5秒、10秒、20秒或30秒。接著，將4μl(相當(dāng)于100個(gè)染色體拷貝)被處理的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。將所有的樣品置于電解條件，在34個(gè)PCR循環(huán)后進(jìn)行檢測，沒有觀察到檢測靈敏度的損失。在相同的CT點(diǎn)檢測到全部不同處理的DNA樣品的事實(shí)進(jìn)一步說明核苷酸堿基的化學(xué)還原或者氧化對檢測PCR靈敏度有較少的影響(參見圖1)。然而，更進(jìn)一步提高電解程序的持續(xù)時(shí)間(30、90或180秒)表示電解時(shí)間在時(shí)間延長的程序時(shí)沒有影響(參見圖2)。推測，超過30秒的電解會導(dǎo)致目標(biāo)DNA的釋放和過飽和，接著出現(xiàn)了通過定量PCR檢測到的不佳的PCR檢測。
實(shí)施例2通過定量PCR檢測應(yīng)用交替電勢進(jìn)行孢子裂解將含有3.2×109個(gè)孢子/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，并在12000rpm下離心90秒。重復(fù)該步驟4次。去上清。最終溶液含有大約3.2×108個(gè)孢子。將該溶液稀釋到最終濃度為3.2×105個(gè)孢子/ml，并接著用于電解和PCR。
保持頻率和電壓穩(wěn)定(分別為100kHz和10V)，使用不同的暴露時(shí)間(從5秒鐘到30秒鐘)檢測電解程序的持續(xù)時(shí)間。從圖3中可以清楚看出，對CT值沒有顯著的影響，這說明孢子的裂解實(shí)際上是不依賴時(shí)間的。然而，進(jìn)一步提高電裂解程序的持續(xù)時(shí)間(分別為30秒、90秒和180秒)，便顯出當(dāng)應(yīng)用延長的程序時(shí)，電解時(shí)間有影響(參見圖4)。推測，超過30秒的電解會導(dǎo)致目標(biāo)DNA的釋放和過飽和，這樣導(dǎo)致不佳的PCR檢測。
實(shí)施例3不同的頻率(10-100kHz)對孢子電裂解效率的影響將含有3.2×109個(gè)孢子/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，并在12000rpm下離心90秒。重復(fù)該步驟4次。去上清。最終溶液含有大約3.2×108個(gè)孢子。將該溶液稀釋到最終濃度為3.2×105個(gè)孢子/ml，并接著用于電解和PCR。
保持電壓和時(shí)間穩(wěn)定(分別為10V和30秒)。圖4表示該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，顯然，100kHz的高頻率表現(xiàn)了CT(極限循環(huán)，threshold cycle)的降低，這樣說明從孢子釋放了可擴(kuò)增的DNA。將頻率降低到50kHz或者10kHz不會對CT值的改進(jìn)有任何提高(即與未處理的對照相比降低了CT)。
實(shí)施例4確定用于孢子電解的最低有效電壓保持頻率和時(shí)間穩(wěn)定(分別為100kHz和30秒)，使用不同的暴露電壓3～10V的范圍內(nèi)(分別為3V、5V、7V和10V)檢測電解程序的電壓。從圖5可以清除看出，對于膜/孢子捕獲明顯存在極限電壓值VT。因此，所施加的電壓是高度依賴界面電極阻抗的重要參數(shù)，例如低施加電壓(＜2V)對電極提供了非常小的電勢梯度，即使在長脈沖時(shí)間內(nèi)(＞100μs)；并形成了峰狀梯度。
在溶液中所施加電壓的最大強(qiáng)度可以通過繪制設(shè)備提高時(shí)間和充電時(shí)間的指數(shù)函數(shù)來計(jì)算。例如，8μs的設(shè)備提高時(shí)間和20-40μs范圍內(nèi)的充電時(shí)間會提供最大15-18％的所施加強(qiáng)度。在應(yīng)用脈沖后的10-15μs后達(dá)到最大值。50-75μs后，壓降有效地為零，因?yàn)樗兴┘拥碾妷撼霈F(xiàn)在電極-溶液界面。在更高的電壓下，界面的阻抗會成為不可忽視的，并且在電極之間通過的電流受到溶液電導(dǎo)系數(shù)的限制。
實(shí)施例5確定DNA/RNA釋放百分率將含有大約109CFU/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，接著在70℃下用巴氏法滅菌5分鐘，接著對溶液進(jìn)行離心(5000xg，5分鐘)。去上清。再重復(fù)該步驟(Tyndalisation)2次。最終的1ml溶液含有大約108個(gè)孢子。
將該溶液稀釋成105個(gè)孢子/ml的最終濃度，這樣得到了儲藏溶液。
使用儲藏溶液的樣品填充樣品室，并將樣品暴露到交流電場中，所述交流電場具有選定的頻率、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。
為了確定樣品生物細(xì)胞的DNA/RNA釋放百分率，將所暴露的樣品和含有存儲溶液的對照都使用熒光染料4’，6-二咪基-2-聯(lián)苯基吲哚(DAPITM)處理。DAPI是廣泛應(yīng)用的DNA染料，其在結(jié)合到雙鏈DNA小凹陷中富含A-T的序列時(shí)會形成熒光復(fù)合物。染料溶液是含有2.0μg/ml DAPI的水溶液。而且，DAPI限制了細(xì)胞的滲透性，并且因此對于顯示遺傳物質(zhì)的細(xì)胞釋放是最佳的。
使用一定體積的染料溶液對樣品室進(jìn)行洗脫，其體積是樣品室體積的三倍。將來自樣品室的洗脫液在室溫下孵育5分鐘。
在是對照體積大約3倍體積的染色溶液中，將與所暴露樣品體積相當(dāng)?shù)捏w積的對照分別染色5分鐘。
接著將適當(dāng)體積的對照和適當(dāng)體積的所暴露樣品在相差顯微鏡和熒光顯微鏡(配有DAPI過濾器)下進(jìn)行觀察。使用相差顯微鏡對于對照和所暴露的樣品計(jì)算孢子的數(shù)目，表示所釋放的染色體DNA分子(可以看到的藍(lán)點(diǎn))的孢子的數(shù)目通過熒光顯微鏡計(jì)算。接著按照下式確定DNA/RNA釋放百分率 ，其中ds是所計(jì)算的藍(lán)色DNA點(diǎn)的數(shù)目，ss是孢子的總數(shù)。
也可以確定背景DNA/RNA釋放百分率作為對照，如果表示背景釋放高于5％，則建議所確定的被認(rèn)為無效，需要對生物細(xì)胞的新儲藏溶液進(jìn)行重復(fù)。
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Linden，D. Linden，David.(1984).Handbook of Batteries and Fuel Cells(電池和燃料電池手冊).New YorkMcGraw-Hill.
權(quán)利要求
