專利名稱：蛋白轉(zhuǎn)導域4－凋亡素融合蛋白(PTD4－Apoptin)及其制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，特別涉及生物技術藥物，尤其是用于治療腫瘤的生物技術藥物。
背景技術：
腫瘤是世界上致人死亡的主要疾病，目前對腫瘤的治療方法有手術治療、放療和化療等措施，手術治療僅對早期腫瘤有一定療效，對晚期腫瘤則療效不佳，放療和化療費用高、對人體損傷大，尋找新的安全有效的治療腫瘤的藥物和方法，是當前醫(yī)藥領域面臨的重要課題。
來源于雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白(亦稱凋亡素，Apoptin)因其腫瘤特異性凋亡誘導效應而引起了人們的關注。體內(nèi)外研究結果均表明，VP3(本文中的VP3均指雞貧血病毒的VP3蛋白，即CAV VP3)能誘導多種腫瘤細胞凋亡[1]，其誘導的凋亡效應為非p53依賴性[2]、不受抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL的抑制[3]。更有意義的是，VP3僅誘導具有致瘤表型細胞或轉(zhuǎn)化表型細胞的凋亡，而對正常細胞無凋亡效應、無細胞毒性[4]，VP3轉(zhuǎn)基因小鼠能正常生長發(fā)育[5]，這些特點表明VP3是一種極有應用前景的抗腫瘤制劑，人們?yōu)槔肰P3治療腫瘤進行了積極的探索。目前，直接導入外源性vp3基因進行基因治療仍是人們采取的主要策略；同時，針對不同腫瘤嘗試了不同策略以實現(xiàn)靶向性治療[6-7]，如我們在國際上首次報道了通過受體介導的轉(zhuǎn)移技術實現(xiàn)vp3基因體內(nèi)肝細胞定向轉(zhuǎn)移和表達，特異性誘導肝癌細胞凋亡，取得了良好的抑瘤效果[8-9]。但是，如何充分發(fā)揮VP3“腫瘤細胞特異性誘導腫瘤細胞凋亡”的特性，避免外源基因?qū)塍w內(nèi)后可能出現(xiàn)的潛在風險，如過度表達等，進一步擴展VP3治療腫瘤的應用范圍，仍是亟待解決的問題。
蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導技術(protein transduction technology)是近年來新興的一種大分子轉(zhuǎn)移技術，該技術利用一些具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導結構域(protein transduction domain，PTD)(中文簡稱蛋白轉(zhuǎn)導域)的蛋白質(zhì)或多肽，直接將具有治療作用的生物大分子“送”入細胞發(fā)揮生物學效應[10]。這種具有穿過細胞膜的能力的多肽稱為細胞透膜肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，其長度一般不超過30個氨基酸且富含堿性氨基酸，如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)。CPP可傳送的物質(zhì)范圍很廣泛，如蛋白質(zhì)、DNA、抗體、顯像試劑、毒素、納米藥物顆粒、脂質(zhì)體等[11]。CPP傳送系統(tǒng)既是一個很好的研究細胞內(nèi)生物過程的工具，也是一個在生物藥物傳送方面具有潛在價值的研究對象。這一技術正成為腫瘤生物治療的新思路——利用它可直接將治療物導入癌細胞，使治療作用更加可控[10]。
目前相關研究多集中在HIV-TAT(trans-activator of transcription)多肽上。TAT蛋白(86肽)是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白，1988年Green[11]和Frankel[12]各自獨立發(fā)現(xiàn)HIV-TAT蛋白具有穿透生物膜的能力[12-13]；隨后發(fā)現(xiàn)這一透膜能力是由47-57(或48-60)氨基酸殘基之間的肽段所介導，而且TAT多肽與其他蛋白形成的融合蛋白也能透過細胞膜，并能發(fā)揮這些蛋白質(zhì)的生物學功能[14-16]。Ho等人[17]利用化學合成法對TAT進行改造，通過氨基酸替換得到了一系列的TAT-PTD多肽，其中PTD4的二級結構更穩(wěn)定、轉(zhuǎn)導效率更高，可使目標蛋白轉(zhuǎn)導成功率幾乎達到100％，且單個細胞的蛋白質(zhì)導入量是TAT導入量的33倍，但PTD4能否通過生物合成而實現(xiàn)融合蛋白的跨膜運輸目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療腫瘤的蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白(PTD4-Apoptin融合蛋白，或稱PTD4-CAV VP3融合蛋白)，使其具有良好的穿透生物膜效應且能誘導腫瘤細胞凋亡、對腫瘤細胞具有較大殺傷力、不損傷正常細胞、不會有導入外源基因的情況發(fā)生等特點。同時，本發(fā)明還提供這種治療腫瘤的PTD4-Apoptin融合蛋白的制備方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是制備PTD4-Apoptin融合蛋白，利用PTD4直接將Apoptin蛋白導入細胞，繼而利用Apoptin特異性地誘導腫瘤細胞凋亡的特性，從而實現(xiàn)促進腫瘤凋亡、抑制腫瘤生長的目的。
本發(fā)明提供的蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白具有序列表中序列6或序列7所示的氨基酸序列；本發(fā)明提供的表達蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的基因具有序列表中序列5所示的核苷酸序列；本發(fā)明提供的制備蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的方法，包括以下步驟a.構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4；b.構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin；c.PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化。
上述a.中所說的構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4的方法是根據(jù)組成PTD4多肽的11個氨基酸序列，按照原核生物密碼子的特點設計編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列，該編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，合成該兩條寡核苷酸片段，將該兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA，將獲得的編碼PTD4的DNA雙鏈插入到原核表達載體pET28a的Nhe I處。
前述b.中所說的構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin的方法是構建含Apoptin基因的真核表達載體pcDNA-Apoptin，以5′端分別含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I識別位點的兩條PCR引物5′AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′和5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′進行PCR擴增反應，擴增雞貧血病毒的Apoptin基因，反應條件為循環(huán)參數(shù)為94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循環(huán)擴增30次，72℃保溫10min；將PCR擴增片段Apoptin和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5 α，擴增提取質(zhì)粒pET28a-PTD4-Apoptin。
