專(zhuān)利名稱(chēng)：一種解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法，屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋方法。
背景技術(shù)：
生物遺傳信息儲(chǔ)存在基因組DNA分子中。除簡(jiǎn)單生物外，絕大多數(shù)生物基因組DNA分子分子量巨大，這使所期望的全基因組排序工作工程浩大，費(fèi)力費(fèi)時(shí)。例如，6國(guó)科學(xué)家共同努力完成的人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)所耗用時(shí)間就超達(dá)10年?；蚪M測(cè)序計(jì)劃中，工作量最大、耗時(shí)最長(zhǎng)的任務(wù)是測(cè)序前需要繪制待測(cè)序生物全基因組圖譜(包括遺傳圖、物理圖、STS圖、EST圖等)，其工作幾乎占據(jù)整個(gè)基因組計(jì)劃的一半時(shí)間(人類(lèi)基因組計(jì)劃計(jì)劃的前6年主要用于繪制基因組圖譜)。因此，探索一種一次性解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法，為構(gòu)建全基因組各標(biāo)記位點(diǎn)圖譜提供更加簡(jiǎn)便易行的基礎(chǔ)方法，對(duì)于生物全基因組測(cè)序與研究具有重要實(shí)用價(jià)值和理論意義。
目前，解旋小分子量核酸或者核酸片段已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，常用方法有CytoC(細(xì)胞色素C)鋪展法、BAC(芐甲基烷基氯化胺)鋪展法、溴乙錠鋪展法、SLS-CytoC(月桂酰肌苷酸鈉-細(xì)胞色素C)鋪展法等。其中以CytoC鋪展法使用較多。然而，將這些方法用于鋪展高分子量基因組并要達(dá)到完全解旋超螺旋結(jié)構(gòu)，其效果均不理想，主要表現(xiàn)在①基因組解旋不完全，所獲圖像超螺旋紐節(jié)多，且數(shù)目難以分辨。②解旋后的基因組分子常出現(xiàn)斷裂，難能得到完整基因組分子。③常規(guī)CytoC鋪展法需加入較高濃度的CytoC才能將DNA分子展開(kāi)，較高濃度的CytoC本身可遮蓋核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體顯現(xiàn)，這難能觀察研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用，且該方法完全解旋高分子量基因組仍然困難。④BAC和溴乙錠鋪展法在一定程度上雖能鋪展小分子量基因組并可用于觀察到核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體(因無(wú)CytoC存在)，但鋪展單鏈基因組分子時(shí)常出現(xiàn)紐節(jié)；而且，BAC方法制樣時(shí)，銅網(wǎng)上的樣品易被污染，圖像反差低，背景欠干凈而不易區(qū)別，碳膜需新鮮制作且需活化，鋪展的基因組分子對(duì)醋酸氧鈾和酸性磷鎢酸染料親和力低。⑤Zollinger等人在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，提出了SLS-CytoC鋪展法(見(jiàn)Zollinger M，Gaertin M，Mamet-Bratley MD.Anal Biochem，1977，82196-203)，該方法雖能克服BAC和溴乙錠鋪展法的一些不足，相對(duì)也可觀察到核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，但圖像背景仍差，核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體顯示不夠清楚(因所用細(xì)胞色素C濃度仍未能有效克服對(duì)核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體的遮暗效應(yīng))，且僅適合于小分子基因組及其片段觀察。