專利名稱：人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及到一種新的編碼人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體的cDNA及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing Ligand，TRAIL)是一種細(xì)胞因子，屬于腫瘤壞死因子家族成員，其cDNA首先由Wiley等于1995年克隆獲得[1]。
TRAIL cDNA編碼全長為281個(gè)氨基酸的前體蛋白，其中第114-281位氨基酸為其可溶性片斷。TRAIL蛋白具有II型跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分子的N端位于胞膜內(nèi)側(cè)，無信號(hào)肽序列，膜外部分為C段，含親水端[2]。
研究表明，可溶性TRAIL單體分子包含兩條反向平行的β折疊，兩條β折疊形成一個(gè)以中心為平臺(tái)的三明治結(jié)構(gòu)；三個(gè)TRAIL分子分別以第230位Cys兩兩相連，通過二硫鍵形成三聚體，三聚體結(jié)構(gòu)是TRAIL的穩(wěn)定活性形式。Zn2+的存在對于形成和維持TRAIL分子穩(wěn)定的同源三聚體結(jié)構(gòu)具有重要作用[3-7]。
中國專利ZL 01105946.X公開了一種旨在提高人可溶性TRAIL生物活性和穩(wěn)定性的新型突變體，該突變體在已有克隆人TRAIL基因全序列cDNA和氨基酸序列的基礎(chǔ)上，去除了N端編碼第1-113位氨基酸的堿基序列，同時(shí)改造去除了編碼第119和第120位兩個(gè)氨基酸的編碼堿基，保留C端氨基酸編碼序列而獲得的長度為168個(gè)氨基酸的人TRAIL缺失突變體及其編碼cDNA。
但以上發(fā)明中公開的人TRAIL缺失突變體的編碼cDNA還存在較大不足，比如(1)人TRAIL突變體的編碼基因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞偏愛密碼子，在原核細(xì)胞中表達(dá)效率較低，表達(dá)蛋白約占菌體總蛋白的21.15％；(2)重組表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)物大部分以包涵體形式存在，可溶性表達(dá)產(chǎn)物的比例較低，產(chǎn)量小；(3)TRAIL突變體蛋白需采用包涵體變性、復(fù)性方法純化目的蛋白，包涵體純化方法不僅操作繁瑣、目的蛋白回收率低，而且不能直接獲得具有正確構(gòu)象的目的蛋白，目的蛋白復(fù)性困難，生物活性較低[8]。這些不足之處使該TRAIL突變體的產(chǎn)率較低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本過高，大大影響了對其進(jìn)一步的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種人TRAIL突變體編碼cDNA。
該人TRAIL突變體編碼cDNA具有序列號(hào)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列與ZL 01105946.X中公開的人TRAIL突變體編碼cDNA所編碼的氨基酸序列相同(新舊編碼cDNA序列的對照見表1，其中表1a為本發(fā)明TRAIL突變體編碼cDNA序列；表1b為ZL 01105946.X公開的人TRAIL突變體編碼cDNA序列)。
表1本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)(ZL 01105946.X)的人TRAIL突變體編碼cDNA序列對照表表1a本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA序列(SEQ ID NO.1)ATG GTT CGT GAA CGT GGT CGT GTT GCT GCT CAC ATC ACT GGT ACT 45CGT GGT CGT TCT AAC ACT CTT TCT TCT CCG AAC TCT AAA AAC GAA 90AAA GCT CTT GGT CGT AAA ATC AAC TCT TGG GAA TCT TCT CGT TCT135GGT CAC TCT TTC CTT TCT AAC CTT CAC CTT CGT AAC GGT GAA CTT180GTT ATC CAC GAA AAA GGT TTC TAC TAC ATC TAC TCT CAG ACT TAC225TTC CGT TTC CAG GAA GAA ATC AAA GAA AAC ACT AAA AAC GAT AAA270CAG ATG GTT CAG TAC ATC TAC AAA TAC ACT TCT TAC CCG GAC CCG315ATC CTT CTT ATG AAA TCT GCT CGT AAC TCT TGC TGG TCT AAA GAT360GCT GAA TAC GGT CTT TAC TCT ATC TAC CAG GGT GGT ATC TTC GAA405CTT AAA GAA AAC GAT CGT ATC TTC GTT TCT GTT ACT AAC GAA CAC450CTT ATC GAT ATG GAT CAC GAG GCT TCT TTC TTC GGT GCT TTC CTT495GTT GGT TAA504表1b現(xiàn)有技術(shù)(ZL 01105946.X)公開的人TRAIL突變體編碼cDNA序列ATG GTG AGA GAA AGA GGT AGA GTA GCA GCT CAC ATA ACT GGG ACC 45AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA 90AAG GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT135GGG CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT GAA CTG180GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT TCC CAA ACA TAC225TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA270CAA ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT315ATA TTG TTG ATG AAA AGT GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT360GCT GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG GGA ATA TTT GAG405
CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA AGA AAT GAG CAC 450TTG ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTC GGG GCC TTT TTA 495GTT GGC TAA 504本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供包含本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA的重組載體。這些能攜帶本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA的各種載體是本領(lǐng)域已知的，如質(zhì)粒、重組噬菌體或其他的經(jīng)加工后能含有本發(fā)明重組人TRAIL突變體編碼cDNA的原核或真核載體。
優(yōu)選的，所述重組載體是原核表達(dá)載體。
更優(yōu)選的，所述原核表達(dá)載體是質(zhì)粒。
再優(yōu)選的，所述質(zhì)粒是pET32a。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供包含上述人TRAIL突變體編碼cDNA或上述重組載體的宿主細(xì)胞。
優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
更優(yōu)選的，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。
再優(yōu)選的，所述大腸桿菌是BL21(DE3)或ER2566。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供由本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA所編碼的人TRAIL突變體多肽。
進(jìn)一步的，所述多肽是由本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到的。
更進(jìn)一步的，所述原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種制備人TRAIL突變體多肽的方法。該方法包括以下步驟a、合成具有序列號(hào)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA；b、用步驟a所得的cDNA構(gòu)建原核表達(dá)載體；c、用步驟b所得的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備得到工程菌；d、將所得工程菌進(jìn)行培養(yǎng)增殖，培養(yǎng)后收集菌體；e、破碎菌體，純化制備人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供本發(fā)明重組人TRAIL突變體多肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物是由上述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。
本發(fā)明的第一個(gè)方面所提供的人TRAIL突變體編碼cDNA是根據(jù)中國專利ZL 01105946.X公開的人TRAIL突變體編碼氨基酸序列重新設(shè)計(jì)，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性原則設(shè)計(jì)引物，通過人工合成和基因拼接得到的人TRAIL突變體新編碼cDNA。
將本發(fā)明合成的人TRAIL突變體編碼cDNA連接進(jìn)入載體而構(gòu)建成本發(fā)明第二個(gè)方面所提供的的重組載體。在本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)實(shí)施方案中，以pET32a載體為骨架，切除該載體的融合標(biāo)簽序列，將本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA直接連接于載體編碼閱讀框atg后，得到新的重組原核表達(dá)載體pET/TRAIL(mutant)。
用以上所述的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可得到本發(fā)明第三個(gè)方面提供的含有重組人TRAIL突變體編碼cDNA的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)實(shí)施方案中，將該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，鑒定篩選出了含有人TRAIL突變體編碼cDNA的重組大腸桿菌BL21(DE3)。在本發(fā)明另一個(gè)較優(yōu)實(shí)施方案中，將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，鑒定篩選出了含有人TRAIL突變體編碼cDNA的重組大腸桿菌ER2566。將上述的重組大腸桿菌BL21(DE3)和重組大腸桿菌ER2566進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)后取菌體進(jìn)行提取純化得到重組人TRAIL突變體多肽。
特別需要說明的是，以上生產(chǎn)和操作本發(fā)明公開的重組基因、重組多肽、重組載體和抗腫瘤注射劑的具體技術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的技術(shù)完成。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)并人工合成的新的重組人TRAIL突變體多肽編碼cDNA，將本發(fā)明重組人TRAIL突變體多肽編碼cDNA構(gòu)建成表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入常用的宿主細(xì)胞尤其是原核細(xì)胞中制備重組人TRAIL突變體多肽，能比現(xiàn)有技術(shù)獲得更高的表達(dá)效率并提高可溶性表達(dá)的比例，制備得到的重組人TRAIL突變體多肽活性大大高于現(xiàn)有技術(shù)；本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品活性弱的缺點(diǎn)，能大大降低人TRAIL突變體多肽的使用成本、并實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、促進(jìn)其在基礎(chǔ)研究和醫(yī)藥生產(chǎn)上的應(yīng)用。


圖1本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA PCR擴(kuò)增電泳圖其中M為核酸分子量marker，1、2、3為TRAIL全長cDNA擴(kuò)增結(jié)果。
圖2重組原核表達(dá)載體pET/TRAIL(mutant)構(gòu)建示意3重組原核表達(dá)載體pET/TRAIL(mutant)酶切電泳圖其中M1、M2為不同大小的核酸分子量marker，1為陽性重組質(zhì)粒pET/TRAIL(mutant)雙酶切電泳結(jié)果。