前述c.中所說的PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化的方法是將純化后的重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-Apoptin轉(zhuǎn)化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4~0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定；將包涵體溶于含8 mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
通過蛋白轉(zhuǎn)導實驗證實，本發(fā)明合成的PTD4具有介導融合蛋白穿透生物膜的功能。通過TUNEL法及DAPI染色證實，本發(fā)明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白能誘導腫瘤細胞凋亡。本發(fā)明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白具有良好的穿透生物膜效應且能誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤細胞具有極大的殺傷能力。
本發(fā)明提供的蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白(TD4-Apoptin)可用來制備抗腫瘤藥物，如用來制備抗肝癌藥物，其制備方法是以PTD4-Apoptin融合蛋白為活性成分，加上制藥學上可接受的載體和/或添加劑，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。所述的載體可以是PBS(磷酸鹽緩沖液)、甘油或尿素等。
以下結合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。


圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒構建示意圖；圖2為重組體pET28a-PTD4鑒定結果；圖3重組體pET28a-PTD4-VP3鑒定結果；圖4重組體pET28a-PTD4-GFP鑒定結果；
圖5PTD4-GFP、PTD4-Apoptin融合蛋白PAGE結果；圖6PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應實驗的熒光顯微鏡觀察的結果；圖7PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應實驗的光學顯微鏡觀察的結果；圖8PTD4-Apoptin融合蛋白誘導HepG2細胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察FITC激發(fā)結果；圖9PTD4-Apoptin融合蛋白誘導HepG2細胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察DAPI激發(fā)結果；圖10PTD4-Apoptin融合蛋白誘導HepG2細胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡觀察FITC和DAPI共激發(fā)結果；圖11PTD4-Apoptin融合蛋白誘導HepG2細胞凋亡的激光共聚焦顯微鏡光鏡下結果。
具體實施例方式
實施例1構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD41.利用人工合成的寡核苷酸片段退火法制備PTD4序列(1)根據(jù)Ho的報道[17]，PTD4多肽由11個氨基酸組成，按照原核生物密碼子的特點自主設計其堿基序列如下S15′-CTAGTTATGCCCGCGCGGCAGCACGACAAGCTCGAGCCC-3′S25′-CTAGGGGCTCGAGCTTGTCGTGCTGCCGCGCGGGCATAA-3′兩條寡核苷酸片段由上海生物工程公司合成。
將兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA。
2.構建重組體pET28a-PTD4(1)原核表達載體pET-28a(+)購置Novagen公司。
(2)構建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
將上述方法獲得的雙鏈插入到pET28a的Nhe I處，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)酶切鑒定、PCR、測序，證明構建成pET28a-PTD4重組質(zhì)粒。DNA序列測定由上海博亞完成。PCR鑒定引物為P1GGCAGCACGACAAGCTCGAGP2AACCCCTCAAGACCCGTTTAGAG，片段大小為298bpPCR擴增反應條件循環(huán)參數(shù)為95℃變性5min，94℃1min、50℃1min、72℃1min，循環(huán)擴增次數(shù)30次，最后72℃延伸10min。
3.重組質(zhì)粒構建示意圖見圖1。
4.重組體pET28a-PTD4鑒定結果見圖2，圖中M1Mraker，分子量標準，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bpApET28a-PTD4經(jīng)Nhe I酶切后結果B由步驟1所獲得的PTD4片段CpET28a-PTD4 PCR結果M2Mraker，分子量標準，從大到小依次為600，500，400，300，200，100bp從圖2的結果可以判斷重組體pET28a-PTD4成功構建。
實施例2構建含Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin1.利用PCR方法擴增雞貧血病毒的Apoptin基因(1)構建含Apoptin基因的真核表達載體pcDNA-Apoptin，構建方法參見王宇哲，田俊，屈伸等，雞貧血病毒Apoptin基因的構建及體外凋亡誘導效應的研究，同濟醫(yī)科大學學報，2001，30(4)300-4。[18](2)PCR引物序列如下P55′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′P65′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′兩條引物5′端分別含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I Sal I的識別位點。
(3)PCR擴增反應條件循環(huán)參數(shù)為94℃ 5min，94℃ 55sec、60℃ 50sec、72℃ 55sec，循環(huán)擴增30次，72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定無誤。
2.構建含Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin(1)原核表達載體pET28a-PTD4的構建見步驟(一)。
(2)構建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
PCR擴增片段Apoptin和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴增提取質(zhì)粒。
3.重組體鑒定結果見圖3。
圖3為重組體pET28a-PTD4-Apoptin鑒定結果，圖中M1Marker，分子量標準，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bp
