專利名稱：微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物制備技術(shù)。涉及一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)11α羥基坎利酮的制備工藝，特別涉及以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，采取分批發(fā)酵技術(shù)制備11α羥基坎利酮的方法。
背景技術(shù)：
11α羥基坎利酮(11αOH Canrenone)，化學(xué)名孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，11，17-二羥基-3-氧-γ-內(nèi)酯。是合成依普利酮(Eplerenone)的重要醫(yī)藥中間體。依普利酮是由11α羥基坎利酮出發(fā)經(jīng)由六步化學(xué)反應(yīng)最終合成，主要用于治療充血性心衰(CHF)。
11α羥基坎利酮由坎利酮通過微生物轉(zhuǎn)化在11位上羥基得到。由于市場潛力巨大，很早就有了坎利酮11α羥化反應(yīng)的報道。
1971年，B.lunt等就已經(jīng)嘗試用坎利酮生產(chǎn)11α羥基坎利酮。在坎利酮投料量為0.5g/l時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90％。
1980年Deshayes在優(yōu)化后的條件下，1.5g/l坎利酮能得到95％的轉(zhuǎn)化率。這被認(rèn)為是該領(lǐng)域一個巨大的進(jìn)步，但其投料量不高，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
1996年，Ng；John S.等采用間歇補(bǔ)料，雖然投料量大為提高，但由于間歇補(bǔ)入碳源、氮源、抗生素(如鹽酸四環(huán)素，硫酸卡那霉素等)，使成本大大提高；而且過程中生物量不斷增長，菌體甚至?xí)┞队诳諝庵校瑪嚢柁D(zhuǎn)速500-1000rpm，給生產(chǎn)控制帶來相當(dāng)難度；轉(zhuǎn)化時間140-180h，由于轉(zhuǎn)化時間長，無形中加大了生產(chǎn)成本。
綜上所述，現(xiàn)有的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)11α羥基坎利酮生產(chǎn)工藝仍存在生產(chǎn)周期長，成本高，工藝復(fù)雜等問題，限制了該產(chǎn)品的推廣與應(yīng)用。所以研究和開發(fā)一種工藝簡單、經(jīng)濟(jì)實用的11α羥基坎利酮生產(chǎn)工藝是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的問題針對上述問題，本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有的微生物間歇補(bǔ)料發(fā)酵法，制備11α羥基坎利酮生產(chǎn)周期長、成本高、工藝復(fù)雜等問題；提供一種工藝簡單、投料量高、轉(zhuǎn)化過程中不需要補(bǔ)料、經(jīng)濟(jì)實用、適于大規(guī)模生產(chǎn)的11α羥基坎利酮的分批發(fā)酵法制備技術(shù)。
技術(shù)方案微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)11α羥基坎利酮的制備技術(shù)是以赭曲霉(AS3.4411)為生產(chǎn)菌種，坎利酮為底物，經(jīng)過產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養(yǎng)、二級發(fā)酵培養(yǎng)、底物轉(zhuǎn)化的分批發(fā)酵技術(shù)最終得到目標(biāo)產(chǎn)物，具體方法如下(1)產(chǎn)孢和生產(chǎn)用斜面制備生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，將該菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培養(yǎng)基或小米斜面上，25-28℃恒溫培養(yǎng)4-7天生成黃色孢子，覆蓋在斜面上，顏色為灰黃色，于PDA斜面背面可以觀察到紅色色素，然后轉(zhuǎn)接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培養(yǎng)基YPDA斜面上，25～28℃培養(yǎng)7-10天，可生成金黃色孢子，即生產(chǎn)用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏時間在15天以內(nèi)；(2)孢子懸液制備將5ml2％吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為4-8×108個/100ml；(3)一級種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基由碳源、氮源組成，用10％H3PO4(w/v)調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，每100ml種子培養(yǎng)基接入1ml孢子懸液，在搖床轉(zhuǎn)速150-200r/min下，25-30℃培養(yǎng)18～24h即得到適于接種的種子培養(yǎng)物；(4)二級發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、磷源組成，用10％HCl(w/v)調(diào)節(jié)pH至4.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min。將生長良好的種子培養(yǎng)液按2％～5％(v/v)的接種量接入到發(fā)酵罐中，在發(fā)酵過程中初始轉(zhuǎn)速為100～200r/min，通氣量為70～100L/h，罐壓為0.05～0.1Mpa，培養(yǎng)溫度25～28℃。