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對(duì)Zollinger等人的SLS-CytoC鋪展法方法進(jìn)行改進(jìn)，提出一種解旋高分子量基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法。通過(guò)本發(fā)明可簡(jiǎn)單、方便地獲得解旋后的高分子量完整基因組，并為基因組各相關(guān)標(biāo)記位點(diǎn)圖譜(如全基因組特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)圖譜、酶切物理圖譜、STS圖譜、EST圖譜、變性圖譜、異源雙鏈圖譜等)的繪制提供信息，從而大大加速高分子量基因組生物(尤其是真核生物)基因組測(cè)序進(jìn)程。
本發(fā)明詳細(xì)技術(shù)方案為一種解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，它包括以下步驟1、生物完整基因組制備。按常規(guī)方法制備并提純生物基因組DNA分子，并在-20℃溫度條件下保存?zhèn)溆谩?br> 2、支持膜制備。1)、利用火棉膠和醋酸異戊酯制成2％火棉膠醋酸異戊酯溶液，備用；2)、潔凈培養(yǎng)皿中鋪放適當(dāng)大小干凈濾紙一張，盛雙蒸水達(dá)3/4左右體積，用鑷子放潔凈銅網(wǎng)于濾紙上，待水面平靜后，于水面輕輕滴入一滴2％火棉膠醋酸異戊酯液，靜置5分鐘使其成膜，用洗耳球從皿邊緣吸去雙蒸水，50-60℃條件下烘干備用。
3、電子顯微學(xué)樣品制備，1)、按下表配制鋪展液(上相液)

畢后，用微量進(jìn)樣器針頭輕微拌動(dòng)約100圈。
2)、按下表配制下相液

3)、基因組鋪展取潔凈載玻片一張，斜放于Teflon皿中(如圖1所示)，傾下相液于Teflon皿內(nèi)。用Teflon棒于下相液液面趨趕污物，之后，輕輕抖下少量滑石粉，待滑石粉散開(kāi)后，用微量進(jìn)樣器吸取適量上相液于載玻片斜面上小心均勻排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的邊緣呈現(xiàn)出光亮單層膜區(qū)約10秒鐘后用鑷子夾住覆有火棉膠膜的銅網(wǎng)撈片，得到未經(jīng)染色的電子顯微學(xué)樣品。
4)、樣品染色將未經(jīng)染色的電子顯微學(xué)樣品用90％乙醇脫水約10秒鐘后轉(zhuǎn)入5×10-5％摩爾/升濃度的醋酸雙氧鈾(UAc)中染色30分鐘左右，之后轉(zhuǎn)入90％乙醇中清洗約1秒鐘，吸干濾紙后得到最終的電子顯微學(xué)樣品。
本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是對(duì)Zollinger等人的SLS-CytoC的電鏡核酸方法進(jìn)行了如下改進(jìn)①將鋪展液中的SLS濃度提高5倍；②將CytoC濃度降至50mg/mL；③操作中并輔之以適當(dāng)?shù)牧黧w切力拌動(dòng)，結(jié)果獲得了較之Zollinger原方法效果更佳、且能獲得一次性充分解旋全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的完整基因組分子。本方法能較好用于生物基因組(尤其是高分子量真核基因組)測(cè)序所需的各種定位標(biāo)記圖譜構(gòu)建、核酸-蛋白質(zhì)相互作用研究、基因組結(jié)構(gòu)研究等領(lǐng)域。
最終的電子顯微學(xué)樣品制作好后，可借助透射電鏡觀察并拍攝生物基因組DNA分子的解旋結(jié)果。
與同類(lèi)技術(shù)比，本發(fā)明所述方法有如下特點(diǎn)(1)一次性完全解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)，電鏡觀察證明交叉點(diǎn)＝0，所獲基因組分子圖像背景清晰、反差好、光滑、柔韌、無(wú)纏結(jié)與斷裂、且無(wú)縱向伸長(zhǎng)。(2)電鏡觀察證明，特異結(jié)合于基因組分子上的互作蛋白質(zhì)(酶)分子顯示十分清楚。(3)利用電鏡能直接觀察并測(cè)定到基因組解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等。
