專利名稱：Dna熒光毛細(xì)生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于DNA熒光毛細(xì)分析(DNA-FCA)的DNA熒光毛細(xì)生物傳感器(DNA-FCBS)及其制備方法，屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析領(lǐng)域。本發(fā)明適用于醫(yī)藥、衛(wèi)生、農(nóng)林等生物樣品的基因檢測。
背景技術(shù)：
目前DNA檢測方法主要是利用DNA芯片和DNA傳感器。DNA芯片分析的實(shí)質(zhì)是在很小面積的基片表面進(jìn)行有序的點(diǎn)陣，排列一系列可尋址的識(shí)別分子，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，用精密的掃描儀或CCD攝像技術(shù)對(duì)靶DNA進(jìn)行識(shí)別。DNA芯片的特點(diǎn)是一次能測量多個(gè)靶DNA，但有非特異雜交的可能，耗時(shí)長，制作成本高，檢測儀器昂貴，難以普及。
光纖DNA生物傳感器是DNA生物傳感器中最新技術(shù)，主要是在石英光纖表面用化學(xué)法或物理法固定DNA探針或cDNA，然后將固定有DNA探針的光纖一端浸入到溶液中與熒光標(biāo)記的靶DNA雜交；也可將DNA探針固定在光導(dǎo)纖維的末端上，然后將若干條固定有DNA探針的光導(dǎo)纖維合成一束，形成一個(gè)光纖DNA傳感器微陣列，光纖的另一端耦合到熒光顯微鏡中，來自熒光顯微鏡的激光通過光纖傳導(dǎo)，使靶DNA上的熒光標(biāo)記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)仍經(jīng)光纖返回到熒光顯微鏡中，由CCD成像，獲得DNA雜交的圖譜。但是，光纖DNA傳感器的不足是，一端的裸露部分易折斷，DNA探針的固定量和結(jié)合靶DNA量較小，產(chǎn)生的熒光信號(hào)弱，檢測靈敏度低，穩(wěn)定性較差，檢測儀器復(fù)雜、昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于DNA熒光毛細(xì)分析(DNA-FCA)的DNA熒光毛細(xì)生物傳感器(DNA-FCBS)及其制備方法，解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題。
本發(fā)明的測定原理是根據(jù)兩條DNA單鏈堿基互補(bǔ)的原則，用已知序列的DNA探針分子檢測互補(bǔ)的靶DNA分子，根據(jù)靶DNA分子上熒光標(biāo)記物質(zhì)的熒光強(qiáng)度定量和定性靶DNA分子，或者利用嵌入型熒光染料對(duì)與DNA探針分子互補(bǔ)結(jié)合形成的雙鏈DNA分子進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行熒光檢測，達(dá)到對(duì)靶DNA分子定性和定量的目的。
本發(fā)明用于DNA-FCA的DNA-FCBS如圖1所示，其特征是它包括毛細(xì)管、多聚賴氨酸、DNA探針；使用時(shí)，用DNA-FCBS和一個(gè)固定座替代常規(guī)熒光分析中的試液槽，將其置于熒光分析儀光路中。利用DNA-FCBS可實(shí)施DNA-FCA，實(shí)施基因的測定及研究。
本發(fā)明的DNA-FCBS材質(zhì)可以是石英玻璃、光學(xué)玻璃或透明塑料，其長度為3～5cm，容量為2～10μL，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；它的內(nèi)孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時(shí)邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化DNA濃度為10～100μmol/L。
本發(fā)明DNA-FCBS中可改變DNA探針種類，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA熒光毛細(xì)生物測試盒。
本發(fā)明DNA-FCBS中可以固定一種DNA探針，也可同時(shí)固定兩種以上的DNA探針。
本發(fā)明DNA-FCBS可直接用于已商品化的各種熒光分析儀。
本發(fā)明DNA-FCBS制備方法包括以下步驟1)毛細(xì)管的化學(xué)修飾利用毛細(xì)現(xiàn)象將0.2％多聚賴氨酸吸入毛細(xì)管內(nèi)，在室溫下，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上使其反應(yīng)1h，使多聚賴氨酸共價(jià)結(jié)合在毛細(xì)管的內(nèi)壁上。
2)DNA探針固定化用無菌二次蒸餾水洗掉毛細(xì)管內(nèi)游離的多聚賴氨酸之后，吸入10～100μmol/L的DNA探針溶液10μL，在42℃下置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，使其進(jìn)行共價(jià)結(jié)合反應(yīng)30min；然后在80℃下毛細(xì)管干燥1h，再迅速吸入預(yù)冷的固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，放置5min；用無菌二次蒸餾水洗出毛細(xì)管內(nèi)固定液，排空后，重復(fù)加熱(80℃)步驟和預(yù)冷固定步驟3次，每步驟5min，最后用0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)和無菌二次蒸餾水各清洗1次。
