專利名稱：果蔬生物誘抗保鮮劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品保鮮技術(shù)及用品，特別涉及一種果蔬生物誘抗保鮮劑及其生產(chǎn)過程以及在新鮮果蔬保鮮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果蔬采后病原菌引起的腐爛已經(jīng)成為限制果蔬采后產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，據(jù)統(tǒng)計，目前全世界果蔬采后腐爛占果蔬總量的20-30％。目前主要采用化學(xué)殺菌劑結(jié)合冷藏的方法防治果蔬采后病原菌引起的腐爛。然而，化學(xué)殺菌劑對人體健康和環(huán)境均有害，其使用逐漸受到控制，生物保鮮技術(shù)逐漸受到人們的重視。
近年來，有人研究利用特定植物的提取物作為防腐保鮮劑用來防腐保鮮，但是這種方法成本太高，在具體生產(chǎn)實(shí)踐中難以推廣；許多微生物拮抗菌誘導(dǎo)寄主組織的防御反應(yīng)也成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)，但是由于拮抗菌對營養(yǎng)條件要求苛刻，環(huán)境條件常常影響到它的保鮮效果，而且難以規(guī)?；a(chǎn)。采用特定誘導(dǎo)抗病劑提高植物抗病性的研究近年來逐漸受到重視。目前關(guān)于誘導(dǎo)抗病劑的研究與應(yīng)用主要集中于農(nóng)作物生長階段，主要成分有殼聚糖、水楊酸、一些化學(xué)合成的物質(zhì)等。然而目前，還沒有一種有效的，成本較低的且町以規(guī)?；a(chǎn)的在果蔬采后貯藏保鮮中應(yīng)用的生物誘抗保鮮劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種果蔬生物誘抗保鮮劑。它是從果蔬采后病原菌中提取一種生物誘抗保鮮劑及制作方法，適用于多種水果蔬菜的保鮮。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種果蔬生物誘抗保鮮劑，其特征在于，其主要組分為果蔬致病真菌菌絲體提取低聚糖10％、表面活性劑2％，其余為水。
低聚糖由以下方法取得的物質(zhì)1.灰霉菌(Botrytis cinerea)、鏈格孢(Alternaria spp.)接種于PDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)一周。
PDA培養(yǎng)基成分馬鈴薯200g 瓊脂18～20g 葡萄糖20g2.從菌落邊緣打取直徑為5mm左右的菌餅轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)五天。接種量7塊/200ml，轉(zhuǎn)速為110r/min。
液體培養(yǎng)基硝酸鉀2.00g 磷酸氫二鉀1.00g氯化鉀0.05g 七水合硫酸鎂 0.50g硫酸亞鐵 0.01g 蔗糖 30.00g蒸餾水1000ml 土豆汁400g3.用玻璃抽濾器抽濾獲取菌絲體，用4L去離子水清洗數(shù)次，同時用4L100mmol/L磷酸鈉(pH7.2)清洗，用0.5mol/L磷酸鉀(pH7.2)清洗數(shù)次，再用蒸餾水清洗，隨后用2L體積比為1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗。
4.菌絲體經(jīng)超聲波搗碎機(jī)多次搗碎獲取的菌絲體細(xì)胞壁。
5.細(xì)胞壁提取物按1∶100(w/v)與無離子水混合，在高壓滅菌鍋中保持3小時，冷卻后在11200×g條件下離心20min。
6.上清液用0.22um的微孔濾膜過濾.上清液中主要成分即低聚糖，也是誘抗劑，也稱為激發(fā)子，貯存于冰箱備用。
表面活性劑為吐溫80。
工業(yè)化發(fā)酵技術(shù)工藝從經(jīng)濟(jì)、實(shí)用角度，綜合考慮，通過對大批量發(fā)酵試驗(yàn)條件優(yōu)化，篩選出該低聚糖，也是誘抗劑，也稱激發(fā)子批量生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基組分為酵母粉 0.35％蛋白胨0.15％黃豆粉 4.0％ 蔗糖 2.5％土豆汁 20％ K2HPO40.5％MgSO40.05％先培養(yǎng)菌種，從菌落邊緣打取直徑為5mm左右的菌餅轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天；接種量7塊/200ml，轉(zhuǎn)速為110rpm，隨后取500mL液體培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入15升發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基成分見上)，30℃，培養(yǎng)3天，通氣量為8L/min，pH6.8，攪拌速度為280rpm，發(fā)酵過程中每隔24h經(jīng)兩次流加，液體接種量分別為200mL和100mL，培養(yǎng)結(jié)束后對菌絲體進(jìn)行抽濾，按照以上低聚糖由以下方法取得的物質(zhì)取得方法中的3-6步驟獲取激發(fā)子。