圖4重組原核表達(dá)載體pET/TRAIL(mutant)測序圖譜圖5不同宿主菌表達(dá)本發(fā)明人TRAIL突變體多肽的表達(dá)電泳圖其中M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量marker，1、2為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ER2566工程菌表達(dá)情況。1為沉淀(不溶蛋白)，2為上清(可溶蛋白)，經(jīng)掃描分析表達(dá)目的蛋白中70％為可溶性蛋白，可溶性目的蛋白占菌體可溶性蛋白總量的比例為35％；3、4為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)工程菌表達(dá)情況。3為沉淀，4為上清，分析結(jié)果顯示表達(dá)目的蛋白中60％為可溶性蛋白，可溶性目的蛋白占菌體可溶性蛋白總量的比例為40％。
圖6本發(fā)明TRAIL多肽純化過程電泳圖其中M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量marker，1為純化前樣品，2、3為中度純化樣品，4、5為精細(xì)純化樣品。
圖7本發(fā)明人TRAIL突變體多肽免疫印跡圖譜其中M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量marker，1、2、3為TRAIL目的蛋白免疫印跡陽性信號(hào)。
下面結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述對本發(fā)明進(jìn)行說明。但這種說明不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)思想，均屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一.本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA的改造和合成1材料人TRAIL突變體編碼cDNA拼接引物(均為5’到3’方向，20D值，PAGE純化)由上海博亞公司合成。大腸桿菌JM109、克隆載體pGEM-T、T4多核苷酸磷酸化酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司。質(zhì)粒抽提試劑盒，凝膠回收試劑盒，DNA純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀(Ferrotec，TC-25/H)為杭州大和公司產(chǎn)品。凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC2000)、垂直電泳系統(tǒng)(Power/Pac300)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
2方法2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)中國專利ZL 01105946.X中公開的的編碼氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏好性原則設(shè)計(jì)用于基因拼接的25條正、反鏈DNA引物(如SEQ IDNO.2～26所示的正鏈TA1-TA12共12條引物，反鏈TA1-2-TA13-14共13條引物)，引物序列見表2。其中5’端加入Xba I酶切位點(diǎn)，3’端加入BamH I酶切位點(diǎn)序列，便于與載體連接。
表2本發(fā)明人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物(SEQ ID NO.2～26)TA1(SEQ ID NO.2)CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTA2(SEQ ID NO.3)GTTCGTGAACGTGGTCGTGTTGCTGCTCACATCACTGGTACTCGTGGTA3(SEQ ID NO.4)TCGTTCTAACACTCTTTCTTCTCCGAACTCTAAAAACGAAAAAGCTCTA4(SEQ ID NO.5)TTGGTCGTAAAATCAACTCTTGGGAATCTTCTCGTTCTGGTCACTCTTA5(SEQ ID NO.6)TTCCTTTCTAACCTTCACCTTCGTAACGGTGAACTTGTTATCCACGATA6(SEQ ID NO.7)AAAAGGTTTCTACTACATCTACTCTCAGACTTACTTCCGTTTCCAGGTA7(SEQ ID NO.8)AAGAAATCAA GAAAACACTAAAAACGATAAACAGATGGTTCAGTACTA8(SEQ ID NO.9)ATCTACAAATACACTTCTTACCCGGACCCGATCCTTCTTATGAAATCTA9(SEQ ID NO.10)TGCTCGTAACTCTTGCTGGTCTAAAGATGCTGAATACGGTCTTTACTA10(SEQ ID NO.11)TCTATCTACCAGGGTGGTATCTTCGAACTTAAAGAAAACGATCGTATA11(SEQ ID NO.12)TCTTCGTTTCTGTTACTAACGAACACCTTATCGATATGGATCACGATA12(SEQ ID NO.13)GGCTTCTTTCTTCGGTGCTTTCCTTGTTGGTTAATAAGGATCCGAATA1-2(SEQ ID NO.14)GTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGTA2-3(SEQ ID NO.15)AGCAACACGACCACGTTCACGAACCATATGTATATCTCCTTCTTAAATA3-4(SEQ ID NO.16)GGAGAAGAAAGAGTGTTAGAACGACCACGAGTACCAGTGATGTGAGCTA4-5(SEQ ID NO.17)CCCAAGAGTTGATTTTACGACCAAGAGCTTTTTCGTTTTTAGAGTTCTA5-6(SEQ ID NO.18)ACGAAGGTGAAGGTTAGAAAGGAAAGAGTGACCAGAACGAGAAGATTTA6-7(SEQ ID NO.19)GAGTAGATGTAGTAGAAACCTTTTTCGTGGATAACAAGTTCACCGTTTA7-8(SEQ ID NO.20)TTTTAGTGTTTTCTTTGATTTCTTCCTGGAAACGGAAGTAAGTCTGATA8-9(SEQ ID NO.21)CGGGTAAGAAGTGTATTTGTAGATGTACTGAACCATCTGTTTATCGTTA9-10(SEQ ID NO.22)TAGACCAGCAAGAGTTACGAGCAGATTTCATAAGAAGGATCGGGTCTA10-11(SEQ ID NO.23)AAGATACCACCCTGGTAGATAGAGTAAAGACGTATTCAGCATCTTTA11-12(SEQ ID NO.24)TTCGTTAGTAACAGAAACGAAGATACGATCGTTTTCTTTAAGTTCGTA12-13(SEQ ID NO.25)AGAAAGCACCGAAGAAAGAAGCCTCGTGATCCATATCGATAAGGTGTA13-14(SEQ ID NO.26)TTCGGATCCTTATTAACCAACA
2.2引物磷酸化將上述引物稀釋至100pmol/L的濃度，各取1ul，于70℃變性5min后立即置于冰上放置5min。上述混合液加入10×T4 ligase buffer、T4 polynucleotidekinase及ddH2O，反應(yīng)體系如下經(jīng)處理的引物混合液25ul10×T4 ligase buffer 4ulT4 polynucleotide kinase 1ulddH2O 10ul40ul37℃反應(yīng)1h后置70℃放置10min，然后置94℃1min，55℃1min，室溫自然冷卻。
