專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的新發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
早在1936年就發(fā)現(xiàn)了普魯蘭多糖(pulullan)，后來(lái)用液體培養(yǎng)出芽短梗霉并分離出普魯蘭多糖。一直到六十年代，人們才開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵、提取和應(yīng)用等方面的研究，1978年日本林原公司實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)普魯蘭多糖。普魯蘭是由出芽短梗霉(Aureobasidium pulullans)利用糖質(zhì)化合物為基質(zhì)進(jìn)行好氣發(fā)酵生產(chǎn)的胞外多糖，基本結(jié)構(gòu)是由α-1，6-糖苷鍵連接的聚麥芽三糖，其分子量為幾千到上百萬(wàn)。它無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒，在水中有極好的溶解性，有很好的粘接性能和成膜成纖維性能，制成的膜透氣性很低，因此，在醫(yī)藥、食品、輕工、化工等許多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外用于普魯蘭生產(chǎn)的菌種均為出芽短梗霉，在以葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、蔗糖、淀粉及淀粉水解物為碳源；酵母膏、玉米漿為有機(jī)氮源，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間一般在120-156小時(shí)左右，產(chǎn)物得率20％上下，普魯蘭多糖平均分子量一般在2-20萬(wàn)之間。林原公司工業(yè)化生產(chǎn)的商品普魯蘭多糖平均分子量為20萬(wàn)。通常發(fā)酵產(chǎn)物分子量大時(shí)，得率較低，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。發(fā)酵產(chǎn)物分子量小時(shí)，得率較高，發(fā)酵時(shí)間短。但小分子量的產(chǎn)物，無(wú)論是粘連性、成膜性和成纖維性均差，其應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過(guò)精制氮源替代普通氮源來(lái)提高發(fā)酵得率，同時(shí)控制發(fā)酵時(shí)間生產(chǎn)不同平均分子量的普魯蘭多糖。以獲得其粘連性、成膜性和成纖維性等性狀不同的普魯蘭多糖，來(lái)解決生產(chǎn)和應(yīng)用的問(wèn)題。
本發(fā)明生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法，通過(guò)下述步驟予以實(shí)現(xiàn)，a.準(zhǔn)備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(wt％)蔗糖2.0-4.0，精制氮源0.2，磷酸二氫鉀0.1-0.8，硫酸銨0.1-0.5，硫酸鎂0.1-1.0，PH值6.0-6.2，121℃滅菌，25分鐘；b.取出芽短梗霉菌種接在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級(jí)種子、二級(jí)種子、種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；c.準(zhǔn)備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(wt％)蔗糖或DE值為40-60的淀粉水解物3.0-5.0，精制氮源0.2-0.5，磷酸二氫鉀0.2-1.0，硫酸銨0.1-0.5，硫酸鎂0.1-1.0，發(fā)酵復(fù)加溶液20-50，PH值6.0-6.2，121℃滅菌，25分鐘；d.將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％-10％，發(fā)酵攪拌速度為200-300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為0.5-1.0(V/V)，罐壓為0.01-0.02Mpa；e.在發(fā)酵進(jìn)行到16小時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加碳源，每隔8-12小時(shí)流加一次，流加體積為發(fā)酵體積的2％，流加液為含有蔗糖或DE值為40-60的淀粉水解物30-50％、尿素或氨水0.5-1.0％的水溶液；f.連續(xù)流加5-7次碳源后，再繼續(xù)發(fā)酵16-56小時(shí)；g.將上述發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，得到分子量3000-4000以上的普魯蘭多糖。
本發(fā)明精制氮源通過(guò)下述步驟得到將玉米漿或酵母膏稀釋5-10倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持30-45分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于12000-15000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為30-50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
本發(fā)明最后的發(fā)酵液膜分離后分子量3000-4000以下的通過(guò)去離子、脫色后得到發(fā)酵復(fù)加溶液用于配制發(fā)酵初始培養(yǎng)基。
本發(fā)明與以往其他技術(shù)相比發(fā)酵時(shí)間明顯縮短，發(fā)酵時(shí)間為80-120小時(shí)，提高了生產(chǎn)強(qiáng)度，產(chǎn)物得率也有較大提高，發(fā)酵結(jié)束產(chǎn)物得率在35％以上，產(chǎn)物平均分子量可根據(jù)發(fā)酵時(shí)間來(lái)選擇，所獲得的普魯蘭多糖平均分子量在20-60萬(wàn)道爾頓之間。更重要的是發(fā)酵液充分重復(fù)利用不但節(jié)省了原料投入總量，提高產(chǎn)物得率；而且解決了發(fā)酵液廢水排放問(wèn)題，避免了環(huán)境污染。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將玉米漿或酵母膏稀釋5倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持30分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于12000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為30℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成每升為(L)蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按7.5％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液2.4升，其組成每升為(L)蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)蔗糖30g，精致氮源3g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨3g，硫酸鎂4g，發(fā)酵復(fù)加溶液300mL，PH值6.1，121℃滅菌，25分鐘。