需要說(shuō)明的是高分子量基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋是一個(gè)非?！拔⒚睢钡倪^(guò)程，影響因素較多，有時(shí)一個(gè)因子未能滿(mǎn)足，可能會(huì)影響整個(gè)鋪展效果。操作時(shí)應(yīng)同時(shí)注意考慮如下因素①通常認(rèn)為基因組體外解旋可能是通過(guò)流體切力先使基因組的一條鏈斷裂，讓其周繞另一鏈旋轉(zhuǎn)而達(dá)到解旋超螺旋。但也有實(shí)驗(yàn)證明，流體切力是隨機(jī)的，不能完全破壞基因組所有超螺旋紐節(jié)。因此，完全開(kāi)環(huán)DNA分子的獲得除了流體切力的隨機(jī)作用外，可能還與SLS的鋪展性能有重要關(guān)系。
②基因組樣品純度可能會(huì)影響鋪展效果和重復(fù)率，樣品越純，效果越佳。在進(jìn)行病毒基因組鋪展中，為保證鋪展后基因組分子完整而不斷裂，建議最好用離心純化的病毒粒子按本方法進(jìn)行直接釋放鋪展。
③器具清潔度會(huì)影響鋪展液面的推開(kāi)程度，進(jìn)而可能會(huì)直接影響DNA的分散度。操作時(shí)，尤其應(yīng)是用潔凈的載玻片、Teflon棒和Teflon皿。
④制樣過(guò)程中，因拌動(dòng)而產(chǎn)生的流體切力強(qiáng)度應(yīng)適當(dāng)，過(guò)強(qiáng)可能會(huì)造成基因組分子斷裂。而且這在觀察核酸-蛋白質(zhì)相互作用時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致基因組上特異結(jié)合的互作蛋白數(shù)量減少；但強(qiáng)度不足，基因組解旋超螺旋可能會(huì)不完全。具體操作過(guò)程中可使用微量進(jìn)樣器針頭輕微拌動(dòng)鋪展液約100圈，不僅必要，而且效果好。
⑤下相液表面性質(zhì)可影響基因組分散度。建議下相液表面單層膜形成后約10秒鐘后再開(kāi)始撈片。經(jīng)驗(yàn)表明，該時(shí)間少于10秒鐘或大于20分鐘，基因組分散度均有所降低。而且，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，觀察核酸-蛋白質(zhì)相互作用時(shí)基因組上特異結(jié)合的互作蛋白數(shù)量減少。
本發(fā)明有益效果1、技術(shù)上①樣品用量少，僅需毫微克基因組材料就能滿(mǎn)足制樣需要；②制樣過(guò)程迅速，數(shù)小時(shí)即能得到結(jié)果；③方法簡(jiǎn)便，直觀，易掌握。
2、適于生物全基因組各種物理圖譜繪制。
利用本發(fā)明所述方法可一次性簡(jiǎn)易繪制全基因組各相關(guān)標(biāo)記位點(diǎn)圖譜(如基因組特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)圖譜、酶切物理圖譜等)，從而大大加速高分子量基因組生物(尤其是真核生物)基因組測(cè)序進(jìn)程。
3、可為從全基因組角度直觀研究生物遺傳結(jié)構(gòu)提供技術(shù)支撐。
電鏡能直接觀察到每一基因組分子，所獲結(jié)果能在電鏡圖片上真實(shí)反映并一一檢測(cè)出來(lái)。電鏡顯示的是基因組的單分子行為，可很好克服生化凝膠電泳分析方法只能反映基因組分子集合行為的眾多不足。利用本發(fā)明所述方法能解旋高分子量基因組并獲得完整分子，從而為從全基因組角度直觀研究生物遺傳結(jié)構(gòu)提供了較好技術(shù)支撐。
4、可直接用于蛋白質(zhì)--核酸相互作用研究。
蛋白質(zhì)--核酸相互作用是分子生物學(xué)領(lǐng)域有關(guān)基因識(shí)別、切割、復(fù)制、重組、表達(dá)、調(diào)控等過(guò)程的一個(gè)基本問(wèn)題。本技術(shù)解決了核酸-蛋白質(zhì)相互作用領(lǐng)域所涉及的兩個(gè)最基本問(wèn)題①高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)體外解旋；②基因組互作蛋白(酶)在解旋基因組上的清晰顯現(xiàn)。例如，用本技術(shù)研究基因組與限制性酶結(jié)合關(guān)系，限制酶一定時(shí)限內(nèi)在基因組各位點(diǎn)上結(jié)合的先后快慢、單酶或多酶結(jié)合、各限制酶片段長(zhǎng)短、切割先后等，都可在電鏡圖片上一一反映出來(lái)，并能一次性繪制成物理圖譜供全基因組測(cè)序作定位標(biāo)記參考。這些工作毋需DNA重組技術(shù)、酶切探針標(biāo)記、片段雜交等繁瑣操作，較之生化方法快捷且容易得多(尤其當(dāng)基因組存在若干限制酶位點(diǎn)時(shí))。


