專(zhuān)利名稱(chēng)：雞傳染性貧血病毒pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞傳染性貧血病毒PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性貧血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是雞傳染性貧血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV)引起的一種以再生障礙性貧血和全身淋巴器官萎縮，造成免疫抑制為主要特征的病毒性傳染病。其病原—雞貧血病毒1979年由日本學(xué)者Yuasa等首次報(bào)道以后，相繼在西德、瑞典、英國(guó)、丹麥、波蘭、美國(guó)、澳大利亞、荷蘭及巴西等國(guó)陸續(xù)證實(shí)了本病的發(fā)生。CIAV為環(huán)狀單股DNA病毒，在國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)發(fā)表的第六次病毒分類(lèi)報(bào)告中將其與豬環(huán)狀病毒、鸚鵡喙羽病病毒一起設(shè)立了一個(gè)新科，即圓環(huán)病毒科(Circoviridae)。
目前可以用于雞傳染性貧血的診斷方法主要有CIAV的分離和鑒定、電鏡觀察、免疫熒光或過(guò)氧化物酶染色法等技術(shù)。分離病毒是鑒別病毒感染的最確鑿證據(jù)，但是由于CIAV只能在少數(shù)淋巴腫瘤細(xì)胞系上生長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)速度很緩慢，技術(shù)復(fù)雜，無(wú)法應(yīng)用于該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。此外，對(duì)感染雞的組織切片或冰凍切片，可采用免疫熒光或過(guò)氧化物酶染色法檢測(cè)抗原；經(jīng)過(guò)特殊工藝處理后的樣品，可以直接用電鏡觀察病毒。但這兩種方法的敏感性低，需要時(shí)間長(zhǎng)，診斷速度慢，準(zhǔn)確率和敏感性低等原因，限制了其應(yīng)用的普遍性和實(shí)用性，而且免疫熒光同樣存在著假陽(yáng)性的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺欠，提供一種雞傳染性貧血病毒PCR檢測(cè)方法，目前發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，根據(jù)CIAV全基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異的引物，用PCR基因擴(kuò)增儀，檢測(cè)CIAV的基因片段。這種方法不僅可以用于檢測(cè)組織中的CIAV，而且還可用于感染的MSB1細(xì)胞，或疫苗中CIAV污染的監(jiān)測(cè)。達(dá)到檢測(cè)快速性，特異性強(qiáng)和敏感性高，便于操作等目的。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是(1)CIAV DNA的提取即取100mg的組織，加入1000μL TEN緩沖液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，7000rpm離心10分鐘，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均勻后置37℃消化過(guò)夜或50℃水浴3小時(shí)。之后加入等量酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20℃30分鐘，12000rpm離心15分鐘。沉淀顆粒置真空干燥箱干燥后，用適量超純水溶解，即為實(shí)驗(yàn)用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)設(shè)計(jì)并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超純水溶解，濃度為100pmol，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)PCR反應(yīng)體系采用25μL的PCR反應(yīng)體系，在0.2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10×PCR緩沖液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積后混合均勻。
(4)PCR反應(yīng)條件將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)。反應(yīng)條件是94℃，3分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94℃，1分鐘，62℃，1分鐘，72℃，3分鐘共循環(huán)30～35次；最后72℃延伸10分鐘。
(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。
(6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽(yáng)性樣品可出現(xiàn)925bp片段。
本發(fā)明的有益效果是通過(guò)臨床檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明所建立的CIAVPCR方法可以特異性地?cái)U(kuò)增CIAV基因片段，而且對(duì)CIAV進(jìn)行臨床診斷不僅切實(shí)可行，且具有快速、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點(diǎn)，滿(mǎn)足了臨床診斷的要求，為檢測(cè)CIAV提供了便利條件。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明按以下步驟進(jìn)行，(1)CIAV DNA的提取即取100mg的組織，加入1000μL TEN緩沖液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，7000rpm離心10分鐘，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均勻后置37℃消化過(guò)夜。之后加入等量酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20℃30分鐘，12000rpm離心15分鐘。沉淀顆粒置真空干燥箱干燥后，用適量超純水溶解，即為實(shí)驗(yàn)用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)設(shè)計(jì)并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超純水溶解，濃度為100pmol，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)PCR反應(yīng)體系采用25μL的PCR反應(yīng)體系，在0.2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10×PCR緩沖液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVPl、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積后混合均勻。
(4)PCR反應(yīng)條件將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)條件是94℃，3分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94℃，1分鐘，62℃，1分鐘，72℃，3分鐘共循環(huán)35次；最后72℃延伸10分鐘。
(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。
(6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽(yáng)性樣品可出現(xiàn)925bp片段。