2.3引物連接將5’磷酸化產(chǎn)物加入以下反應(yīng)體系5’磷酸化產(chǎn)物 40ul10×T4 DNA ligase buffer 5ul10×T4 DNA ligase 1ulddH2O 4ul50ul于16℃連接4h后，65℃滅活10min。采用Omega核酸純化回收試劑盒回收連接片斷，最后以30ul ddH2O洗脫。
2.4PCR擴(kuò)增以連接反應(yīng)產(chǎn)物為模板，加入首條正鏈和末條反鏈引物，進(jìn)行人全長TRAIL突變體cDNA基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下連接反應(yīng)產(chǎn)物 2ul10×PCR buffer5ul25mmol/L MgCl25uldNTPs(2mmol/each) 4ul引物TA1(100mol/L) 1ul引物TA13-14(100mol/L) 1ulEX Taq酶(1U/ul) 0.5ulddH2O 32.5ul50ul
反應(yīng)結(jié)束，于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳。
2.5PCR產(chǎn)物的凝膠回收、純化合并PCR產(chǎn)物150ul，采用2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因片斷，目的片斷回收采用Omega公司凝膠回收試劑盒，最終洗脫液溶于30ul ddH2O中。
2.6目的基因與T載體的連接、轉(zhuǎn)化，克隆篩選及鑒定取凝膠回收純化的PCR產(chǎn)物4ul加入pGEM-T載體DNA 1ul，連接緩沖液5ul，16℃連接4h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109，然后涂布于含100ug/mlAmp的固體LB培養(yǎng)基平板中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落加入5ml含100ug/mlAmp的液體LB培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)6h。采用Omega公司質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定陽性的載體送上海博亞公司測序。將測序證實(shí)完全正確的序列命名為pGEM-T/TRAIL(mutant)，保存菌種。
3結(jié)果將博亞公司合成的25條引物磷酸化、連接，以連接產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約560bp的新的人TRAIL突變體全長cDNA(PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1)，該序列成功連接于克隆載體pGEM-T，經(jīng)測序證實(shí)得到陽性重組質(zhì)粒pGEM-T/TRAIL(mutant)。
實(shí)施例二.重組原核表達(dá)載體pET/TRAIL(mutant)的構(gòu)建1材料基因擴(kuò)增引物(均為5’到3’方向，20D值，PAGE純化)由上海博亞公司合成。大腸桿菌JM109、Deep Vent DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，原核表達(dá)載體pET32a購自Novagen公司，質(zhì)粒抽提試劑盒，凝膠回收試劑盒，DNA純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀(Ferrotec，TC-25/H)為杭州大和公司產(chǎn)品。凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC2000)、垂直電泳系統(tǒng)(Power/Pac300)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
2方法由于表達(dá)載體及質(zhì)粒pGEM-T/TRAIL(mutant)上均含有Xba I及BamH I酶切位點(diǎn)序列，因而TRAIL突變體cDNA序列可以通過表達(dá)載體及pGEM-T/TRAIL(mutant)分別雙酶切進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建成以pET32a載體為骨架，缺失載體上融合標(biāo)簽Trx序列的全新表達(dá)載體。該載體以人TRAIL突變體編碼cDNA序列直接連接于表達(dá)載體編碼閱讀框atg后，新的重組原核表達(dá)載體命名為pET/TRAIL(mutant)，其構(gòu)建流程如圖2所示。
2.1目的基因及載體的酶切取表達(dá)載體pET32a質(zhì)粒DNA及pGEM-T/TRAIL(mutant)質(zhì)粒DNA各25ul(1ug/ul)，以限制性核酸內(nèi)切酶Xba I和BamH I雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下pET32a質(zhì)粒DNA 25ul pGEM-T/TRAIL質(zhì)粒DNA 25ulXba I(10u/ul) 1ulXba I(10u/ul) 1ulBamH I(10u/ul) 1ulBamH I(10u/ul)1ul10×buffer 5ul10×buffer5ulddH2O 18ul ddH2O 18ul50ul 50ul37℃，酶切3h。各取2ul酶切產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳，若酶切完全，則采用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收載體及目的基因片斷，最后分別溶于30ul ddH2O中。
2.2目的基因與表達(dá)載體的連接、轉(zhuǎn)化，克隆篩選及鑒定取酶切回收的載體質(zhì)粒DNA0.5ul，置于1.5mlEppendorf管底部，再加入酶切回收的目的基因DNA片斷4.5ul，加入Takara公司DNA ligation Sol I 5ul，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物涂布于含100ug/ml Amp的固體LB培養(yǎng)基平板中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落加入5ml含100ug/ml Amp的液體LB培養(yǎng)基試管中，37℃培養(yǎng)6h。采用Omega公司質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定陽性的載體送上海博亞公司測序。將測序證實(shí)序列完全正確的質(zhì)粒命名為pET/TRAIL(mutant)，保存菌種。
3結(jié)果TRAIL突變體cDNA序列成功連接于原核表達(dá)載體pET32a，經(jīng)酶切及測序證實(shí)得到陽性重組質(zhì)粒pET/TRAIL(mutant)(酶切結(jié)果見圖3、測序結(jié)果見圖4)。
