專利名稱:一種扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基及方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及其工藝。確切的講,本發(fā)明涉及一種扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù):
殼聚糖酶(Chitosanse EC3. 2. I. 132)又稱殼聚糖-N乙酰-氨基葡糖苷水解酶,是一種分解殼聚糖的專一性酶,廣泛分布在細(xì)菌、真菌、病毒以及植物等生物群中,其大部分為堿性蛋白,等電點(diǎn)PI為7. 0-8. 5,最適pH為4. 5-8. O。在pH為6. 0-8. 0,37°C時(shí)殼聚糖酶非常穩(wěn)定,超過40°C后酶很快失活。殼聚糖酶能夠水解含有殼聚糖的細(xì)胞壁,在室溫下可穩(wěn)定存在幾個(gè)小時(shí),冷凍和干燥情況下則可數(shù)月保存,酶粉可溶于水和一系列緩沖溶劑,活性PH和溫度范圍很廣。70年代初期,Monaghant在研究細(xì)菌和真菌過程中,首先提出殼聚 糖酶是一種不同于幾丁質(zhì)酶的新酶,這種酶對膠態(tài)幾丁質(zhì)不水解,但是能夠降解完全脫乙?;臍ぞ厶牵徽J(rèn)為是對線性殼聚糖具有水解專一性的一種酶,1992年殼聚糖酶被系統(tǒng)命名。2004年,國際酶委員會對殼聚糖酶的定義作了修改,重新定義為以內(nèi)切方式催化水解部分乙?;瘹ぞ厶侵械摩耞1,4氨基葡萄糖苷鍵的酶。殼聚糖酶主要存在于真菌和細(xì)菌細(xì)胞中,在單子葉和雙子葉植物的不同組織中也發(fā)現(xiàn)有該酶活性。在殼聚糖等在殼聚糖酶的作用下產(chǎn)生的殼寡糖具有重要的價(jià)值,能提高機(jī)體的免疫能力和抗癌能力,改善腸道微生物的區(qū)系分布等醫(yī)學(xué)作用。農(nóng)業(yè)上其可以刺激有益苗的生長,還可作為植物功能調(diào)節(jié)劑,刺激植物生長口,增強(qiáng)農(nóng)作物對病蟲害的防御能力。在食品上對乳酸的后酸化起到了極為明顯的抑制作用等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基及方法。首先本發(fā)明提供了一種扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基的原料由A液和B液組成,A液為膠體殼聚糖,質(zhì)量濃度為O. 3 1%,ρΗ=5 6. 2,B液按重量分?jǐn)?shù)由以下組成=NaH2PO4 O. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 O. 1-0. 3%, NaNO3 O. 1-0. 3%, MgSO4'7Η20 O. 05-0. 2%, CaCL2 O. 002-0. 003%,KCl O. 3-0. 5%,L-阿拉伯糖 3_4%,葉酸 O. 04-0. 05%,余量為水;將A液與B液分開高壓滅菌,待各自冷卻到60°C時(shí)等體積混合。優(yōu)選地,所述膠體殼聚糖,質(zhì)量濃度為O. 375%,pH=5。優(yōu)選地,所述B液按重量分?jǐn)?shù)由以下組成NaH2PO4 O. 41%, (NH4)2SO4 3%, Na2HPO4O. 2%, NaNO3 O. 2%, MgSO4。7H20 O. 1%,CaCL2 O. 002%, KCl O. 4%, L-阿拉伯糖 3%,葉酸 O. 04%,
余量為水。本發(fā)明還提供了一種扁座殼孢菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的方法,所述方法包含以下步驟
(I)菌種種子培養(yǎng)菌種活化后接種于種子培養(yǎng)基,在26土TC, 160rpm的條件下培養(yǎng)2 3d,制得發(fā)酵種子液;(2)將步驟(I)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1、2或3所述的培養(yǎng)基,250mL的三角瓶裝液量為75mL,接種量2mL/50 mL,在轉(zhuǎn)速160rpm,26± 1°C下培養(yǎng)。所述種子培養(yǎng)基的原料含有20% 土豆汁1L,葡萄糖20g,瓊脂20g,pH5. O。所述的扁座殼孢菌(何學(xué)友等,油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用,中國森林病蟲,2011年7月)。膠體殼聚糖的制備方法如下殼聚糖3g溶解于O. 2mol/L的HCl 200mL中,溶液放在韋林氏攪拌器中攪拌,開始用lmol/L NaOH,最后用O. I mol/L NaOH,溶液被中和至堿性(pH9. O)。得到的沉淀在1000r/min下離 心20min,,并用水重復(fù)洗滌,直到上清液的PH呈中性。洗滌后的沉淀懸浮于蒸餾水中,且懸浮液的pH用醋酸鈉調(diào)整至5 6. 2,最后的濃度為0. 3 1% ( w/ V ) ο本培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比有以下突出特點(diǎn)