通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培養(yǎng)18-22小時后，殘?zhí)墙抵?0-14g/L時，即得適宜于轉(zhuǎn)化的菌體培養(yǎng)液；(5)底物的轉(zhuǎn)化·發(fā)酵采用干粉投料，將底物進(jìn)行預(yù)處理，底物要預(yù)先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在轉(zhuǎn)化過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在10～30％，轉(zhuǎn)化60-70h；·檢測轉(zhuǎn)化60h之后，通過薄層層析TLC和高效液相HPLC檢測其轉(zhuǎn)化率，其中采用TLC方法分析時，選用展開系統(tǒng)為苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，采用HPLC分析時，選用C18柱，檢測波長為280nm，選用70-90％甲醇水或乙腈水作為流動相，當(dāng)轉(zhuǎn)化率高于90％后放罐。
需要說明的是
種子培養(yǎng)基由蛋白胨和酵母膏組成復(fù)合氮源，葡萄糖作為碳源，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；pH5.0～6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4構(gòu)成。其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；KH2PO41～5g/L；pH4.0～6.0；轉(zhuǎn)化時底 物粉碎粒度推薦為10-20。底物烘烤溫度60℃、轉(zhuǎn)化時間60-70h為宜。
轉(zhuǎn)化時采用TLC方法分析時，選用展開系統(tǒng)推薦為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；采用HPLC分析時，推薦選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。
坎利酮11α羥化反應(yīng)如下 坎利酮11α羥基坎利酮有益效果本發(fā)明提供一種投料量高、轉(zhuǎn)化過程中不需要補(bǔ)料、經(jīng)濟(jì)實用適于大規(guī)模生產(chǎn)的分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的生產(chǎn)技術(shù)。本工藝與以往間歇補(bǔ)料發(fā)酵法生產(chǎn)工藝相比，工藝簡單，從而降低了生產(chǎn)成本。菌體生物量達(dá)到峰值后持續(xù)下降，不存在菌體暴露于空氣中的現(xiàn)象，解決了發(fā)酵液上層菌體不能參與轉(zhuǎn)化反應(yīng)的缺點。由于過程簡單，染菌的機(jī)率很低，且轉(zhuǎn)化時間短。終了轉(zhuǎn)化率仍高于90％。本發(fā)明是一種新的、經(jīng)濟(jì)實用的、用生物技術(shù)生產(chǎn)11α羥基坎利酮方法，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有較大經(jīng)濟(jì)效益。
具體實施例方式
實施例1生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培養(yǎng)基)置于25℃恒溫培養(yǎng)7天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜面上，28℃培養(yǎng)5天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏10天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為4×108個/100ml。種子培養(yǎng)基由碳源、氮源組成，即葡萄糖20g/L；蛋白胨20g/L；酵母膏20g/L；pH6.0；用10％H3PO4(w/v)調(diào)節(jié)pH＝6，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養(yǎng)基接入1ml孢子懸液(4×108個)，在搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，28℃培養(yǎng)18h即得到適于接種的種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 20g/L；蛋白胨 20g/L；酵母膏 20g/L；KH2PO43.3g/L；pH 4.5；采用7L發(fā)酵罐，裝液量為4.5L。用10％HCl(w/v)調(diào)節(jié)pH至4.5，120～125℃滅菌20min。將生長良好的種子培養(yǎng)液按3％(v/v)的接種量(135ml)接入到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始轉(zhuǎn)速為100r/min，通氣量為70L/h，罐壓為0.05Mpa，28℃培養(yǎng)，過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養(yǎng)18h，殘?zhí)菨舛葹?0g/L時即可得到適合轉(zhuǎn)化的發(fā)酵培養(yǎng)物。采用干粉投料，要求底物粒度在30-50μ，投料前于80℃烘箱中烘3h之后投料。投67.5g底物坎利酮，轉(zhuǎn)化過程中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓維持溶解氧在20％左右。轉(zhuǎn)化60h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉(zhuǎn)化率，其中TLC方法分析，選用展開系統(tǒng)為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)。HPLC分析時選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉(zhuǎn)化率高于90％之后放罐。
實施例2
