專利名稱：水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以蜂膠為佐劑的水貂巴氏桿菌病滅活疫苗及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
巴氏桿菌病主要是由多殺性巴氏桿菌及溶血巴氏桿菌引起的畜、禽、野生動(dòng)物和 毛皮動(dòng)物的細(xì)菌性出血性、敗血性傳染病。本病分布廣泛，世界各地均有發(fā)生。近幾年水貂巴氏桿菌亦有流行，它發(fā)病率高、死亡率高，對(duì)毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)危害很大，經(jīng)常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國對(duì)水貂巴氏桿菌病主要采用是抗生素藥物治療，但藥物治療存在一定的缺陷，一旦停藥容易復(fù)發(fā)，而且容易產(chǎn)生抗藥性。防治該病發(fā)生的有效措施是研制相應(yīng)的疫苗。為增強(qiáng)疫苗的免疫源性，常在滅活菌疫苗的研制中加入免疫佐劑。免疫佐劑是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可以先于抗原或與抗原混合或同時(shí)注入動(dòng)物體內(nèi)，能特異性地增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高免疫效果。免疫佐劑可增強(qiáng)抗原所激發(fā)的抗體應(yīng)答，可提高免疫原性，以及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的非特異性殺傷功能和特異性細(xì)胞免疫的刺激作用等。因此，佐劑是疫苗特別是滅活疫苗所必不可少的成分。蜂膠作為一種具有生物活性的免疫佐劑所顯示出的優(yōu)點(diǎn)已逐漸被認(rèn)識(shí)。蜂膠具有廣譜生物學(xué)活性，是一種良好的免疫增強(qiáng)劑和刺激劑，它既能引起特異性免疫應(yīng)答，又能啟動(dòng)非特異性防御機(jī)制，有增強(qiáng)免疫抗體生成和提高白細(xì)胞吞噬能力的明顯效果，使用該佐劑后可以有效保護(hù)皮毛質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以蜂膠為佐劑的水貂源巴氏桿菌病滅活疫苗的制備方法，使其免疫水貂后副作用小，對(duì)毛皮質(zhì)量影響小，免疫產(chǎn)生時(shí)間早，免疫力強(qiáng)，免疫期長。具體實(shí)施步驟
I.水貂源巴氏桿菌滅活原液的制備。I)取水貂源的多殺性巴氏桿菌接種血瓊脂斜面，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)純正，作為菌種使用；
2)以適量的菌種培養(yǎng)物接種血瓊脂斜面，經(jīng)37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)，收取培養(yǎng)物進(jìn)行檢
驗(yàn);
3)取培養(yǎng)菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最終濃度為O.4%，37°C搖床滅活24小時(shí)。2.蜂膠溶液的制備選取已知純度的蜂膠，經(jīng)破碎后過篩，溶于95%的乙醇溶液，再根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的溶液于4°C下保存?zhèn)溆谩?.成品疫苗制備按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8_15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15-20分鐘，使其充分混合乳化。
4.作為本發(fā)明水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活苗的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟I的
3)中，在滅活后還可以對(duì)巴氏桿菌培養(yǎng)液進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)。進(jìn)行滅活檢驗(yàn)和毒素檢驗(yàn)的作用在于對(duì)制造過程疫苗質(zhì)量的控制。本發(fā)明的巴氏桿菌為購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室的一株多殺性巴氏桿菌C52-17作為生產(chǎn)疫苗的菌株，血清型A:l， 2008.4.凍干，有效期10年。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例I :
疫苗制備本品是選用本發(fā)明人于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室購買的一株多殺性巴氏桿菌C52-17作為生產(chǎn)疫苗的菌株，復(fù)蘇后接種血瓊脂斜面培養(yǎng)基18小時(shí)，鏡檢無雜菌后作為種子液，以適量的菌種培養(yǎng)物接種血瓊脂斜面經(jīng)37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)，取培養(yǎng)菌液加入甲醛溶液，使其含甲醛的最終濃度為O. 4%，37°C搖床滅活24小時(shí)。疫苗滅活檢驗(yàn)將甲醛滅活后的菌液取100微升接于3ml液體培養(yǎng)基中，一次培養(yǎng)取三次樣，每個(gè)樣品接種于三個(gè)試管中觀察五天進(jìn)行滅活安全檢驗(yàn)，五天后接種的液體培養(yǎng)基仍澄清無混濁則安全檢驗(yàn)合格。成品疫苗制備按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8_15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15-20分鐘，使其充分混合乳化。實(shí)施例2