ApET28a-PTD4-Apoptin經(jīng)EcoR I酶切BpET28a-PTD4-Apoptin經(jīng)EcoR I和Sal I酶切CpcDNA-Apoptin的PCR結果M3Mraker，分子量標準，從大到小依次為1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp從圖3的結果可以判斷重組體pET28a-PTD4-Apoptin成功構建。
實施例3構建含GFP基因的原核表達載體pET28a-PTD4-GFP1.利用PCR方法擴增綠色熒光蛋白的GFP基因(1)pEGFP-C1購自CLONETECH公司。
(2)PCR引物序列如下P35′-ACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3′P45′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′兩條引物5′端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I的識別位點。
(3)PCR擴增反應條件循環(huán)參數(shù)為94℃5min，94℃55sec、62℃55sec、72℃1min，循環(huán)擴增30次，最后72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確。
2.構建原核表達載體pET28a-PTD4-GFP(1)原核表達載體pET28a-PTD4的構建見步驟(一)。
(2)構建方法采用常規(guī)的基因克隆方法。
PCR擴增片段GFP和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，回收目的片斷，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴增提取質(zhì)粒。
3.重組體pET28a-PTD4-GFP鑒定結果見圖4。
圖4為重組體pET28a-PTD4-GFP鑒定結果，圖中M1Marker，分子量標準，從大到小依次為7000，5500，3500，2000，1000，500bpA步驟1所獲得的GFP片段BpET-28a-PTD4-GFP經(jīng)BamH I和EcoR I酶切CpET-28a-PTD4-GFP經(jīng)BamH I酶切從圖4的結果可以判斷重組體pET28a-PTD4-GFP成功構建。
實施例4
PTD4-Apoptin、PTD4-GFP融合蛋白的表達及純化1.原核表達菌株E.coli BL21(DE3)PlysS購置Novagen公司；鎳親和層析柱購置Promega公司；IPTG購置BBI公司；BCA蛋白測定試劑盒購置Pierce公司。
2.融合蛋白表達過程將純化后的二種重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-Apoptin和pET28a-PTD4-GFP分別轉(zhuǎn)化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4~0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定。
3.融合蛋白純化過程將包涵體溶于含8 mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，操作步驟按試劑盒要求進行。SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
4.融合蛋白鑒定結果見圖5圖中電泳結果分別是1為純化的PTD4-Apoptin融合蛋白2為IPTG誘導PTD4-Apoptin融合蛋白表達的細菌總蛋白；3為未誘導表達的細菌總蛋白M為蛋白質(zhì)分子量標準，從大到小依次為116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa。
4為未誘導表達的細菌總蛋白5為IPTG誘導PTD4-GFP融合蛋白表達的細菌總蛋白6為純化的PTD4-GFP融合蛋白圖5的電泳結果說明得到純的PTD4-Apoptin、PTD4-GFP融合蛋白。
實施例5融合蛋白的體外透膜效應實驗1.實驗材料(1)PTD4-GFP的PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)實驗細胞為人源肝癌細胞系HepG2購置CCTCC。
2.實驗方法將人源肝癌細胞HepG2接種于培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP孵育細胞，2h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗三次，然后置于熒光顯微鏡下觀察。
3.實驗結果PTD4-GFP融合蛋白分別加入到體外培養(yǎng)的HepG2細胞中，2h后在細胞中可見明顯的綠色熒光，見圖6和圖7，圖6為PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應實驗的熒光顯微鏡觀察的結果；圖7為PTD4-GFP融合蛋白的透膜效應實驗的光學顯微鏡觀察的結果。結合圖6、圖7的結果，表明PTD4-GFP融合蛋白成功透過細胞膜進入HepG2細胞中，說明本發(fā)明提供的合成的PTD4具有介導融合蛋白透膜的能力。
實施例6本發(fā)明融合蛋白誘導HepG2細胞凋亡效應的實驗1.實驗材料(1)PTD4-Apoptin的PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液。
(2)實驗細胞為人源肝癌細胞系HepG2購置CCTCC。TUNEL檢測試劑盒購置Promega公司。
2.實驗方法將處理過的蓋玻片置于六孔板內(nèi)，人源肝癌細胞HepG2以合適密度接種于六孔板中，細胞貼壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-Apoptin及PTD4-GFP-Apoptin孵育細胞4-5天，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定30min，TUNEL檢測細胞凋亡(FITC染色)并用DAPI復染，操作過程按照說明書進行。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3.實驗結果融合蛋白PTD4-Apoptin與HepG2細胞孵育4-5天，TUNEL檢測細胞凋亡并用DAPI復染，激光共聚焦顯微鏡下明顯可見細胞核皺縮，邊集，說明其融合蛋白能引起細胞凋亡，見圖8、9、10、11。結合圖8、9、10、11的結果，說明PTD4-Apoptin融合蛋白誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡效應。
實施例7以本發(fā)明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白為活性成分，加上PBS(磷酸鹽緩沖液0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4)溶液，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
實施例8
以本發(fā)明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白為活性成分，加上PBS溶液和10％的甘油，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
實施例9以本發(fā)明提供的PTD4-Apoptin融合蛋白為活性成分，加上一定量的尿素(如4M)，按常規(guī)方法制備成抗腫瘤藥物制劑。
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序列表<110>華中科技大學<120>蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白及其制法和應用<130>1<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(33)<223>