圖1為基因組鋪展示意圖。
圖2-4所示為PbGv(大菜粉蝶顆粒體病毒)基因組經(jīng)本發(fā)明所述方法解旋后，JEM-100CX電鏡下拍攝到的完整開(kāi)環(huán)PbGv-DNA分子。照片顯示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，顯示出天然柔性，金屬投影后直徑為6-8nm(24000X)。
圖5-圖10為PbGv-DNA分子經(jīng)本發(fā)明所述方法解旋后，PbGv-DNA開(kāi)環(huán)分子上結(jié)合的EcoRI示意圖。電鏡顯示EcoRI顯示清楚，它們并不被本技術(shù)條件下的細(xì)胞色素C所遮蓋；EcoRI可分為大、小顆粒，大顆粒直徑20-27nm，小顆粒16-18nm；Mg2+存在時(shí)，結(jié)合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要為大顆粒。
其中圖5-6顯示解旋后PbGv-DNA開(kāi)環(huán)分子上有兩個(gè)EcoRI酶點(diǎn)，JEM-100CX拍攝，24000X；圖7顯示解旋后PbGv-DNA開(kāi)環(huán)分子上有五個(gè)EcoRI酶點(diǎn)，JEM-100CX拍攝，24000X；圖8顯示同一視野下可見(jiàn)到三個(gè)開(kāi)環(huán)PbGv-DNA分子，其中一個(gè)PbGv-DNA分子上有兩個(gè)EcoRI，另兩個(gè)PbGv-DNA分子上各有一個(gè)EcoRI。JEM-100CX拍攝，12500X；圖9顯示PbGv-DNA上結(jié)合有一個(gè)大顆粒EcoRI(直徑26.7nm)，有一個(gè)小顆粒EcoRI(直徑17.8nm)游離于環(huán)境中，DNA直徑8nm。JEM-100CX拍攝，22500X；圖10PbGv-DNA上的大顆粒EcoRI進(jìn)一步放大。JEM-100CX拍攝。
圖11采用本技術(shù)一次性構(gòu)建的PbGv-DNA-EcoRI相互作用結(jié)合位點(diǎn)物理圖譜。
圖12所示經(jīng)本發(fā)明所述方法隨機(jī)測(cè)定的74個(gè)PbGv-DNA分子量分布。表明PbGv-DNA基因組分子長(zhǎng)度存在多態(tài)性，即個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)有明顯差異。其中，PbGv-DNA的最大分子長(zhǎng)度為124.1Kb，最小分子長(zhǎng)度為95.8Kb，群體分子模態(tài)長(zhǎng)度為109.7±7Kb(群體分子量分布中該分子量分子表現(xiàn)為最大峰)，此與凝膠電泳分離得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
具體實(shí)施例方式
按照本發(fā)明所述的方法，對(duì)大菜粉蝶顆粒體病毒(PbGv)基因組進(jìn)行解旋，所制得的解旋樣品經(jīng)JEM-100CX電鏡觀察并拍攝結(jié)果，如圖2至圖10所示。照片顯示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，顯示出天然柔性，金屬投影后直徑為6-8nm(24000X)。另外，EcoRI顯示清楚，它們并不被本技術(shù)條件下的細(xì)胞色素C所遮蓋；EcoRI可分為大、小顆粒，大顆粒直徑20-27nm，小顆粒16-18nm；Mg2+存在時(shí)，結(jié)合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要為大顆粒。