專利名稱：采用細菌混合菌群快速檢測生物降解材料降解性能的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物降解環(huán)境材料降解性能檢測研究領域背景技術傳統(tǒng)塑料在自然環(huán)境中不能被降解，造成嚴重的“白色污染”。因此世界各國都對生物降解材料的研制和開發(fā)給予高度重視。近年來通過化學合成法或微生物發(fā)酵法制備了許多新型生物降解材料，在降解材料研制和生產過程中，降解性的檢測至關重要。但是，目前還沒有一個方便快捷、重復性強的檢測方法，因此迫切需要建立一種切實可行的檢測生物降解材料降解性能的方法。
國際上對生物降解材料降解性能的檢測方法進行了一些研究，并制訂了相應的國際標準。這些標準主要有受控堆肥條件下材料最終需氧生物分解和崩解能力的測定-采用測定釋放二氧化碳方法(ISO14855)；水溶性培養(yǎng)基中材料最終需氧生物分解能力的測定-采用測定密閉呼吸計中需氧量方法(ISO14851)；水溶性培養(yǎng)基中材料最終需氧生物分解能力的測定-采用測定釋放二氧化碳方法(ISO14852)；材料在特定微生物作用下潛在生物分解和崩解能力的評價(ISO846)；在定義堆肥化中試條件下塑料材料崩解程度的測定(ISO16929)。目前中國已制定了國家標準，如GB/T 19277-2003、GB/T 19276.1-2003、GB/T 19276.2-2003、GB/T19275-2003等。這些檢測方法有待完善之處是測試時間長，而且重復性差，即采用不同環(huán)境樣品作為種源進行檢驗獲得的結果不同。因此，迫切需要建立重復性強，檢測速度快的降解性能檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測速度快，而且試驗重復性好的采用細菌混合菌群快速檢測生物降解材料降解性能的方法；本發(fā)明的另一個目的是提供一種容量大、易操作、節(jié)省操作區(qū)域面積，可分體的二氧化碳吸收裝置。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種對材料降解速度快，而且實驗重復性好的細菌混合菌群。
本發(fā)明提出一種采用細菌混合菌群檢測生物降解材料降解性能的方法，包括以下步驟a.從環(huán)境中分離得到各種降解材料的降解菌，并研究單一菌株同時降解兩種以上材料，選擇降解材料共有降解菌，并進行分類鑒定，組成混合菌群；b.按照ISO14852的要求，設計測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置；c.組成混合菌群的降解菌分別經活化、擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，菌體用生理鹽水清洗2次，然后將菌體加到含有檢測液的生物反應器中；d.檢測在30℃好氧條件下進行，檢測結束后收集吸收桶中產生的碳酸鋇沉淀，計算材料降解過程中產生的二氧化碳；e.材料在檢測前及檢測后干燥至恒重，計算材料的重量損失率。
所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，由氣體流量控制計1、空氣中二氧化碳的吸收桶2、生物反應器3和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶5組成，其特征在于氣體流量控制計1、空氣中二氧化碳的吸收桶2、生物反應器3和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶5依次用膠皮管9連接，生物反應器3外加恒溫水浴攪拌裝置4；吸收桶2和5頂部有裝液口7、底部有底腳10，降解材料產生的二氧化碳的吸收桶5的末尾桶上有出氣口6。
所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，其特征在于所述的空氣中二氧化碳的吸收桶2和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶5由2.5-3.5mm厚的有機玻璃制成，每個桶有三個底角10，桶可疊放，通過膠皮管9連接。
所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，其特征在于所述的空氣中二氧化碳的吸收桶2的疊放個數為3-4個，降解材料產生的二氧化碳的吸收桶5的疊放個數為3-4個。
氣體流量控制計1將空氣以50mL/min-100mL/min的流量通入裝有氫氧化鈉溶液的空氣中二氧化碳的吸收桶2，除去空氣中的二氧化碳；經吸收桶2無白色沉淀后，無二氧化碳的空氣通入生物反應器3中，降解反應在恒溫水浴攪拌裝置4控制下進行；降解材料降解過程中產生的二氧化碳被吸收桶5中的氫氧化鋇溶液吸收。
一種可用于檢測生物降解材料降解性能的細菌混合菌群，主要包括


利用細菌混合菌群對聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHB/V)、纖維素、聚丁二酸丁二醇酯與聚己二酸丁二醇酯的共聚物(PBSA)、聚碳酸酯(PPC)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等12種降解材料的降解性能進行檢測，檢測結果如圖4所示。作為試驗對照組，又以土壤懸濁液作為接種物，以聚苯乙烯作為參比材料，對6種降解材料的降解性能進行檢測，檢測結果如圖2、圖3所示。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是第一，由于采用細菌混合菌群代替環(huán)境接種物，因此材料的降解速度大大加快，每次檢測時間縮短到1周，而且檢測結果的重復性好；第二，該裝置能準確地測定降解材料好氧降解產生的二氧化碳，二氧化碳吸收桶具有容量大、易操作、節(jié)省操作區(qū)域面積等特點。本方法還測定材料在降解前后的重量損失。基于上述兩個優(yōu)點，采用細菌混合菌群作為接種物，并利用根據ISO14852基本原理設計的二氧化碳檢測裝置，能夠適用于各種生物降解材料降解性能的檢測。


