專利名稱：一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法
—種用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-調(diào)亡素融合蛋白的方法本發(fā)明涉及一種TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具體涉及一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法。凋亡素(apoptin)是由雞貧血病毒(CAV)VP3基因編碼的蛋白質(zhì)，由121個氨基酸組成，NCBI中的序列編號為NC_001427，可以特異性地誘導(dǎo)動物和人體腫瘤細胞凋亡而對正常細胞沒有影響。凋亡素選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡是非P53依賴的bcl-2對抗機制，由于大部分腫瘤細胞具有P53突變或缺少的特性，因此，非p53依賴性凋亡素作為抗腫瘤藥物具有很好的應(yīng)用前景。 天然狀態(tài)下的凋亡素很難透過細胞膜屏障進入腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用?，F(xiàn)已證明，人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activatortranscription, TAT)具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特點，能快速有效地將與之相連的肽段或蛋白質(zhì)直接跨膜轉(zhuǎn)運進入細胞或組織，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很高且對細胞沒有損傷。TAT的編碼序列為YGRKKRRQRRR，利用TAT介導(dǎo)蛋白質(zhì)進入細胞的有效方法是將TAT的編碼基因與外源蛋白基因連接，表達融合蛋白。2004年Guelen等研制出含TAT跨膜功能域的凋亡素重組蛋白TAT-凋亡素。純化的TAT-凋亡素不僅保留了 TAT原有的穿透力，而且絲毫不影響凋亡素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的活力。家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac構(gòu)成，其產(chǎn)生重組病毒的原理是首先將外源目的基因克隆入供體質(zhì)粒中，然后將供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DHlOBmBac感受態(tài)細胞中，通過細菌轉(zhuǎn)座子的定點轉(zhuǎn)位作用，將啟動子和目的基因一起轉(zhuǎn)入家蠶桿狀病毒基因組而產(chǎn)生重組病毒DNA，再通過轉(zhuǎn)染家蠶細胞而獲得含有目的基因的重組桿狀病毒。我們利用該系統(tǒng)快速產(chǎn)生重組病毒，并利用家蠶BmN細胞表達出具有活性的TAT-凋亡素融合蛋白。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速產(chǎn)生重組病毒，并利用家蠶BmN細胞表達出具有活性的TAT-凋亡素融合蛋白的Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法。為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種家蠶桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，將TAT-凋亡素基因從pUC57-TAT-apoptin中亞克隆至Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒PFastBacHTb的多克隆位點中，使目的基因位于桿狀病毒多角體啟動子的下游，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，在含有抗生素的培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)。通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，隨后從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，該質(zhì)粒DNA即為重組病毒的基因組。用此所獲得的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，72h后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有ΤΑΤ-ΑΡ0ΡΤΙΝ基因的重組桿狀病毒。然后再用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，最終大量表達TAT-凋亡素融合蛋白。通過Ni — NTA柱親和層析的方法得到高純度TAT-凋亡素融合蛋白。TAT跨膜肽氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)位于TAT跨膜肽-凋亡素融合蛋白序列的N-端，來自于NCBI，序列號為NP_057853。凋亡素氨基酸序列來自于NCBI，序列號為ΝΡ_056774· I。TAT跨膜肽-凋亡素融合蛋白序列的C-端加上一段6xHis標簽。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建供體質(zhì)粒，通過雙酶切將TAT跨膜肽-凋亡素基因片段克隆到pFastBacHTb載體中。DHlOBmBac 細胞包含了 bacmid 和輔助質(zhì)粒(helperplasmid)。
本發(fā)明用家蠶細胞表達的重組TAT-凋亡素融合蛋白，具有較高的表達量及生物活性，為利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)大量該蛋白打下基礎(chǔ)。

圖1是Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb圖。圖2是pFastBacHTb-TAT-apoptin的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖。圖3 是 SDS-PAGE 分析純化后 TAT-apoptin 圖。圖4 是 Western-blot 分析純化后 TAT-apoptin 圖。圖5是MTT法檢測經(jīng)TAT-apoptin處理的HeLa細胞生長曲線圖。圖1中的圖譜詳細信息如下fI 基因間隔區(qū)(fllntergenicregion) :bases2_475。Apr :bases589_1449。ori bases1594-2267οTn7R :bases2511_2735。Gmr bases2802-3335 (互補鏈，complementarystrand)。啟動子(Polhpromoter):bases3904_4032。多克隆位點(Mutiplecloningsite):bases4119_4222。SV40polyA 轉(zhuǎn)錄終止序列(SV40polyadenylationsignal) bases4240-4480 Tn7L :bases4509_4674。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本申請中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1:1.研究材料重組質(zhì)粒pUC57-TAT_apoptin為外包服務(wù)公司提供；DNAmarker、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等均購于Takara ;桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb、Cellfectin和N1-NTA樹脂均為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清FCS、家蠶BmN細胞培養(yǎng)基TC-100均為GibcoBRL的產(chǎn)品。2.工作流程