實(shí)例1某雞場(chǎng)的雞出現(xiàn)精神沉郁、衰弱、消瘦、體重減輕、死亡率高等臨床癥狀。經(jīng)病理剖檢可見(jiàn)喙、肉髯和可視黏膜蒼白；血液稀薄，血凝時(shí)間延長(zhǎng)；骨髓呈黃白色。我們采取了5份病雞的肝臟、脾臟和骨髓等組織樣品，每只雞的肝臟、脾臟和骨髓混合為一份樣品，(1)CIAV DNA提取每份樣品取100mg加入1000μL TEN緩沖液，充分研磨后反復(fù)凍融3次；然后7000rpm離心10min；取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL和蛋白酶K(20mg/mL)2.5μL，充分混合均勻后置37℃溫箱消化過(guò)夜。次日加入500μL飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，抽提二次，取上清液350μL加700μL無(wú)水乙醇于-20℃30分鐘，然后12000rpm離心15min。倒掉上清液，沉淀顆粒置真空干燥箱干燥1h后，用20μL超純水溶解，即為實(shí)驗(yàn)用DNA模板。(2)在0.2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10×PCR緩沖液2.5μL，4dNTP(2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積。(3)5000rpm離心1min使上述試劑混合均勻，然后置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)條件是94℃，5分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94℃，1分鐘，62℃，1分鐘，72℃，3分鐘共循環(huán)30次；最后72℃延伸10分鐘。(4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，結(jié)果顯示，5份樣品均出現(xiàn)大小均為925bp的擴(kuò)增片段。證實(shí)該雞體內(nèi)感染有雞傳染性貧血病毒。
實(shí)例2某雞場(chǎng)的雞發(fā)生死亡，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，股骨的骨髓被脂肪組織取代，呈脂肪色、淡黃色。胸腺萎縮甚至完全退化，顏色呈深紅褐色，法氏囊的外壁呈半透明狀態(tài)，肝臟腫脹、褪色，腺胃黏膜出血，疑似為雞傳染性貧血。我們采取了6只病死雞的肝臟、脾臟和骨髓組織樣品，每只各取肝臟、脾臟和骨髓組織混合樣品共100mg放入1.5mL離心管，各加入1000μL TEN緩沖液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，7000rpm離心10分鐘，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均勻后置37℃消化過(guò)夜。之后加入等量酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，取上清液加2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20℃30分鐘，12000rpm離心15分鐘。沉淀顆粒置真空干燥箱干燥后，用適量超純水溶解，即為實(shí)驗(yàn)用DNA模板。在每個(gè)0.2mLPCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入10×PCR緩沖液2.5μL，4dNTP(2.5rmM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積，混合均勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為94℃，3分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94℃，1分鐘，62℃，1分鐘，72℃，3分鐘共循環(huán)35次；最后72℃延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，并觀察與標(biāo)準(zhǔn)分子量的對(duì)照。結(jié)果表明6個(gè)樣品均出現(xiàn)大小約925bp的片段，說(shuō)明6只病死雞均感染有雞傳染性貧血病毒。
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性貧血病毒PCR檢測(cè)方法，其特征是，(1)CIAV DNA的提取即取100mg的組織，加入1000μL TEN緩沖液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，7000rpm離心10分鐘，取上清液472.5μL，加入10％SDS 25μL，20mg/mL蛋白酶K 2.5μL，充分混合均勻后置37℃消化過(guò)夜或50℃水浴3小時(shí)。之后加入等量酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提二次，取上清液加2體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇于-20℃30分鐘，12000rpm離心15分鐘。沉淀顆粒置真空干燥箱干燥后，用適量超純水溶解，即為實(shí)驗(yàn)用DNA模板。提取的DNA模板于-70℃保存?zhèn)溆谩?2)設(shè)計(jì)并合成引物上游引物CIAVP1 5’-GAG GAG ACA GCG GTATCG TAG A-3’，下游引物CIAVP2 5’-TCT CGC CTT GTG GTG GTT G-3’，使用前用超純水溶解，濃度為100pmol，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?3)PCR反應(yīng)體系采用25μL的PCR反應(yīng)體系，在0.2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加人10×PCR緩沖液2.5μL，4dNTP(各2.5mM)2.0μL，MgCl2(25mM)1.5μL，上、下游引物(CIAVP1、CIAVP2)各0.3μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL，DNA模板1.0μL，用滅菌超純水加至總體積，混合均勻。(4)PCR反應(yīng)條件將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)，反應(yīng)條件是94℃，3分鐘，進(jìn)行預(yù)變性；然后94℃，1分鐘，62℃，1分鐘，72℃，3分鐘共循環(huán)30～35次；最后72℃延伸10分鐘。(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5μg/mL)上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。(6)結(jié)果與判定在紫外燈下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽(yáng)性樣品可出現(xiàn)925bp片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雞傳染性貧血病毒PCR檢測(cè)方法，采用25μL的PCR反應(yīng)體系，在0.2mL PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入緩沖液，上、下游引物，DNA聚合酶以及提取的DNA模板，用滅菌超純水加至總體積，將試劑混合均勻后，置于PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行變性、退火、延伸共循環(huán)30～35次；PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上，使用TAE緩沖液進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物，并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽(yáng)性樣品可出現(xiàn)925bp片段。本發(fā)明對(duì)CIAV進(jìn)行臨床診斷不僅切實(shí)可行，且具有快速、準(zhǔn)確、特異的優(yōu)點(diǎn)，滿(mǎn)足了臨床診斷的要求，為檢測(cè)CIAV提供了便利條件。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1680595SQ200510013128
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月24日
發(fā)明者梁智選, 王志成, 劉建文, 李穎 申請(qǐng)人:天津市禽病診斷培訓(xùn)中心