<400>1tat gcc cgc gcg gca gca cga caa gct cga gcc 33Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>Human immunodeficiency virus<400>2Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala1 5 10<210>3<211>366<212>DNA<213>Chicken anemia virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(366)<223>
<400>3atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg gtg ttc48Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe1 5 10 15agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc aga gag96Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu20 25 30
atc cgg att ggt atc gct gga att aca atc act cta tcg ctg tgt ggc144Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly35 40 45tgc gcg aat gct cgc gct ccc acg cta aga tct gca act gcg gac aat192Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn50 55 60tca gaa agc act ggt ttc aag aat gtg ccg gac ttg agg acc gat caa240Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln65 70 75 80ccc aag cct ccc tcg aag aag cga tcc tgc gac ccc tcc gag tac agg288Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg85 90 95gta agc gag cta aaa gaa agc ttg att acc act act ccc agc cga ccc336Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro100 105 110cga acc gca aaa agg cgt ata aga ctg taa366Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu115 120<210>4<211>121<212>PRT<213>Chicken anemia virus<400>4Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe1 5 10 15Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu20 25 30Ile Arg Ile GlyIle Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly35 40 45Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn50 55 60Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln65 70 75 80Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg85 90 95Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro100 105 110
Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu115 120<210>5<211>513<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(513)<223>
<400>5atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15cgc ggc agc cat atg gct agt tat gcc cgc gcg gca gca cga caa gct 96Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala20 25 30cga gcc cct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tcc gaa144Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu35 40 45ttc atg aac gct ctc caa gaa gat act cca ccc gga cca tca acg gtg192Phe Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val50 55 60ttc agg cca cca aca agt tca cgg ccg ttg gaa acc cct cac tgc aga240Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg65 70 75 80gag atc cgg att ggt atc gct gga att aca atc act cta tcg ctg tgt288Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys85 90 95ggc tgc gcg aat gct cgc gct ccc acg cta aga tct gca act gcg gac336Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp100 105 110aat tca gaa agc act ggt ttc aag aat gtg ccg gac ttg agg acc gat384Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp115 120 125caa ccc aag cct ccc tcg aag aag cga tcc tgc gac ccc tcc gag tac432Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr130 135 140agg gta agc gag cta aaa gaa agc ttg att acc act act ccc agc cga480Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg145 150 155 160ccc cga acc gca aaa agg cgt ata aga ctg taa513