發(fā)酵罐生成菌絲體回收率可達(dá)到8.76g/L，跟三角瓶液體培養(yǎng)菌絲體回收率相差不多。在發(fā)酵罐生長過程中，發(fā)酵時間比三角瓶發(fā)酵時間短，產(chǎn)率沒有三角瓶發(fā)酵高跟發(fā)酵過程中的通氣量不同有一定關(guān)系，在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)污染沒有三角瓶發(fā)酵污染機(jī)率低。所以，本專利所采用的菌種可以在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵批量生產(chǎn)，不但對激發(fā)子產(chǎn)量影響不大，還加快了菌體生長，可以進(jìn)行批量規(guī)?；a(chǎn)。
本果蔬生物誘抗保鮮劑使用于果蔬的果實(shí)、莖、葉的貯藏保鮮，于果蔬的采收前噴霧或采收后噴霧、浸蘸處理，提高果蔬對主要采后病原真菌灰霉菌、鏈格孢等的抗病性，減少貯藏過程中的常見病原菌引起的腐爛，延長果蔬貯藏保鮮時間。
生物誘抗劑的誘抗活性測定及定量分析我們通過大豆子葉法測定所制備的誘抗劑活性進(jìn)行測定，測定結(jié)果表明(以中性糖濃度為標(biāo)準(zhǔn))75ug/ml處的激發(fā)子誘抗活性最高，而且其誘抗活性隨著濃度的加大而有所下降。其糖組分如下其中性糖濃度為1.28mg/ml，占細(xì)胞壁重量的25.6％；氨基葡萄糖濃度為0.387mg/ml，占細(xì)胞壁重量的7.74％；還原糖濃度為1.17mg/ml占細(xì)胞壁重量的23.4％。我們通過柱層析及高壓液相色譜對誘抗劑組分進(jìn)行定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要組分為不同聚合度寡聚糖(也稱低聚糖)，寡聚糖是由不同的單糖聚合而成，通過對寡糖水解發(fā)現(xiàn)單糖為葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖和木糖的組成，其摩爾比為1∶3∶6∶2∶1。
生物誘抗劑的保鮮效應(yīng)此誘抗劑應(yīng)用于多種果蔬的保鮮上均取得了較理想的保鮮效果，能夠有效的誘導(dǎo)提高果蔬對采后病原菌的抗病性。下面我們以其在葡萄的保鮮效應(yīng)為例進(jìn)行說明生物誘抗劑在葡萄果粒上的保鮮效應(yīng)通過對葡萄果皮上抗病性相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶活性，過氧化物酶，多酚氧化酶的活性測定，結(jié)果顯示誘抗劑處理后果皮的酶活性明顯高于清水對照處理。同時我們也測定果皮抗病物質(zhì)的含量，結(jié)果表明誘抗劑處理過的果皮木質(zhì)素和酚類物質(zhì)含量明顯高于清水對照處理。葡萄儲藏90天后我們對其自然發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示對照的發(fā)病率56.78％，發(fā)病指數(shù)為4.66；誘抗劑處理過的發(fā)病率為19.78％，發(fā)病指數(shù)為1.04。人工接種癇原菌后的調(diào)查結(jié)果顯示對照一天后就開始發(fā)病，而激發(fā)子處理后的4天后才開始發(fā)病，7天后對照全部發(fā)病，病情指數(shù)為4.32；激發(fā)子處理后的發(fā)病率為38％，發(fā)病指數(shù)為1.11，這些結(jié)果表明誘抗劑在葡萄果粒防腐保鮮上取得的較好的效果，不僅延緩了發(fā)病時間，而且降低了發(fā)病率和病情指數(shù)。