3)化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉將固定有DNA探針的毛細(xì)管浸泡在含龜魚精DNA的預(yù)雜交液中6～12h，封閉未結(jié)合的多聚賴氨酸，制成DNA-FCBS；最后，將DNA-FCBS保存在-20℃的冰箱內(nèi)備用。
本發(fā)明的基本技術(shù)參數(shù)為Cy5標(biāo)記的靶DNA測定范圍在0.1～1.0μmol/L，檢出限為1.7pmol，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜4.60％，DNA探針固定濃度為10-100μmol/L；雜交反應(yīng)時(shí)間1～2h，雜交反應(yīng)溫度45℃，解鏈溫度為95～97℃，DNA-FCBS可重復(fù)使用6次。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1)可用DNA-FCBS替代常規(guī)的熒光試液槽，實(shí)現(xiàn)DNA-FCA法；2)DNA-FCBS中可單獨(dú)固定一種DNA探針，也可同時(shí)固定兩種以上的DNA探針，進(jìn)行兩個(gè)以上靶DNA的同時(shí)測定；3)可改變DNA-FCBS中的DNA探針種類，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA熒光毛細(xì)生物測試盒；4)DNA-FCBS可直接用于已商品化的各種熒光分析儀；5)DNA探針在DNA-FCBS中固定化后可以重復(fù)使用，能節(jié)約大量的貴重試劑，降低實(shí)驗(yàn)成本；6)操作簡便，便于攜帶和保存，可用于各種生物樣品中DNA測定，能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1本發(fā)明DNA-FCBS結(jié)構(gòu)示意中S樣品、1毛細(xì)管、2多聚賴氨酸、3DNA探針圖2實(shí)施例2是用本發(fā)明DNA-FCBS測定DNA得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步描述實(shí)施例1本實(shí)施例是用合成的100μmol/L寡核苷酸序列5′-GAAA CCTG TTTG TTGG ATAC-3′作為DNA探針，按上述方法固定于毛細(xì)管內(nèi)表面，制成DNA-FCBS。
測定時(shí)，用DNA-FCBS吸入33μmol/L靶核苷酸序列5′-GTATCC AACAAACA GGTTTC-3′溶液10μL，在45℃下使其雜交反應(yīng)90min；之后對(duì)形成的雙鏈DNA用溴乙啶(EB)染色；用0.2％SDS和二乙酯焦碳酸(DEPC)水洗出DNA-FCBS內(nèi)游離的EB染色液；用RF-5000熒光光度儀在激發(fā)波長526nm，發(fā)射波長584nm處測定，得到的結(jié)果是雜交前后熒光強(qiáng)度的平均值為74.01±14.12，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果t＝4.1106，p＜0.05，雜交前后有顯著性差異。
實(shí)施例2本實(shí)施例是用本發(fā)明DNA-FCBS吸入1μmol/L Cy5標(biāo)記的靶核苷酸序列5′-GTATCCAACAAACA GGTTTC-3溶液10μL，在45℃下使其雜交反應(yīng)90min；用0.2％SDS和DEPC水洗出DNA-FCBS內(nèi)游離的靶核苷酸；用RF-5000熒光光度儀在激發(fā)波長646nm，發(fā)射波長664nm處測定，結(jié)果如表1所示；雜交前后熒光強(qiáng)度的平均值為61.66±18.22，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果t＝6.7684，0.005＜P＜0.01，雜交前后有高度顯著性差異。
表1.

實(shí)施例3本實(shí)施例是在雜交時(shí)間為90min、雜交溫度為45℃的實(shí)驗(yàn)條件下，用本發(fā)明DNA-FCBS吸入一系列不同濃度的Cy5標(biāo)記靶核苷酸溶液，用RF-5000熒光光度儀在激發(fā)波長646nm，發(fā)射波長664nm處測定，結(jié)果如圖2所示。Cy5標(biāo)記的靶核苷酸濃度在0.1～1μmol/L的范圍內(nèi)和熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系y＝139.73x+39.613，相關(guān)系數(shù)為0.9985，檢出限1.7pmol。
實(shí)施例4本實(shí)施例是考察本發(fā)明DNA-FCBS的精密度和再生性。在雜交溫度45℃、雜交時(shí)間90min、解鏈溫度95℃，解鏈時(shí)間4min的實(shí)驗(yàn)條件下，用本發(fā)明DNA-FCBS反復(fù)吸入1μmol/LCy5標(biāo)記靶DNA試樣，用RF-5000熒光光度儀在激發(fā)波長646nm，發(fā)射波長664nm處多次測定，其結(jié)果如表2所示。
可以看出，DNA-FCBS可重復(fù)利用6次，第7次后熒光強(qiáng)度明顯降低；6次重復(fù)測定的熒光強(qiáng)度平均值為172.93，標(biāo)準(zhǔn)差為9.47，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.5％。
表2.