實(shí)施例三、重組pET/TRAIL(mutant)的BL21(DE3)工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵培養(yǎng)1材料表達(dá)大腸桿菌BL21(DE3)購自Novagen公司。質(zhì)粒抽提試劑盒，凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。70L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(D50)為B.Braun公司產(chǎn)品，細(xì)胞高壓均質(zhì)機(jī)(APV 1000)為AVP公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC2000)、垂直電泳系統(tǒng)(Power/Pac300)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
2方法2.1培養(yǎng)液的配制(1)種子液培養(yǎng)基3000mlTryptone30gYeast Extract 15gNaCl 30g加去離子水定容至3000ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基Tryptone240gYeast Extract 180gNaCl 200g加去離子水定容至35L，隨發(fā)酵罐在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(3)磷酸鹽緩沖液K2HPO4·3H2O200gKH2PO4100g加去離子水定容至1L，在121℃，1.034×105pa高壓蒸氣滅菌20min，隨接種時(shí)加入。
(4)補(bǔ)料培養(yǎng)基I葡萄糖 200g微量元素溶液100ml維生素溶液 100ml加去離子水定容至600ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(5)補(bǔ)料培養(yǎng)基II
葡萄糖400gYeast Extract 150gMgSO4.7H2O 50g加去離子水定容至1800ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(6)補(bǔ)料培養(yǎng)基III葡萄糖500gTryptone 300gYeast Extract 200gMgSO4.7H2O30g1MZnSO450ml加去離子水定容至3600ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
2.2菌種的轉(zhuǎn)化和活化將實(shí)施例2所得的陽性重組質(zhì)粒pET/TRAIL(mutant)重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選得到pET/TRAIL(mutant)BL21(DE3)工程菌，20％甘油-70℃保種。
取-70℃，20％甘油保存菌種pET/TRAIL(mutant)BL21(DE3)種子菌100ul，接種于50ml含100ug/ml Amp的液體LB培養(yǎng)基燒瓶中，32℃，220rpm培養(yǎng)至菌體密度A600為1-2后；再按1∶1000的比例接種于3000ml含100ug/ml Amp的種子培養(yǎng)基中，32℃，220rpm培養(yǎng)14h，成發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液全部接種于含35L培養(yǎng)液的B.Braun 70L發(fā)酵罐中。
誘導(dǎo)前培養(yǎng)階段溫度保持32℃，pH由氨水和鹽酸控制在7.0左右，溶解氧Do控制在30％以上。
接種后1h，監(jiān)測菌體密度A600超過0.5后，開始緩慢流加補(bǔ)料培養(yǎng)基I，速度控制在2.5h流加完畢。
監(jiān)測菌體密度A600約為6，且溶氧量Do、pH均明顯上升時(shí)，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基II，速度控制在2h內(nèi)流加完畢，且無葡萄糖積累。
待補(bǔ)料培養(yǎng)基II流加完畢、且溶氧量Do、PH均明顯上升，監(jiān)測菌體密度A600約為14-16時(shí)，即進(jìn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。
誘導(dǎo)培養(yǎng)階段溫度保持26-28℃，直至誘導(dǎo)結(jié)束。誘導(dǎo)開始時(shí)加入0.5mol/L的IPTG，且同時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基III，速度控制在3-4小時(shí)流加完畢，且保持無葡萄糖積累。
補(bǔ)料培養(yǎng)基III流加完畢，且溶氧量Do、PH均迅速上升時(shí)，發(fā)酵終止，收罐，離心收集菌體。
3結(jié)果菌體誘導(dǎo)起始密度A600值為14-16，誘導(dǎo)溫度為26-28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為3-4h時(shí)，共收集得到菌體總量約為4000g。表達(dá)的目的蛋白中70％為可溶性蛋白，此時(shí)可溶性目的蛋白占菌體可溶蛋白總量的比例為40％(見圖5)。經(jīng)文獻(xiàn)對比[8]，本發(fā)明技術(shù)與專利ZL 01105946.X采用相同表達(dá)載體和宿主細(xì)胞、表達(dá)氨基酸組成序列完全相同的目的多肽，僅通過編碼基因密碼子的改進(jìn)即能獲得更高的表達(dá)效率、且所得人TRAIL多肽具有更高的可溶性以及更高的活性(活性分析見試驗(yàn)例一)。
實(shí)施例四、重組pET/TRAIL(mutant)的ER2566工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵培養(yǎng)1材料表達(dá)大腸桿菌ER2566購自NEB公司。質(zhì)粒抽提試劑盒，凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。70L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(D50)為B.Braun公司產(chǎn)品，細(xì)胞高壓均質(zhì)機(jī)(APV 1000)為AVP公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC2000)、垂直電泳系統(tǒng)(Power/Pac300)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
2方法2.1培養(yǎng)液的配制(1)種子液培養(yǎng)基3000mlTryptone30gYeast Extract 15gNaCl 30g加去離子水定容至3000ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基Tryptone240gYeast Extract 180gNaCl 200g加去離子水定容至35L，隨發(fā)酵罐在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(3)磷酸鹽緩沖液