(I)產(chǎn)酶高效
對于現(xiàn)有的培養(yǎng)基一般產(chǎn)酶周期要72小時(shí),但本培養(yǎng)基只需48小時(shí)酶活就能夠達(dá)到最聞。其廣酶效率大大提聞了。(2)酶活大幅度提高
現(xiàn)有的培養(yǎng)基(L-阿拉伯糖 0. 375w%, (NH4)2SO4 3 w %,KCl 0. 4 w%,葉酸 O. 04 w%)酶活是20. 37 U/ mL。min.(用DNS法測定),而優(yōu)化的培養(yǎng)基酶活是其2. 153倍,達(dá)到43. 86U/ mL°min
(3)培養(yǎng)基的配方更切合實(shí)際
現(xiàn)有培養(yǎng)基中的A液要求通過乙酸鈉調(diào)pH達(dá)到6. 2,由于A液殼聚糖膠體是利用1%的醋酸鈉配制而成,其酸性較強(qiáng),需要較多的乙酸鈉去調(diào)試pH,而優(yōu)化后的培養(yǎng)基pH只需要求達(dá)到5. O,促使調(diào)pH的乙酸鈉的量大大降低。
圖I為氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例I
單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)菌種種子培養(yǎng)將菌從斜面到250ml錐形瓶的擴(kuò)大培養(yǎng),接種量為Icm2菌落,在26°C左右,160rpm條件下的種子培養(yǎng)基中培育48小時(shí)。斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基20% 土豆汁1L,葡萄糖20g,瓊脂20g,pH5. O。(2)將(I)所得的種子液接種到優(yōu)化前培養(yǎng)基(發(fā)酵)
A液1%膠體殼聚糖(pH6. 2)(制備方法參考王艷等,假單胞菌產(chǎn)殼聚糖酶突變菌株的篩選.中國海洋藥物雜志,2004,23 (5): 38-40)。B 液=KH2PO4 0. 44%, Na2HPO4 0. 2%, (NH4)2SO4 0. 16%, NaNO3 0. 2%, MgSO4' 7H200. 1%,CaCL2 0. 002,KCL 0. 3%,蛋白胨 0. 1%,酵母膏 0. 1% (pH 正常)待A液、B液冷卻至60攝氏度時(shí)等體積混合,在條件裝液量30mL,轉(zhuǎn)速135rpm,接種量ImL/ 50mL,溫度26°C下培養(yǎng),分別測24、48、72、96小時(shí)的酶活。發(fā)現(xiàn)72小時(shí)酶活達(dá)到最聞。(3)殼聚糖酶活力的測定
取稀釋后的粗酶液ImL與2mL pH5. O的2. 5%的膠體殼聚糖混合,60°C水浴30min,沸水浴IOmin滅活流水冷卻。用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH超過8. 0,在15000rpm下離心IOmin,除去未反應(yīng)的底物。取O. 5mL的上述酶液與膠體殼聚糖反映后離心的上清液,加O. 5mL DNS試劑,混合均勻后,沸水浴加熱5min后,迅速加入冷水中冷卻,加蒸餾水至IOmL混勻,以蒸餾水作對 照,于540nm波長處讀取吸光度值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為還原糖的微克數(shù)。同樣以滅活的酶液加DNS試劑反應(yīng)為對照來扣除發(fā)酵液中的殘?zhí)恰T谏鲜龇磻?yīng)條件下,每小時(shí)釋放出Iyg氨基葡萄糖或相當(dāng)于氨基葡萄糖的還原糖所需要的酶量為I個(gè)酶活力單位
(4)氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置在105°C下烘干至衡重后,稱取O. 863g氨基葡萄糖鹽酸鹽,蒸懼水定容至500mL,配置成8 μ mol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液;