將實(shí)施例I制備好的三批疫苗單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量注射健康水貂，后肢內(nèi)側(cè)肌肉接種。通過14d觀察，接種水貂體溫和食欲正常，接種局部無腫脹和炎癥，未出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)每批疫苗選擇3只，剖殺后切開注射部位皮膚觀察注射局部病理變化，水貂接種部位皮下無異常變化，后肢內(nèi)側(cè)肌肉接種部位肌肉組織正常，僅見到注射部位呈深褐色，有玉米粒大小，與周圍紅褐色肌肉相區(qū)別，注射部位未見炎癥反應(yīng)。60-70日齡貂繼續(xù)觀察至接種后30d，貂發(fā)育良好。說明疫苗對(duì)不同年齡的水貂具有較好的安全性。實(shí)施例3
三批水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗分別免疫16-18g小白鼠20只，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，O. 2mL/只，免疫后21d連同對(duì)照組小白鼠20只分別用巴氏桿菌攻毒，觀察7日，三批疫苗免疫組小白鼠均80%獲得保護(hù)，對(duì)照組小白鼠均100%發(fā)病。三批水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗分別免疫2-3月齡的健康水貂，每批疫苗肌肉接種水貂10只，ImL/只，免疫后21日連同對(duì)照組水貂10只用巴氏桿菌通過氣管內(nèi)滴入攻毒(每個(gè)組別5只)，觀察7日，三批疫苗免疫組水貂均80%獲得保護(hù)，對(duì)照組水貂均100%發(fā)病。實(shí)施例4
采用三批蜂膠滅活疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)期測定。分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分六組，每組30只水貂，用本發(fā)明所述三批蜂膠滅活疫苗免疫，每批疫苗免疫10只水貂，每后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射ImL ;對(duì)照組分為六組，每組10只水貂，后肢內(nèi)存肌肉注射生理鹽水對(duì)lmL，免疫后的第1-6個(gè)月，每月用巴氏桿菌分離毒株攻毒，測定疫苗對(duì)毒株的保護(hù)力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述蜂膠滅活疫苗對(duì)水貂巴氏桿菌的保護(hù)期為6個(gè)月，免疫保護(hù)率在80%以上。
權(quán)利要求
1.一種水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗，其特征在于該疫苗是將水貂源巴氏桿菌經(jīng)血瓊脂培養(yǎng)，用其菌液經(jīng)滅活與蜂膠混合制成滅活苗。
2.權(quán)利要求I所述的滅活疫苗的制備方法，主要包括如下步驟 1)水貂源巴氏桿菌滅活原液的制備； 2)蜂膠溶液的制備； 3)成品疫苗制備按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8-15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15-20分鐘，使其充分混合乳化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的水貂源巴氏桿菌滅活原液的制備步驟包括取水貂源的多殺性巴氏桿菌接種血瓊脂斜面，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)純 正，作為菌種使用；以適量的菌種培養(yǎng)物接種血瓊脂斜面，培養(yǎng)物取樣檢驗(yàn)合格，培養(yǎng)物加入甲醛溶液，使其含甲醛的最終濃度為O. 4%，37°C滅活24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，其特征在于蜂膠液制備由以下步驟完成選取已知純度的蜂膠，經(jīng)破碎后過篩，溶于95%的乙醇溶液，再根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的溶液于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，成品疫苗為黃褐色混懸液，密封保存于4-8 °C中。
6.權(quán)利要求I所述的水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗的用途，主要是用于水貂巴氏桿菌的免疫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水貂巴氏桿菌病蜂膠滅活苗及其制備方法。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容是取水貂源巴氏桿菌接種血瓊脂斜面，37℃，培養(yǎng)24小時(shí)，檢驗(yàn)純正，作為種子菌液接種血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)滅活后制成水相與蜂膠佐劑充分混合制成水貂源巴氏桿菌病蜂膠滅活疫苗。本疫苗能夠有效預(yù)防水貂源巴氏桿病的發(fā)生，并能顯著減少注射疫苗后的不良反應(yīng)和對(duì)毛皮質(zhì)量的影響，為毛皮動(dòng)物疾病的控制創(chuàng)造條件。
文檔編號(hào)A61K39/39GK102614511SQ20121009584
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者單虎, 張傳美, 張啟迪, 王述柏, 秦志華, 蔡秀磊 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)