用本技術(shù)研究PbGv-DNA，除發(fā)現(xiàn)群體模態(tài)分子的平均分子量(109.7±7Kb)與凝膠電泳分離得到的分子量(108.2Kb)十分吻合外，也發(fā)現(xiàn)部分PbGv-DNA分子存在“個(gè)體差異”。利用本技術(shù)于電鏡下一次性初步繪制的高分子量PbGv-DNA-EcoRI相互作用結(jié)合位點(diǎn)物理圖譜如圖11所示。用本技術(shù)隨機(jī)測(cè)定的74個(gè)PbGv-DNA(大菜粉蝶顆粒體病毒DNA)分子，其模態(tài)分子長(zhǎng)度(109.7±7Kb)與生化凝膠電泳方法得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
權(quán)利要求
1.一種解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法，其特征是，它包括以下步驟1)、生物完整基因組制備，按常規(guī)方法制備并提純生物基因組DNA分子，并在-20℃溫度條件下保存?zhèn)溆茫?)、支持膜制備，包括(1)、利用火棉膠和醋酸異戊酯制成2％火棉膠醋酸異戊酯溶液，備用；(2)、潔凈培養(yǎng)皿中鋪放適當(dāng)大小干凈濾紙一張，盛雙蒸水達(dá)3/4左右體積，用鑷子放潔凈銅網(wǎng)于濾紙上，待水面平靜后，于水面輕輕滴入一滴2％火棉膠醋酸異戊酯液，靜置5分鐘使其成膜，用洗耳球從皿邊緣吸去雙蒸水，50-60℃條件下烘干備用；3)、電子顯微學(xué)樣品制備，包括(1)、按下表配制鋪展液(上相液)
畢后，用微量進(jìn)樣器針頭輕微拌動(dòng)約100圈；(2)、按下表配制下相液
(3)、基因組鋪展取潔凈載玻片一張，斜放于Teflon皿中，傾下相液于Teflon皿內(nèi)。用Teflon棒于下相液液面趨趕污物，之后，輕輕抖下少量滑石粉，待滑石粉散開(kāi)后，用微量進(jìn)樣器吸取適量上相液于載玻片斜面上小心均勻排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的邊緣呈現(xiàn)出光亮單層膜區(qū)約10秒鐘后用鑷子夾住覆有火棉膠膜的銅網(wǎng)撈片，得到未經(jīng)染色的電子顯微學(xué)樣品；(4)、樣品染色將未經(jīng)染色的電子顯微學(xué)樣品用90％乙醇脫水約10秒鐘后轉(zhuǎn)入5×10-5％摩爾/升濃度的醋酸雙氧鈾(UAc)中染色30分鐘左右，之后轉(zhuǎn)入90％乙醇中清洗約1秒鐘，吸干濾紙后得到最終的電子顯微學(xué)樣品。
全文摘要
一種解旋高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的方法，屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及高分子量全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋方法。本發(fā)明實(shí)質(zhì)上是對(duì)Zollinger等人報(bào)道的核酸電鏡鋪展技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)①將鋪展液中的SLS濃度提高5倍；②將細(xì)胞色素C濃度降至50mg/mL；③操作中輔之以適當(dāng)?shù)牧黧w切力拌動(dòng)。本發(fā)明可一次性獲得充分解旋全基因組超螺旋結(jié)構(gòu)的完整基因組分子；結(jié)合于基因組分子上的特異互作蛋白質(zhì)(酶)分子顯示清楚；能直接觀察并測(cè)定到基因組解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等；所獲基因組分子圖像背景清晰、反差好、光滑、柔韌、無(wú)纏結(jié)與斷裂、且無(wú)縱向伸長(zhǎng)。本技術(shù)能較好用于生物基因組測(cè)序所需的各種定位標(biāo)記圖譜構(gòu)建、核酸－蛋白質(zhì)相互作用研究、基因組結(jié)構(gòu)研究等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1807615SQ20051002243
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者馬義才 申請(qǐng)人:電子科技大學(xué)