1.一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細(xì)胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，其中所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料；以及d)可選擇地，對部分暴露的液體樣品進(jìn)行分析，其中所述部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第一和第二電極被分開最多20mm的距離，優(yōu)選最多10mm，更優(yōu)選最多5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將生物細(xì)胞附著到第一電極和第二電極上，和/或者被安置在第一電極和第二電極之間。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中交替電場的頻率為至少5kHz，優(yōu)選為至少20kHz，更優(yōu)選為至少50kHz。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中交替電場的頻率為至少100kHz，優(yōu)選為至少250kHz，更優(yōu)選為至少500kHz。
6.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中交替電場是通過調(diào)節(jié)第一電極和第二電極的極性形成的。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中交替電場可以具有從由下列所組成的組中選擇的實(shí)質(zhì)形式矩形、正弦、鋸齒、不對稱三角形、對稱三角形或者其任何組合。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在頻域中交替電場至少含有第一頻率分量和第二頻率分量。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物材料包括選自細(xì)胞器、遺傳材料以及蛋白質(zhì)所組成組的組分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中遺傳材料包括染色體DNA和/或質(zhì)粒DNA和/或任何類型的RNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中蛋白質(zhì)選自由酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、離子通道、毒素、激素以及受體所組成的組。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中生物細(xì)胞選自由細(xì)菌、古細(xì)菌、或真核微生物和真核細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)菌是形成孢子的細(xì)菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述形成孢子的細(xì)菌選自芽孢桿菌屬(Bacillus)和/或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌來自芽孢桿菌屬(Bacillus)群。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)菌是炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12～16任何一項(xiàng)所述的方法，其中生物細(xì)胞是無性細(xì)菌或者孢子。
18.一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的芯片，該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設(shè)備的流體連接；-第一電極和第二電極，其被安置在樣品室相對的兩側(cè)；-可選擇地，樣品室還包括含有生物細(xì)胞的液體樣品；以及-可選擇地，在第一電極和第二電極之間有交替電場，所述電場具有充分的強(qiáng)度以便從生物細(xì)胞中提取生物材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的芯片，其中第一電極和第二電極被安置在第一開口和第二開口之間。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的芯片，其中生物細(xì)胞位于第一電極和第二電極之間。
21.一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的設(shè)備，該設(shè)備包括-芯片位點(diǎn)，芯片位于此處以便能夠功能上與該設(shè)備相連；-設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設(shè)備實(shí)現(xiàn)進(jìn)行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細(xì)胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場具有充分的強(qiáng)度以從生物細(xì)胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進(jìn)行分析，其中該部分包括從生物細(xì)胞中所提取的生物材料。
22.一種用于從生物細(xì)胞中提取生物材料的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括根據(jù)權(quán)利要求18～20中任何一項(xiàng)所述的芯片，該芯片與根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備功能上相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從生物細(xì)胞中分離生物材料的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。本發(fā)明包括將生物粒子暴露到樣品室的交替電場中，并還可以包括在提取后對生物材料的后續(xù)分析。
文檔編號C12N13/00GK1965081SQ200580006151
公開日2007年5月16日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者格特·博蘭德·詹森, 拉爾斯·湯姆森, 厄恩·羅伯特·韋爾特曼 申請人:湯姆森生物公司