生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在小米斜面上置于28℃恒溫培養(yǎng)5天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜面上，26℃培養(yǎng)7天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏15天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為8×108個/100ml。
種子培養(yǎng)基由碳源、氮源組成，即葡萄糖 24g/L；蛋白胨 23g/L；酵母膏 16g/L；pH 6.0；用10％H3PO4(w/v)調(diào)節(jié)pH，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養(yǎng)基接入1ml孢子懸液(8×108個孢子)，在搖床轉(zhuǎn)速180r/min下，28℃培養(yǎng)18h即得到適于接種的種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 24g/L；蛋白胨 17g/L；酵母膏 22g/L；KH2PO42g/L；pH 4.0；將108g葡萄糖溶于270ml水中配制成40％溶液。110℃滅菌10～15min。將蛋白胨76.5g，酵母膏99g，KH2PO49g溶于4.23L水中。用10％HCl(w/v)調(diào)節(jié)pH 4.0后裝于7L罐中。120～125℃滅菌25min。將生長良好的種子培養(yǎng)液按5％(v/v)的接種量(225ml)連同葡萄糖接入到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始轉(zhuǎn)速為200r/min，通氣量為100L/h，罐壓為0.1Mpa，26℃培養(yǎng)，過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養(yǎng)24h，殘?zhí)菨舛葹?4g/L時即可得到適合轉(zhuǎn)化的發(fā)酵培養(yǎng)物。采用干粉投料，要求底物粒度在10-20μ，投料前于60℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。投料后通過補(bǔ)加20％(w/v)NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，轉(zhuǎn)化過程中通過補(bǔ)加NaOH或HCl維持pH在6.0左右。轉(zhuǎn)化過程中維持溶解氧在20％左右。轉(zhuǎn)化70h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉(zhuǎn)化率，TLC分析時選用展開系統(tǒng)為氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)。HPLC分析時選用70％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉(zhuǎn)化率高于90％之后放罐。
實施例3生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，該菌在PDA斜面(葡萄糖土豆汁斜面培養(yǎng)基)上置于28℃恒溫培養(yǎng)7天生成黃色孢子。覆蓋在PDA斜面上，顏色為灰黃色，于斜面背面可以觀察到紅色色素。然后轉(zhuǎn)接在YPDA斜面上，28℃培養(yǎng)7天，可生成金黃色孢子。于4℃冰箱中保藏，保藏20天后使用。將5ml2％吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為6×108個/100ml。
種子培養(yǎng)基由碳源、氮源組成，即葡萄糖 16g/L；蛋白胨 22g/L；酵母膏 15g/L；pH 5.0；用10％H3PO4(w/v)調(diào)節(jié)pH＝5，120～125℃滅菌15min。每100ml種子培養(yǎng)基接入1ml孢子懸液(6×108個孢子)，在搖床轉(zhuǎn)速200r/min下，28℃培養(yǎng)20h即得到適于接種的種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 16g/L；蛋白胨 17g/L；酵母膏 22g/L；KH2PO44g/L；pH 5.5；7L發(fā)酵罐裝液量為4.5L。用10％HCl(w/v)調(diào)節(jié)pH，120～125℃滅菌20min。將生長良好的種子培養(yǎng)液按5％(v/v)的接種量(225ml)接入到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為80L/h，罐壓為0.1Mpa，26℃培養(yǎng)，過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，通氣量，罐壓來維持溶解氧在30％左右。培養(yǎng)20h，殘?zhí)菨舛葹?3g/L時即可得到適合轉(zhuǎn)化的發(fā)酵培養(yǎng)物。采用干粉投料，要求底物粒度在20-30μ，投料前于70℃烘箱中烘4h之后投料。投90g底物坎利酮。轉(zhuǎn)化過程中維持溶解氧在20％左右。轉(zhuǎn)化70h之后，取樣通過TLC和HPLC檢測轉(zhuǎn)化率，選用展開系統(tǒng)為氯仿∶乙酸乙酯＝4∶1(v/v)。HPLC分析時選用85％甲醇水(v/v)作為流動相。檢測波長為280nm，選用C18柱。待轉(zhuǎn)化率高于90％之后放罐。
權(quán)利要求