K2HPO4·3H2O200gKH2PO4100g加去離子水定容至1L，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min，隨接種時(shí)加入。
(4)補(bǔ)料培養(yǎng)基I葡萄糖 200g微量元素溶液 100ml維生素溶液 100ml加去離子水定容至600ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(5)補(bǔ)料培養(yǎng)基II葡萄糖 400gYeast Extrac 150gMgSO4.7H2O50g加去離子水定容至1800ml，在121℃，1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20min。
(6)補(bǔ)料培養(yǎng)基III葡萄糖 500gTryptone 300gYeast Extract200gMgSO4.7H2O 30g1MZnSO450ml加去離子水定容至3600ml，在121℃，1.034×105pa高壓蒸氣滅菌20min。
2.2菌種的轉(zhuǎn)化和活化將實(shí)施例2所得的陽性重組質(zhì)粒pET/TRAIL(mutant)重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，經(jīng)篩選得到pET/TRAIL(mutant)ER2566工程菌，20％甘油-70℃保種。
取-70℃，20％甘油保存菌種pET/TRAIL(mutant)ER2566種子菌100ul，接種于50ml含100ug/ml Amp的液體LB培養(yǎng)基燒瓶中，32℃，220rpm培養(yǎng)至菌體密度A600為1-2后；再按1∶1000的比例接種于3000ml含100ug/ml Amp的種子培養(yǎng)基中，32℃，220rpm培養(yǎng)14h，成發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液全部接種于含35L培養(yǎng)液的B.Braun 70L發(fā)酵罐中。
誘導(dǎo)前培養(yǎng)階段溫度保持32℃，pH由氨水和鹽酸控制在7.0左右，溶解氧Do控制在30％以上。
接種后1h，監(jiān)測菌體密度A600超過0.5后，開始緩慢流加補(bǔ)料培養(yǎng)基I，速度控制在2.5h流加完畢。
監(jiān)測菌體密度A600約為6，且溶氧量Do、pH均明顯上升時(shí)，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基II，速度控制在2h內(nèi)流加完畢，且無葡萄糖積累。
待補(bǔ)料培養(yǎng)基II流加完畢、且溶氧量Do、PH均明顯上升，監(jiān)測菌體密度A600約為14-16時(shí)，即進(jìn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)階段。
誘導(dǎo)培養(yǎng)階段溫度保持26-28℃，直至誘導(dǎo)結(jié)束。誘導(dǎo)開始時(shí)加入0.5mol/L的IPTG，且同時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基III，速度控制在3-4小時(shí)流加完畢，且保持無葡萄糖積累。
補(bǔ)料培養(yǎng)基III流加完畢，且溶氧量Do、PH均迅速上升時(shí)，發(fā)酵終止，收罐，離心收集菌體。
3結(jié)果菌體誘導(dǎo)起始密度A600值為14-16，誘導(dǎo)溫度為26-28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為3-4h時(shí)，共收集得到菌體總量約為4000g。經(jīng)檢測，表達(dá)的目的蛋白中60％為可溶性蛋白，此時(shí)可溶性目的蛋白占菌體可溶性蛋白總量的比例為35％(見圖5)。經(jīng)文獻(xiàn)對比，其表達(dá)效率和可溶性表達(dá)比例也顯著高于采用專利ZL01105946.X技術(shù)所得結(jié)果[8]。
實(shí)施例五.重組人TRAIL突變體的純化1材料層析介質(zhì)Chelating Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、CMSepharose Fast Flow及層析柱購自安瑪西亞(中國)有限公司，超濾系統(tǒng)(MINIHOLDER)為Millipore產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOC2000)、垂直電泳系統(tǒng)(Power/Pac300)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。
2方法2.1親和層析采用親和層析(Chelating Sepharose Fast Flow)。破菌液經(jīng)離心，取上清，上Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱，收集目的蛋白洗脫峰，得到純度超過80％的產(chǎn)品。
2.2陰離子交換層析采用陰離子交換層析(Q Sepharose Fast Flow)。取親和層析純化樣品上QSepharose Fast Flow陰離子交換柱，收集目的蛋白洗脫峰，得到純度大于90％的樣品。
2.3陽離子交換層析采用陽離子交換層析(CM Sepharose Fast Flow)。取陰離子交換層析純化樣品上CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，收集目的蛋白洗脫峰，得到純度大于99％的樣品。
3結(jié)果本實(shí)例采用B.Braun發(fā)酵罐得到的35L培養(yǎng)液可純化獲得目的蛋白10g，可用于重組人TRAIL多肽的規(guī)?；兓?見圖6)。
經(jīng)SDS-PAGE檢測，純化的重組人TRAIL多肽相對分子量為19.6KDa；經(jīng)非還原電泳及HPLC檢測，純度大于99％。
經(jīng)過western blot檢測，確定純化得到的重組人TRAIL多肽具有人TRAIL抗體特異性結(jié)合能力(見圖7)。
以下通過試驗(yàn)例對本發(fā)明有益效果作進(jìn)一步詳述，但不能認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)(ZL 01105946.X)的人TRAIL突變體多肽抗腫瘤活性對比試驗(yàn)1材料按現(xiàn)有技術(shù)(專利ZL 01105946.X)制備的重組人TRAIL突變體多肽對照品三批。
本發(fā)明重組人TRAIL突變體多肽樣品三批。
結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205、肺癌細(xì)胞NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231均來自ATCC。
DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)。
SRB染色液0.4％SRB，1％醋酸。
脫色液50％乙醇，50％蒸餾水，0.1％乙酸。
96孔培養(yǎng)板(NUNC公司)。