按10％接種量將32升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔8小時(shí)流加6.4升的含有50％的蔗糖和1％的尿素水溶液，到發(fā)酵64小時(shí)時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到80小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率36.6％，產(chǎn)物平均分子量20萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例2將玉米漿或酵母膏稀釋8倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持40分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于13000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為30-50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成每升為(L)蔗糖20g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀1g，硫酸銨1g，硫酸鎂1g，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按7.5％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液2.4升，其組成每升為(L)蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.1，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)蔗糖30g，精致氮源2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸銨1g，硫酸鎂1g，發(fā)酵復(fù)加溶液400mL，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘.按10％接種量將32升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔8小時(shí)流加6.4升的含有50％的蔗糖和1％的尿素水溶液，到發(fā)酵64小時(shí)時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到104小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率37.8％，產(chǎn)物平均分子量35萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例3將玉米漿或酵母膏稀釋7倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持45分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于14000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成每升為(L)蔗糖40g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀8g，硫酸銨5g，硫酸鎂10g，PH值6.2，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按7.5％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液2.4升，其組成每升為(L)蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)蔗糖50g，精致氮源5g，磷酸二氫鉀10g，硫酸銨5g，硫酸鎂10g，發(fā)酵復(fù)加溶液500mL，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。按10％接種量將32升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔12小時(shí)流加10升的含有33％的蔗糖和0.6％的尿素水溶液，到發(fā)酵76小時(shí)時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到120小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率38.0％，產(chǎn)物平均分子量55萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例4將玉米漿或酵母膏稀釋9倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持45分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于15000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為45℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按10％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液3.2升，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.1，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨3g，硫酸鎂4g，發(fā)酵復(fù)加溶液300mL，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。按8％接種量將25.6升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔8小時(shí)流加6.4升的含有50％的DE值為40-60的淀粉水解物和1％的尿素水溶液，到發(fā)酵64小時(shí)時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到80小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率35.8％，產(chǎn)物平均分子量23萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例5將玉米漿或酵母膏稀釋6倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持35分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于14000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按10％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液3.2升，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨3g，硫酸鎂4g，發(fā)酵復(fù)加溶液400mL，PH值6.2，121℃滅菌，25分鐘。按5％接種量將16升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔8小時(shí)流加6.4升的含有50％的DE值為40-60的淀粉水解物和1％的尿素水溶液，到發(fā)酵64小時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到104小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率36.2％，產(chǎn)物平均分子量38萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例6將玉米漿或酵母膏稀釋10倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持40分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于13000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為30-50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