表I氨基葡萄糖系列溶液取若干支干凈的試管,按表I將8 μ moL / mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽配成各濃度的氨基葡萄糖溶液,震蕩均勻。表I氨基葡萄糖系列溶度
權(quán)利要求
1.一種扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基的原料由A液和B液組成,A液為膠體殼聚糖,質(zhì)量濃度為0. 3 l%,pH=5 6. 2,B液按重量分?jǐn)?shù)由以下組成=NaH2PO4 0. 3-0. 5%, (NH4)2SO4 2-4%, Na2HPO4 0. 1-0. 3%, NaNO3 0. 1-0. 3%, MgSO4' 7H200. 05-0. 2%, CaCL2 0. 002-0. 003%, KCl 0. 3-0. 5%, L-阿拉伯糖 3-4%,葉酸 0. 04-0. 05%,余量為水;將A液與B液分開高壓滅菌,待各自冷卻到60°C時(shí)等體積混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基,其特征在于,所述膠體殼聚糖,質(zhì)量濃度為0. 375%,pH=5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的扁座殼孢菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基,其特征在于,所述B液按重量分?jǐn)?shù)由以下組成NaH2P04 0 . 41%,(NH4)2SO4 3%,Na2HPO4 0. 2%,NaNO3 0. 2%,MgSO4-7H20 0. 1%,CaCL2 0. 002%, KCl 0. 4%, L-阿拉伯糖 3%,葉酸 0. 04%,余量為水。
4.一種扁座殼孢菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的方法,其特征在于所述方法包含以下步驟 菌種種子培養(yǎng)菌種活化后接種于種子培養(yǎng)基,在26±1°C, 160rpm的條件下培養(yǎng)2 3d,制得發(fā)酵種子液; 將步驟(I)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權(quán)利要求1、2或3所述的培養(yǎng)基,250mL的三角瓶裝液量為75mL,接種量2mL/50 mL,在轉(zhuǎn)速160rpm,26± 1°C下培養(yǎng)。
5.如權(quán)利4所述扁座殼孢菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的方法,其特征在于,所述種子培養(yǎng)基的原料含有20% 土豆汁1L,葡萄糖20g,瓊脂20g,pH5. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地,本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含0.3~1w%膠體殼聚糖,pH=5~6.2,NaH2PO4 0.3-0.5%,(NH4)2SO4 2-4%,Na2HPO4 0.1-0.3%,NaNO3 0.1-0.3%,MgSO4·7H2O 0.05-0.2%,CaCl2 0.002-0.003%,KCl 0.3-0.5%,L-阿拉伯糖3-4%,葉酸0.04-0.05%。該方法通過將發(fā)酵種子液按接種于培養(yǎng)基,接種量2mL,于26℃,轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短;條件溫和,易于控制;培養(yǎng)基具有蛋白酶產(chǎn)率高,蛋白酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12R1/645GK102978190SQ201210543898
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 吳國輝, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 蘇禮超, 李小霞, 何肖云, 郭慶豐, 毛麗慧 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)