圖1.二氧化碳檢測裝置示意圖其中，1.氣體流量控制計 2.空氣中二氧化碳的吸收桶 3.生物反應器 4.恒溫水浴攪拌裝置 5.降解材料產生的二氧化碳的吸收桶 6.出氣口 7.裝液口 8.橡膠塞 9.膠皮管 10.底腳圖2.各種降解材料的生物分解百分率圖3.各種降解材料的重量損失百分率圖4.以混合菌群作為接種物在礦物鹽檢測液中各種降解材料的重量保持率具體實施方式
實施例1.
利用細菌混合菌群對聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHB/V)、纖維素、聚丁二酸丁二醇酯與聚己二酸丁二醇酯的共聚物(PBSA)、聚碳酸酯(PPC)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等12種材料的降解性能進行檢測。
1.試驗儀器1.1生物反應器本試驗使用一個1升的三角瓶作為生物反應器，用橡膠塞堵住瓶口，在橡膠塞上留有2個孔，分別為進氣孔和出氣孔。連接管路不能泄露出二氧化碳。生物反應器置于具有磁力攪拌功能的恒溫水浴裝置內，以確保反應過程中溫度恒定，并且在整個反應過程中始終攪拌檢測液，從而保證礦物鹽檢測液中的溶解氧能滿足好氧降解微生物的需要。
1.2供氣系統(tǒng)本試驗使用的空氣流量計能準確地控制通入反應器的空氣流量在50mL/min-100mL/min。本試驗使用濃氫氧化鈉溶液來吸收空氣中的二氧化碳，使通入反應器中的空氣不含二氧化碳。
1.3測定二氧化碳用的分析方法本試驗采用氫氧化鋇溶液吸收降解過程中釋放的二氧化碳，通過收集產生的碳酸鋇沉淀量間接計算二氧化碳的釋放量。
1.4二氧化碳吸收桶由2.5-3.5mm厚的有機玻璃制成。頂部有裝液口，檢測時蓋上膠塞，有進氣口(深入至桶底部)和出氣口(開口于桶上部)。由于有三個底角，因此三個桶可疊放，通過膠管連接，節(jié)約操作區(qū)域面積。
1.5分析天平使用的分析天平精度為±0.001g，用于試驗中各種物質的稱量。
1.6碳酸鋇沉淀的收集方法本試驗用濾紙過濾所產生的沉淀，烘干后稱重，通過換算得出所產生二氧化碳的量。
1.7酸度計調節(jié)檢測液(礦物鹽溶液)的pH值。
2.程序2.1檢測液的配制檢測液的成分是KH2PO40.85000gK2HPO42.17500gNa2HPO4·2H2O 3.34000gNH4Cl 0.05000gMgSO4·7H2O 0.22500gFeCl3·6H2O 0.00025gCaCl2·2H2O 0.03640g蒸餾水 1000mlpH 7.40配制好檢測液，用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調整pH值到7.40。
2.2吸收溶液的配制a.氫氧化鈉溶液每組反應至少需要兩個濾過瓶，每個瓶中放500ml濃度為10mol/L的氫氧化鈉溶液，以除去通入反應器的空氣中的二氧化碳。
b.氫氧化鋇溶液每組反應至少需要三個吸收瓶，每個瓶中放300ml濃度為0.0125mol/L的氫氧化鋇溶液，以吸收降解過程中產生的二氧化碳。
2.3確定通入反應器的空氣不含二氧化碳在空氣通入反應器之前，先經過裝有500ml的0.0125mol/L的氫氧化鋇溶液的指示桶，根據是否有白色沉淀產生，判斷空氣中有無二氧化碳，確保通入反應器的空氣絕對不含二氧化碳。
2.4試驗材料的前處理采用溶液澆注磨具(聚四氟乙烯)法制取各種降解材料膜，材料膜的厚度為0.05-0.10mm。制好的膜需放置2周后方可使用。試驗前，材料膜被真空干燥1周。稱取適量的材料，放入反應器后，使總有機碳(TOC)含量在100mg/L-2000mg/L。
2.5接種a.環(huán)境接種物按照標準方法從環(huán)境中采集土壤樣品，并制成土壤懸濁液接種于反應器中，接種量為5％。
b.混合菌群組成混合菌群的降解菌分別在LB培養(yǎng)基中于30℃活化、擴大培養(yǎng)，離心收集菌體，采用生理鹽水清洗兩次，將菌體接種至含有檢測液和已放入材料膜的生物反應器。
表1.混合菌群的組成