酶標(biāo)儀(model 550，BIO-RAD公司)。
2實(shí)驗(yàn)方法(1)將結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205、肺癌細(xì)胞NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231維持培養(yǎng)于含10％FBS、100Unit/ml的鏈霉素和青霉素、0.03％谷胺酰氨的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2。
(2)以15000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入系列濃度的受試樣品(10ug/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml，0.001μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
(3)采用SRB(Sulforhodamin B)染色法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測加入10％三氯乙酸，于4℃固定1h；用PBS洗兩次后用SRB染液(0.4％SRB，1％醋酸)染色30min，再用醋酸洗去未結(jié)合的染料，細(xì)胞于室溫干燥后加入10mmol/L Tris-Cl(PH10.5)作用5min，然后在490nm波長下測定光吸收值。
(4)計(jì)算GI50值(50％Growth inhibition concentration，半數(shù)生長抑制濃度)。
計(jì)算公式為抑制率％＝T-T0/Tc-TO其中T為給藥48小時(shí)后細(xì)胞個(gè)數(shù)(OD值)T0為對照組或試驗(yàn)組給藥前細(xì)胞個(gè)數(shù)(OD值)Tc為對照組培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞個(gè)數(shù)(OD值)然后根據(jù)測得的抑制率，采用回歸法求得半數(shù)生長抑制濃GI50。
3結(jié)果將相同純度的三批本發(fā)明提供的重組人TRAIL突變體多肽和三批按專利ZL01105946.X方法制備的重組人TRAIL突變體多肽進(jìn)行抗結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205、肺癌細(xì)胞NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231活性測定，其測定的GI50值見表3。
表3抗腫瘤細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)GI50值測定結(jié)果(ng/ml，x±s)

由上表可見，本發(fā)明提供的重組人TRAIL突變體多肽的GI值為ZL01105946.X重組人TRAIL突變體多肽的1/10到1/15，生物活性約為ZL01105946.X重組人TRAIL突變體多肽的10～15倍。
上述實(shí)例表明，本發(fā)明重組人TRAIL突變體多肽編碼cDNA與專利ZL01105946.X編碼cDNA在采用相同的表達(dá)載體(pET3a)，且表達(dá)菌(BL21)也相同的情況下表達(dá)編碼氨基酸序列相同的TRAIL突變體，僅通過編碼cDNA的序列的改變，即能獲得更高的表達(dá)效率和并提高可溶性表達(dá)的比例；同時(shí)本發(fā)明重組人TRAIL突變體編碼cDNA能夠在原核表達(dá)載體中大量表達(dá)生產(chǎn)活性為現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品10倍以上的人TRAIL突變體多肽。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)制備人TRAIL突變體多肽產(chǎn)率較低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本過高等困難。本發(fā)明對人TRAIL突變體的相關(guān)研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用將起極大的推動(dòng)作用，具有很好的應(yīng)用前景。
以上對本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變及變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均屬于本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍。
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一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用.ST25SEQUENCE LISTING<110>成都地奧制藥集團(tuán)有限公司<120>一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用<130>3538<160>26<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>504<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA<400>1atggttcgtg aacgtggtcg tgttgctgct cacatcactg gtactcgtgg tcgttctaac60actctttctt ctccgaactc taaaaacgaa aaagctcttg gtcgtaaaat caactcttgg 120gaatcttctc gttctggtca ctctttcctt tctaaccttc accttcgtaa cggtgaactt 180gttatccacg aaaaaggttt ctactacatc tactctcaga cttacttccg tttccaggaa 240gaaatcaaag aaaacactaa aaacgataaa cagatggttc agtacatcta caaatacact 300tcttacccgg acccgatcct tcttatgaaa tctgctcgta actcttgctg gtctaaagat 360gctgaatacg gtctttactc tatctaccag ggtggtatct tcgaacttaa agaaaacgat 420cgtatcttcg tttctgttac taacgaacac cttatcgata tggatcacga ggcttctttc 480ttcggtgctt tccttgttgg ttaa 504<210>2<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
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一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用.ST25<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA4<400>5ttggtcgtaa aatcaactct tgggaatctt ctcgttctgg tcactct47<210>6<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