(1)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接在裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.2，121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為一級(jí)種子液。
(2)取10毫升一級(jí)種子液接入裝有100毫升種子培養(yǎng)基的500毫升三角瓶中。搖瓶種子培養(yǎng)基組成同(1)。121℃滅菌，25分鐘，搖瓶于30℃，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時(shí)，作為二級(jí)種子液。
(3)按10％的接種量將搖瓶種子接入50升發(fā)酵罐中。在50升發(fā)酵罐中加入32升種子培養(yǎng)基并接入二級(jí)種子液3.2升，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨2.5g，硫酸鎂3g，，PH值6.2，121℃滅菌，25分鐘。于29℃±1℃，通氣量0.7(V/V)，罐壓0.01MPa，攪拌速度250轉(zhuǎn)/分鐘條件下發(fā)酵16小時(shí)。
(4)在500升發(fā)酵罐內(nèi)加入320升發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成每升為(L)DE值為40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氫鉀5g，硫酸銨3g，硫酸鎂4g，發(fā)酵復(fù)加溶液500mL，PH值6.0，121℃滅菌，25分鐘。按10％接種量將32升種子罐培養(yǎng)好的種子接入，發(fā)酵攪拌速度為前8小時(shí)為200轉(zhuǎn)/分鐘，8-16小時(shí)為300轉(zhuǎn)/分鐘，16小時(shí)以后為250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為前16小時(shí)0.5(V/V)，16小時(shí)以后為1.0(V/V)，罐壓為0.02MPa條件下發(fā)酵。發(fā)酵到16小時(shí)開(kāi)始每隔12小時(shí)流加10升的含有3300g的DE值為40-60的淀粉水解物和60g的尿素水溶液，到發(fā)酵76小時(shí)時(shí)流加結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵到120小時(shí)結(jié)束。由發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，產(chǎn)物得率37.1％，產(chǎn)物平均分子量58萬(wàn)道爾頓。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法，其特征是，包括下述步驟(1)準(zhǔn)備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(wt％)蔗糖2.0-4.0，精制氮源0.2，磷酸二氫鉀0.1-0.8，硫酸銨0.1-0.5，硫酸鎂0.1-1.0，PH值6.0-6.2，于121℃滅菌25分鐘；(2)出芽短梗霉菌種接在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級(jí)種子、二級(jí)種子、種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；(3)準(zhǔn)備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(wt％)蔗糖或DE值為40-60的淀粉水解物3.0-5.0，精制氮源0.2-0.5，磷酸二氫鉀0.2-1.0，硫酸銨0.1-0.5，硫酸鎂0.1-1.0，發(fā)酵復(fù)加溶液20-50，PH值6.0-6.2；(4)上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％-10％，發(fā)酵攪拌速度為200-300轉(zhuǎn)/分鐘，溫度為29℃±1℃，通氣量為0.5-1.0(V/V)，罐壓為0.01-0.02Mpa；(5)發(fā)酵進(jìn)行到16小時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加碳源，每隔8-12小時(shí)流加一次，流加體積為發(fā)酵體積的2％，流加液為含有蔗糖或DE值為40-60的淀粉水解物30-50％、尿素或氨水0.5-1.0％的水溶液；(6)續(xù)流加5-7次碳源后，再繼續(xù)發(fā)酵16-56小時(shí)；(7)上述發(fā)酵液得到的普魯蘭多糖溶液通過(guò)分子量3000-4000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，得到分子量3000-4000以上的普魯蘭多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法，其特征是，所述精制氮源通過(guò)下述步驟得到將玉米漿或酵母膏稀釋5-10倍，調(diào)節(jié)PH值至6-7之間，80-90℃保持30-45分鐘，然后冷卻至常溫，用管式離心機(jī)于12000-15000轉(zhuǎn)/分鐘下對(duì)上述物料離心，取離心液。在溫度為30-50℃的條件下選用截留分子量3000-6000道爾頓的陶瓷膜進(jìn)行膜分離，取分離液作為精制氮源進(jìn)行發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法，其特征是，所述步驟(7)中膜分離后分子量3000-4000以下的通過(guò)去離子、脫色后得到發(fā)酵復(fù)加溶液用于配制發(fā)酵初始培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)普魯蘭多糖的發(fā)酵方法。本發(fā)明方法為將液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(wt％)蔗糖或DE值為40－60的淀粉水解物3.0－5.0，精制氮源0.2－0.5，磷酸二氫鉀0.2－1.0，硫酸銨0.1－0.5，硫酸鎂0.1－1.0，發(fā)酵復(fù)加溶液20－50，pH值6.0－6.2，接種量為5％－10％，溫度為29℃±1℃，通氣量為0.5－1.0(V/V)，罐壓為0.01－0.02MPa，發(fā)酵進(jìn)行到16小時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加碳源，每隔8－12小時(shí)流加一次，流加5－7次碳源后，再繼續(xù)發(fā)酵16－56小時(shí)。本發(fā)明通過(guò)精制氮源替代普通氮源來(lái)提高發(fā)酵得率，同時(shí)控制發(fā)酵時(shí)間生產(chǎn)不同平均分子量的普魯蘭多糖。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1696302SQ20051001350
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者許勤虎, 徐勇虎 申請(qǐng)人:天津市工業(yè)微生物研究所