1.微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉(AS 3.4411)為生產(chǎn)菌種，坎利酮為底物，經(jīng)過產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養(yǎng)、二級發(fā)酵培養(yǎng)、底物轉(zhuǎn)化的分批發(fā)酵技術(shù)最終得到目標(biāo)產(chǎn)物，具體方法如下(1)產(chǎn)孢和生產(chǎn)用斜面制備生產(chǎn)菌種為赭曲霉(AS 3.4411)，將該菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培養(yǎng)基或小米斜面上，25-28℃恒溫培養(yǎng)4-7天生成黃色孢子，覆蓋在斜面上，顏色為灰黃色，于PDA斜面背面可以觀察到紅色色素，然后轉(zhuǎn)接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培養(yǎng)基YPDA斜面上，25～28℃培養(yǎng)7-10天，可生成金黃色孢子，即生產(chǎn)用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏時間在20天以內(nèi)；(2)孢子懸液制備將5ml2％吐溫80溶液加入生產(chǎn)斜面中，洗下孢子，計數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為4-8×108個/100ml；(3)一級種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基由碳源、氮源組成，用10％H3PO4(w/v)調(diào)節(jié)pH 5.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，每100ml種子培養(yǎng)基接入1ml孢子懸液，在搖床轉(zhuǎn)速150-200r/min下，25-30℃培養(yǎng)18～24h即得到適于接種的種子培養(yǎng)物；(4)二級發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、磷源組成，用10％HCl(w/v)調(diào)節(jié)pH4.0～6.0，120～125℃滅菌15～25min，將生長良好的種子培養(yǎng)液按2％～5％(v/v)的接種量接入到發(fā)酵罐中，在發(fā)酵過程中初始轉(zhuǎn)速為100～200r/min，通氣量為70～100L/h，罐壓為0.05～0.1Mpa，培養(yǎng)溫度25～28℃，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培養(yǎng)18-22小時后，殘?zhí)墙抵?0-14g/L時，即得適宜于轉(zhuǎn)化的菌體培養(yǎng)液；(5)底物的轉(zhuǎn)化·發(fā)酵采用干粉投料，將底物進(jìn)行預(yù)處理，底物要預(yù)先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在轉(zhuǎn)化過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在10～30％，轉(zhuǎn)化60-70h；·檢測轉(zhuǎn)化60h之后，通過薄層層析TLC和高效液相HPLC檢測其轉(zhuǎn)化率，其中TLC方法分析時，選用展開系統(tǒng)為苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，HPLC分析時選用C18柱，檢測波長為280nm，選用70-90％甲醇水或乙腈水作為流動相，當(dāng)轉(zhuǎn)化率高于90％后放罐。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方，其特征在于種子培養(yǎng)基由蛋白胨和酵母膏組成復(fù)合氮源，葡萄糖作為碳源，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；pH5.0～6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏及KH2PO4構(gòu)成，其組成含量為葡萄糖16～26g/L；蛋白胨15～23g/L；酵母膏16～24g/L；KH2PO41～5g/L；pH4.0～6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化時，底物粉碎粒度為10-20μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化時底物烘烤溫度為60℃，轉(zhuǎn)化時間為60-70h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化時TLC方法分析，選用展開系統(tǒng)為苯∶丙酮＝4∶1(v/v)或氯仿∶乙酸乙酯＝3∶2(v/v)；HPLC分析時選用80％甲醇水(v/v)作為流動相。
全文摘要
微生物分批發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備11α羥基坎利酮的方法，屬于微生物制備技術(shù)，涉及一種以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，采取分批發(fā)酵技術(shù)制備11α羥基坎利酮的方法。本發(fā)明解決了微生物間歇補(bǔ)料法制備11α羥基坎利酮生產(chǎn)周期長、工藝復(fù)雜，轉(zhuǎn)化過程中需補(bǔ)加碳源、氮源及抗生素，不僅成本高，而且由于轉(zhuǎn)化過程中生物量不斷增長，菌體甚至?xí)┞队诳諝庵?，給生產(chǎn)控制帶來相當(dāng)難度等問題。其技術(shù)方案是以赭曲霉為菌種，坎利酮為底物，經(jīng)產(chǎn)孢和生產(chǎn)斜面制備、孢子懸液制備、一級種子培養(yǎng)、二級發(fā)酵培養(yǎng)、底物轉(zhuǎn)化的分批發(fā)酵技術(shù)制得。本發(fā)明工藝簡單、轉(zhuǎn)化時間短、染菌幾率低、轉(zhuǎn)化率高于90％，從而為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有較大經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12R1/66GK1727494SQ20051001467
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者杜連祥, 路福平, 王敏, 趙玉金, 戚薇, 別松濤 申請人:天津科技大學(xué)