生物誘抗劑在葡萄果梗上的保鮮效應(yīng)通過對葡萄果梗上抗病性相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶活性，過氧化物酶，多酚氧化酶的活性測定，結(jié)果顯示誘抗劑處理后果梗的酶活明顯高于清水對照處理。同時我們也測定果皮的抗病物質(zhì)含量，結(jié)果表明誘抗劑處理過果梗的木質(zhì)素和酚類物質(zhì)含量明顯高于清水對照處理。葡萄儲藏90天后我們對其自然發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查顯示對照的發(fā)病率67.33％，發(fā)病指數(shù)為4.12；誘抗劑處理過的發(fā)病率為13.78％，發(fā)病指數(shù)為1.56。人工接種病原菌后的調(diào)查結(jié)果顯示對照一天后就開始發(fā)病，而激發(fā)子處理的5天后才開始發(fā)病，10天后對照全部發(fā)病，病情指數(shù)為3.89；激發(fā)子處理后的發(fā)病率為18％，發(fā)病指數(shù)為1.03，這些結(jié)果表明誘抗劑不但在葡萄果粒上取得了較好防腐保鮮效果，而且在果梗也上取得的較好的效果。
誘抗劑對葡萄品質(zhì)的影響通過測定葡萄果粒的含糖量，含酸量，細(xì)胞膜透性和果梗葉綠素發(fā)現(xiàn)誘抗劑處理過的葡萄果粒含糖量高于對照，含酸量和細(xì)胞膜透性低于對照，果梗葉綠素含量在整個儲藏期間明顯高于對照，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明誘抗劑在一定程度上提高果蔬品質(zhì)。
技術(shù)特點(diǎn)1.生產(chǎn)工藝簡單，易于操作2.成本低廉，可工廠化大批量生產(chǎn)3.施用方法簡單，受外界環(huán)境影響較小4.不但可誘導(dǎo)采后果蔬采后誘導(dǎo)抗性，而且無污染，無公害，無毒副作用，使用方便，安全5.貯藏保鮮效應(yīng)好，可以延緩果蔬衰老，捉高果蔬品質(zhì)。
6.使用方式采收前一周配成50～200μg/ml濃度，對果實(shí)或莖、葉等進(jìn)行噴霧處理。也可以在采收后用相同濃度的誘導(dǎo)抗病劑進(jìn)行浸蘸或噴霧處理。
具體實(shí)例一種果蔬生物誘抗保鮮劑，其主要組分為果蔬致病真菌菌絲體提取低聚糖10％、表面活性劑2％，其余為水。
低聚糖由以下方法取得的物質(zhì)
1、灰霉菌(Botrytis cinerea)、鏈格孢(Alternaria spp.)接種于PDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)一周。
PDA培養(yǎng)基成分馬鈴薯200g 瓊脂18～20g 葡萄糖20g2、從菌落邊緣打取直徑為5mm左右的菌餅轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)五天。接種量7塊/200ml，轉(zhuǎn)速為110r/min。
液體培養(yǎng)基硝酸鉀 2.00g 磷酸氫二鉀1.00g氯化鉀 0.05g 七水合硫酸鎂 0.50g硫酸亞鐵 0.01g 蔗糖 30.00g蒸餾水 1000ml 土豆汁400g3.用玻璃抽濾器抽濾獲取菌絲體，用4L去離子水清洗數(shù)次，同時用4L100mmol/L磷酸鈉(pH7.2)清洗，用0.5mol/L磷酸鉀(pH7.2)清洗數(shù)次，再用蒸餾水清洗，隨后用2L體積比為1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗。
4.菌絲體經(jīng)超聲波搗碎機(jī)多次搗碎獲取的菌絲體細(xì)胞壁。
5.細(xì)胞壁提取物按1∶100(w/v)與無離子水混合，在高壓滅菌鍋中保持3小時，冷卻后在11200×g條件下離心20min.
6.上清液用0.22um的微孔濾膜過濾.上清液中主要成分即低聚糖，也是誘抗劑，也稱為激發(fā)子，貯存于冰箱備用。
低聚糖，也是誘抗劑，也稱激發(fā)子批量生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)基組分為酵母粉 0.35％ 蛋白胨0.15％黃豆粉 4.0％ 蔗糖 2.5％土豆汁 20％K2HPO40.5％MgSO40.05％先培養(yǎng)菌種，從菌落邊緣打取直徑為5mm左右的菌餅轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天；接種量7塊/200ml，轉(zhuǎn)速為110rpm，隨后取500mL液體培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入15升發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基成分見上)，30℃，培養(yǎng)3天，通氣量為8L/min，pH6.8，攪拌速度為280rpm，發(fā)酵過程中每隔24h經(jīng)兩次流加，液體接種量分別為200mL和100mL，培養(yǎng)結(jié)束后對菌絲體進(jìn)行抽濾，按照以上低聚糖由以下方法取得的物質(zhì)取得方法中的3-6步驟獲取激發(fā)子。
使用實(shí)施例實(shí)例1生物誘抗保鮮劑劑對葡萄的保鮮效果