(I)由 BamH I 和 Hind III 雙酶切 pUC57-TAT_apoptin，將切下的TAT-APOPTIN插入至同樣由BamH I和Hind III雙酶切的pFastBacHTb，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體 pFastBacHTb-tat-apoptin。將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體 pFastBacHTb-tat-apoptin 轉(zhuǎn)化 DHlOBmBac,涂布于含卡那霉素 50 μ g/ml、慶大霉素 30 μ g/ml、Χ-gallOO μ g/mL、IPTG40 μ g/mL的平板，48h左右挑取白色菌落重新劃線，待長出白色菌落后接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，提取重組BacmidDNA。用BamH I和Hind III雙酶切重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-TAT-apoptin。電泳結(jié)果在400bp處有外源片段,表明了重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。(2)在六孔板中接入lX106BmN細胞，貼壁后用TC-100無血清培養(yǎng)基漂洗兩次，然后加入2 μ g的重組Bacmid和6 μ L的Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑,5h后移去轉(zhuǎn)染試劑,加入2mL含15%FCS的TC-10培養(yǎng)基。72h左右觀察到細胞有感染跡象時，用15mL的離心管收集孔板中含重組桿狀病毒的培養(yǎng)液，1000r/min離心5min以去除細胞及較大的碎片，收集上清即得到Pl代重組桿狀tat-apoptin,將Pl代重組桿狀病毒大量感染BmN細胞,觀察到細胞感 染跡象時，收集細胞。(3)將細胞經(jīng)超聲破碎后離心取上清，將上清液利用N1-NTA柱分離純化獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并通過SDS-PAGE以及Westernblot分析純蛋白純度。結(jié)果在16kD處有條帶并且純度達到了 90%以上，表明了重組TAT-apoptin融合蛋白表達成功(圖3和圖4)。(4)利用MTT法來檢測重組TAT-凋亡素的抗腫瘤活性的方法將對數(shù)生長期的Hela細胞接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度的TAT-凋亡素樣品，空白對照組加等體積的培養(yǎng)液，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入一定濃度MTT工作液于細胞，培養(yǎng)4h。取出培養(yǎng)板，每孔吸去上清加入DMS0，于酶標儀490nm處測A值。根據(jù)吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=[實驗組A均值一背景組A均值]/[空白組A均值一背景組A均值]X 100%。將對數(shù)生長期的Hela細胞接種100 μ I (2X 104cell/ml)于96孔培養(yǎng)板，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，分別加入9個不同稀釋濃度的TAT-凋亡素溶液100 μ I，空白對照組加100 μ I培養(yǎng)液，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入MTT工作液100 μ 1，使MTT終濃度為5 μ g/mL,于細胞培養(yǎng)條件下保溫4h。取出培養(yǎng)板，每孔吸去培養(yǎng)基，加入100μ 1DMS0，于酶標儀490nm處測吸光度A值。實驗重復(fù)3次。圖5顯示了重組TAT-apoptin有誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的能力。
權(quán)利要求
1.一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于1.將TAT-凋亡素基因從pUC57-TAT-凋亡素中亞克隆至Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb的多克隆位點中，i1.將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DHlOBmBac細胞內(nèi)，在含有抗生素的培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)，藍白斑篩選獲得陽性克隆，從陽性克隆中抽提質(zhì)粒 DNA,ii1.用此所獲得的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，72h后分離培養(yǎng)基上清液，獲得含有TAT-凋亡素基因的重組桿狀病毒，iv.再用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，最終大量表達TAT-凋亡素融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的TAT的編碼序列位于TAT-凋亡素融合蛋白序列的N-端。
3.如權(quán)利要求1所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于在TAT-凋亡素融合蛋白序列的C-端加上一段6xHis標簽。
4.如權(quán)利要求1所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于通過雙酶切將TAT-凋亡素基因片段克隆到pFastBacHTb載體中。
5.如權(quán)利要求4所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于通過BamH I和Hind III雙酶切將pUC57_TAT_凋亡素中的TAT-凋亡素基因片段克隆到由BamH I和Hind III雙酶切pFastBacHTb載體中，構(gòu)成轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-TAT-凋亡素。
6.如權(quán)利要求1所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的抗生素是卡那霉素和慶大霉素中的一種或兩種。
7.如權(quán)利要求6所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的卡那霉素濃度為50ug/ml。
8.如權(quán)利要求6所述的用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的慶大霉素濃度為30ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具體涉及一種用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達TAT-凋亡素融合蛋白的方法。TAT-凋亡素基因亞克隆至Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTb的多克隆位點中，轉(zhuǎn)化入含有家蠶桿狀病毒Bacmid基因組的感受態(tài)細菌DH10BmBac細胞內(nèi)，藍白斑篩選獲得陽性克隆，從陽性克隆中抽提質(zhì)粒DNA，用此所獲得的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN，獲得含有TAT-凋亡素基因的重組桿狀病毒，再用收集到的重組桿狀病毒大量感染BmN細胞，最終大量表達TAT-凋亡素融合蛋白，本發(fā)明用家蠶細胞表達的重組TAT-凋亡素融合蛋白，具有較高的表達量及生物活性，為利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)大量該蛋白打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/866GK102994552SQ20121054443
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者張俊紅, 陸玲玲, 葉永清, 蘇國新 申請人:上海柯萊遜生物技術(shù)有限公司