權(quán)利要求
1.用于DNA熒光毛細(xì)分析(DNA-FCA)的DNA毛細(xì)生物傳感器(DNA-FCBS)，其特征是它包括毛細(xì)管(1)、多聚賴氨酸(2)、DNA探針(3)，利用DNA-FCBS可實(shí)施DNA-FCA，實(shí)施基因的測定及研究。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是毛細(xì)管(1)的材質(zhì)可以是石英玻璃、光學(xué)玻璃或透明塑料，長度為3～5cm，容量為2～10μL，內(nèi)徑為0.14～0.90mm，外徑為0.55～1.20mm，壁厚為0.10～0.25mm；毛細(xì)管(1)的內(nèi)孔可以是圓形、也可以是矩形，矩形時(shí)邊長為0.25～0.45mm，壁厚為0.10～0.25mm；固定化DNA探針濃度為10～100μmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是可改變DNA-FCBS中的DNA探針(3)種類，制成不同用途的DNA-FCBS和DNA熒光毛細(xì)生物測試盒。
4.如權(quán)利要求1所述的DNA-FCBS，其特征是可以在DNA-FCBS中固定一種DNA探針(3)，也可同時(shí)固定兩種以上的DNA探針(3)。
5.如權(quán)利要求1所述的DNA-FCBS，其特征在于可直接用于已商品化的各種熒光分析儀。
6.如權(quán)利要求1所述的DNA-FCBS制備方法，其特征在于包括以下步驟1)毛細(xì)管的化學(xué)修飾利用毛細(xì)現(xiàn)象將0.2％多聚賴氨酸吸入毛細(xì)管(1)內(nèi)，在室溫下，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上使其反應(yīng)1h，使多聚賴氨酸共價(jià)結(jié)合在毛細(xì)管(1)的內(nèi)壁上。2)DNA探針固定化用無菌二次蒸餾水洗掉毛細(xì)管內(nèi)游離的多聚賴氨酸(2)之后，吸入10～100μmol/L的DNA探針(3)溶液10μL，在42℃下置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，使其進(jìn)行共價(jià)結(jié)合反應(yīng)30min；然后在80℃下毛細(xì)管(1)干燥1h，再迅速吸入預(yù)冷的固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，放置5min；用無菌二次蒸餾水洗出毛細(xì)管(1)內(nèi)固定液，排空后，重復(fù)加熱(80℃)步驟和預(yù)冷固定步驟3次，每步驟5min，最后用0.2％十二烷基硫酸鈉和無菌二次蒸餾水各清洗1次。3)化學(xué)修飾基團(tuán)的封閉將固定有DNA探針(3)的毛細(xì)管(1)浸泡在含龜魚精DNA的預(yù)雜交液中6～12h，封閉未結(jié)合的多聚賴氨酸(2)，制成DNA-FCBS；最后，將DNA-FCBS保存在-20℃的冰箱內(nèi)備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA熒光毛細(xì)生物傳感器(DNA－FCBS)及其制備方法。屬于生化分析領(lǐng)域。DNA－FCBS是用交聯(lián)劑將DNA探針固定于毛細(xì)管內(nèi)制成，它包括毛細(xì)管、多聚賴氨酸、DNA探針；它可實(shí)現(xiàn)DNA的定性和定量測定。用DNA－FCBS吸入含靶DNA樣品液，進(jìn)行雜交和染色反應(yīng)后，置于熒光儀中，根據(jù)熒光強(qiáng)度定量靶DNA；改變DNA－FCBS內(nèi)探針種類，可以測定不同的靶核甘酸；在DNA－FCBS內(nèi)同時(shí)固定多種探針，可以同時(shí)測定多種靶核甘酸；DNA－FCBS也可制成各種DNA熒光毛細(xì)生物測試盒；本發(fā)明重現(xiàn)性好、操作簡便，可實(shí)現(xiàn)微量化、快速化測定；可使基因檢測達(dá)到普及化和實(shí)用化。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1824797SQ20051002241
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者李永生, 高秀峰 申請(qǐng)人:四川大學(xué)