Pro Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu165 170<210>6<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala20 25 30Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu35 40 45Phe Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val50 55 60Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg65 70 75 80Glu Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys85 90 95Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp100 105 110Asn Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp115 120 125Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr130 135 140Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg145 150 155 160Pro Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu165 170<210>7<211>153<212>PRT
<213>人工序列<400>7Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg1 5 10 15Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe20 25 30Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe35 40 45Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu50 55 60Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly65 70 75 80Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn85 90 95Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln100 105 110Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg115 120 125Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser LeuIle Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro130 135140Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu145 150
權利要求
1.蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白PTD4-Apoptin，具有序列表中序列6或序列7所示的氨基酸序列。
2.表達蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的基因，具有序列表中序列5所示的核苷酸序列。
3.蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的制備方法，包括以下步驟a.構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4；b.構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin；c.PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的構建含PTD4序列的原核表達載體pET28a-PTD4的方法是根據(jù)組成PTD4多肽的11個氨基酸序列，按照原核生物密碼子的特點設計編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列，合成該兩條寡核苷酸片段，將該兩條寡核苷酸片段等摩爾混合，95℃10min，然后室溫放置1h復性，形成編碼PTD4的雙鏈DNA，將獲得的編碼PTD4的DNA雙鏈插入到原核表達載體pET28a的Nhe I處。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的編碼PTD4多肽的兩條寡核苷酸堿基序列具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權利要求3所述的制備蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的構建含PTD4-Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin的方法是構建含Apoptin基因的真核表達載體pcDNA-Apoptin，以5′端分別含有限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I識別位點的兩條PCR引物5′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′和5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′進行PCR擴增反應，擴增雞貧血病毒的Apoptin基因，反應條件為循環(huán)參數(shù)為94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循環(huán)擴增30次，72℃保溫10min；將PCR擴增片段Apoptin和pET28a-PTD4重組質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化DH5α，擴增提取質(zhì)粒pET28a-PTD4-Apoptin。
7.根據(jù)權利要求3所述的制備蛋白轉(zhuǎn)導域4-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所說的PTD4-Apoptin融合蛋白的表達及純化的方法是將純化后的重組質(zhì)粒pET28a-PTD4-Apoptin轉(zhuǎn)化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，到A600＝0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1.0mM誘導8小時，超聲破菌，離心收集包涵體，以未誘導菌作對照，經(jīng)12.5％SDS-PAGE鑒定；將包涵體溶于含8mol/l尿素的上樣緩沖液中，經(jīng)鎳親和層析柱純化，SDS-PAGE鑒定洗脫蛋白，合并含目的蛋白的洗脫液，透析、濃縮、過濾除菌，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存。
8.含PTD4和Apoptin基因的原核表達載體pET28a-PTD4-Apoptin。
9.權利要求1所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
10.權利要求1所述的融合蛋白在制備用于治療肝癌的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療腫瘤的蛋白轉(zhuǎn)導域4－凋亡素融合蛋白，其具有良好的穿透生物膜效應且能誘導腫瘤細胞凋亡，對腫瘤細胞具有較大殺傷力且不損傷正常細胞，不會發(fā)生導入外源基因的危險，本發(fā)明融合蛋白利用PTD4直接將凋亡素Apoptin蛋白導入細胞，繼而利用凋亡素Apoptin特異性地誘導腫瘤細胞凋亡，從而實現(xiàn)促進腫瘤凋亡、抑制腫瘤生長的目的。本發(fā)明還提供了該融合蛋白的制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號C12N15/09GK101081871SQ200610019240
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權日2006年5月31日
發(fā)明者屈伸, 孫軍, 宗義強 申請人:華中科技大學