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一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用.ST25<400>11tctatctacc agggtggtat cttcgaactt aaagaaaacg atcgta46<210>12<211>46<212>DNA<213>Artificial<220>
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一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用.ST25<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物7-8<400>20ttttagtgtt ttctttgatt tcttcctgga aacggaagta agtctga47<210>21<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA8-9<400>21cgggtaagaa gtgtatttgt agatgtactg aaccatctgt ttatcgt47<210>22<211>46<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA10-11<400>23aagataccac cctggtagat agagtaaaga ccgtattcag catctt 46<210>24<211>46<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA11-12
一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA及其制備方法和應(yīng)用.ST25<400>24ttcgttagta acagaaacga agatacgatc gttttcttta agttcg46<210>25<211>46<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA12-13<400>25agaaagcacc gaagaaagaa gcctcgtgat ccatatcgat aaggtg46<210>26<211>22<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>人TRAIL突變體編碼cDNA合成引物TA13-14<400>26ttcggatcct tattaaccaa ca 2權(quán)利要求
1.一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體的編碼cDNA，其特征在于它具有序列號(hào)為SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于含有如權(quán)利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體編碼cDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于所述載體是質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述質(zhì)粒是pET32a。
5.一種含有權(quán)利要求1所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體的編碼cDNA的宿主細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述原核細(xì)胞為大腸桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述大腸桿菌為BL21(DE3)或ER2566。
9.一種人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的編碼cDNA在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽，其特征在于所述的原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
11.一種制備權(quán)利要求9或10所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽的方法，其特征在于包括以下步驟a、合成具有序列號(hào)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的cDNA；b、用步驟a所得的cDNA構(gòu)建原核表達(dá)載體；c、用步驟b所得的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，制備得到工程菌；d、將所得工程菌進(jìn)行培養(yǎng)增殖，培養(yǎng)后收集菌體；e、破碎菌體，純化制備人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽。
12.權(quán)利要求9或10所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。
13.一種抗腫瘤藥物，是由權(quán)利要求9或10所述的人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體突變體多肽添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。
全文摘要
本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供了重新設(shè)計(jì)的重組人TRAIL突變體多肽編碼cDNA。將本發(fā)明重組人TRAIL突變體多肽編碼cDNA構(gòu)建成表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入常用的宿主細(xì)胞尤其是原核細(xì)胞中制備重組人TRAIL突變體多肽時(shí)，在比現(xiàn)有技術(shù)獲得更高的表達(dá)效率的同時(shí)還能提高可溶性表達(dá)的比例，制備得到的重組人TRAIL突變體多肽的活性也大大高于現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品活性弱的缺點(diǎn)，能大大降低人TRAIL突變體多肽的使用成本，實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)其在基礎(chǔ)研究和醫(yī)藥生產(chǎn)上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1958794SQ20051002199
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者陳守春, 陳毅榮, 徐琦, 劉玉應(yīng), 高小平, 劉忠榮, 李伯剛 申請人:成都地奧制藥集團(tuán)有限公司