2.6確定檢測的時間檢測液是無碳源的礦物鹽溶液，檢測材料是唯一的碳源?；旌暇耗芤员粰z測材料作為碳源，進行生長繁殖，因此混合菌群的繁殖與材料降解之間有正相關性。為了確定最佳檢測時間，在檢測期間通過測定檢測液在660nm的吸光值來判斷菌體濃度，在菌體濃度開始呈下降趨勢前，終止反應。在整個檢測過程中，應保證二氧化碳吸收桶中含有未反應的氫氧化鋇溶液。
2.7降解性能的檢測反應結束后，取出試驗材料先用75％酒精浸泡1小時，以終止微生物的作用；然后用酒精擦拭材料表面的附著物，再用蒸餾水沖洗干凈，室溫干燥；真空干燥1周后，稱重。
收集吸收桶中產生的碳酸鋇沉淀，干燥至恒重，稱重。
2.8檢測指標生物分解率每克材料降解實際釋放二氧化碳量與理論釋放二氧化碳量之比。
重量損失率材料降解前后的重量損失與降解前重量之比。
3.試驗結果表2.各種降解材料的生物分解百分率

表3.各種降解材料的重量損失百分率

反應結束后，計算材料的生物分解率和重量損失率，二者完全吻合，即材料的生物分解率越大，其重量損失率越大。檢測結果證明該發(fā)明能夠適用于多種生物降解材料降解性能的檢測。用混合菌群作為接種物，降解材料的降解速度明顯加快，能夠在很短的時間內檢測降解材料的降解性能。
權利要求
1.一種用細菌混合菌群檢測生物降解材料降解性能的方法，包括以下步驟a.從環(huán)境中分離得到各種降解材料的降解菌，并研究單一菌株同時降解兩種以上材料，選擇降解材料共有降解菌，并進行分類鑒定，組成混合菌群；b.按照ISO14852的要求，設計測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置；c.組成混合菌群的降解菌分別經活化、擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，菌體用生理鹽水清洗2次，然后將菌體加到含有檢測液的生物反應器中；d.檢測在30℃好氧條件下進行，檢測結束后收集吸收桶中產生的碳酸鋇沉淀，計算材料降解過程中產生的二氧化碳；e.材料在檢測前及檢測后干燥至恒重，計算材料的重量損失率。
2.如權利要求1所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，由氣體流量控制計(1)、空氣中二氧化碳的吸收桶(2)、生物反應器(3)和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶(5)組成，其特征在于氣體流量控制計(1)、空氣中二氧化碳的吸收桶(2)、生物反應器(3)和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶(5)依次用膠皮管(9)連接，生物反應器(3)外加恒溫水浴攪拌裝置(4)；吸收桶(2)和(5)頂部有裝液口(7)，底部有底腳(10)，降解材料產生的二氧化碳的吸收桶(5)的末尾的桶上有出氣口(6)。
3.如權利要求2所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，其特征在于所述的空氣中二氧化碳的吸收桶(2)和降解材料產生的二氧化碳的吸收桶(5)由2.5-3.5mm厚的有機玻璃制成，每個桶有三個底腳(10)，桶可疊放，通過膠皮管(9)連接。
4.如權利要求2所述的測定生物降解材料好氧降解產生的二氧化碳的檢測裝置，其特征在于所述的空氣中二氧化碳的吸收桶(2)的疊放個數為3-4個，降解材料產生的二氧化碳的吸收桶(5)的疊放個數為3-4個。
5.一種可用于檢測生物降解材料降解性能的細菌混合菌群，主要包括
。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物環(huán)境材料降解性能研究領域。包括從環(huán)境中分離得到各種降解材料的降解菌，并進行分類鑒定，組成混合菌群；自行設計生物降解材料降解過程中二氧化碳釋放量的檢測裝置等。本發(fā)明利用混合菌群在特定條件下，通過檢測高聚物中有機碳轉變?yōu)槎趸嫉脑?，對各種生物降解材料的降解性能進行檢測。該發(fā)明設計的反應裝置成本低、操作簡單、每次檢測所需材料少。由于使用混合菌群代替環(huán)境接種物，所以實驗結果的重復性好，而且，檢測時間大大縮短。該發(fā)明能廣泛應用于各種生物降解材料降解性能的檢測，對新型生物降解材料的研制開發(fā)和生物降解材料產品的質量檢測具有重要意義。
文檔編號C12Q1/02GK1664580SQ20051001321
公開日2005年9月7日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權日2005年3月18日
發(fā)明者宋存江, 楊超, 白云鵬, 張斌, 劉靜, 陶健, 曾猛, 鄭承剛, 金映紅, 鄧飛, 高文, 柏松 申請人:南開大學