采前一周用100μg/ml生物誘抗保鮮劑對葡萄果實(shí)進(jìn)行噴霧處理，采收后及時預(yù)冷，按照目前生產(chǎn)中葡萄貯藏保鮮的常規(guī)保鮮工藝，葡萄保鮮期可延長20天，腐爛率降低10％。
實(shí)例2生物誘抗劑對蒜薹的保鮮效果采前一周用150μg/ml生物誘抗保鮮劑對蒜薹進(jìn)行噴霧處理，貯藏保鮮過程中定期與專用保鮮劑配伍噴霧處理，貯藏8個月后，腐爛率比未經(jīng)該生物誘導(dǎo)抗病保鮮劑處理的蒜薹降低15％，保鮮期可延長一個月。
實(shí)例3生物誘抗劑對西紅柿的保鮮效果采前用150μg/ml生物誘抗保鮮劑對西紅柿果實(shí)進(jìn)行噴霧處理，或者貯藏前用100μg/ml浸蘸處理，貯藏30天時灰霉病發(fā)病率比未經(jīng)該生物誘導(dǎo)抗病保鮮劑處理降低20％，保鮮期可延長10天。
權(quán)利要求
1.一種果蔬生物誘抗保鮮劑，其特征在于，其主要組分為果蔬致病真菌菌絲體提取的低聚糖10％、表面活性劑2％，其余為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果蔬生物誘抗保鮮劑，其特征在于低聚糖它是由以下方法取得的物質(zhì)1).將灰霉菌Botrytis cinerea、鏈格孢Alternaria spp.接種于PDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)一周；2).從菌落邊緣打取直徑為5mm左右的菌餅轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)五天；接種量7塊/200ml，轉(zhuǎn)速為110r/min；液體培養(yǎng)基硝酸鉀 2.00g磷酸氫二鉀 1.00g氯化鉀 0.05g七水合硫酸鎂0.50g硫酸亞鐵0.01g蔗糖30.00g蒸餾水 1000ml 土豆汁 400g3).用玻璃抽濾器抽濾獲取菌絲體，用4L去離子水清洗數(shù)次，同時用其pH7.2的4L100mmol/L磷酸鈉，清洗，用pH7.2的0.5mol/L磷酸鉀用清洗數(shù)次，再用蒸餾水清洗，隨后用2L體積比為1∶1的氯仿，甲醇混合液清洗，最后再用丙酮清洗；4).菌絲體經(jīng)超聲波搗碎機(jī)多次搗碎獲取的菌絲體細(xì)胞壁；5).細(xì)胞壁提取物按1∶100w/v與無離子水混合，在高壓滅菌鍋中保持3小時，冷卻后在11200×g條件下離心20min；6).上清液用0.22um的微孔濾膜過濾，濃縮，濃縮液即為果蔬生物誘抗保鮮劑主要低聚糖成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果蔬生物誘抗保鮮劑，其特征在于培養(yǎng)基組分為酵母粉 0.35％蛋白胨 0.15％黃豆粉 4.0％ 蔗糖 2.5％土豆汁 20％ K2HPO40.5％MgSO40.05％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果蔬生物誘抗保鮮劑，其特征在于表面活性劑為吐溫80。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的果蔬生物誘抗保鮮劑使用于果蔬的果實(shí)、莖、葉的貯藏保鮮，于果蔬的采收前噴霧或采收后噴霧、浸蘸處理，提高果蔬對主要采后病原真菌灰霉菌、鏈格孢等的抗病性，減少貯藏過程中的常見病原菌引起的腐爛，延長果蔬貯藏保鮮時間。
全文摘要
果蔬生物誘抗保鮮劑，由低聚糖10％、表面活性劑2％，水組成。從果蔬采后主要致病真菌灰霉菌、鏈格孢發(fā)酵后的菌絲體中提取，主要組分為不同聚合度低聚糖，低聚糖是由不同的單糖聚合而成，單糖為葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖和木糖的組成，其摩爾比為1∶3∶6∶2∶1。并含有表面活性劑、穩(wěn)定劑。作為生防制劑，在采收前、采收后使用能夠誘導(dǎo)新鮮果蔬抗病性反應(yīng)，直接提高果蔬對病原菌的抗性，用于防治果蔬采后灰霉菌、鏈格孢等病原真菌引起的腐爛。本發(fā)明屬生物技術(shù)在果蔬采后病害腐爛防治上的應(yīng)用，其生產(chǎn)工藝成熟，生產(chǎn)和使用的成本低廉，為果蔬采后防腐保鮮提供了高效、無毒的無公害生物誘導(dǎo)抗病保鮮劑，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A23B7/00GK1883280SQ20051001390
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者關(guān)文強(qiáng), 閻瑞香, 李寧, 胡云峰, 井澤良 申請人:國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)