專利名稱：鑒別基因功能的方法和組合物的制作方法
本申請(qǐng)要求提交于2003年9月30日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/507,437的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛橛糜谌魏文康牡膮⒖肌?br> 1.0領(lǐng)域提供了產(chǎn)生和表征細(xì)胞中的插入突變的方法。還提供了穩(wěn)定結(jié)合插入突變的細(xì)胞。
2.0背景許多人類治療(有某些例外，包括，例如，直接靶向病原體的抗體)直接或間接地與基因組序列信息的有限集所編碼的產(chǎn)物或元件相互作用。因此，科學(xué)考查轉(zhuǎn)向?qū)δ切┛赡芴岢銮宄尼t(yī)療介入途徑的編碼序列信息部分進(jìn)行鑒別。許多治療性產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)生理起作用。在成千上萬種生物化學(xué)和構(gòu)建體相關(guān)的人類基因組編碼產(chǎn)物中，科學(xué)團(tuán)體僅清楚鑒別了這些產(chǎn)物中一部分的生理功能。出于多種原因，在某些情況下，小鼠成為代理表征(characterizing-by-proxy)人類生物序列生理意義的模式生物。作為一種哺乳動(dòng)物，小鼠擁有許多人類的主要器官系統(tǒng)并經(jīng)常利用直向同源產(chǎn)物(orthologous products)調(diào)節(jié)這些器官系統(tǒng)的功能。此外，在某些情況下，小鼠還允許其自身基因組的基因工程操作。
在某些情況下，小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)提供了染色體工程的方法并，因此，提供了假定基因組(genomic hypotheses)的直接檢測(cè)。
3.0概述在某些實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生一組單獨(dú)表征的被插入突變的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括用逆轉(zhuǎn)錄基因誘捕構(gòu)建體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括選擇穩(wěn)定結(jié)合所述逆轉(zhuǎn)錄基因誘捕構(gòu)建體的整合前病毒形式的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括體外鑒別所述逆轉(zhuǎn)錄基因誘捕構(gòu)建體的整合前病毒形式附近的基因組DNA區(qū)域。
在某些實(shí)施方案中，用逆轉(zhuǎn)錄病毒基因誘捕構(gòu)建體以小于5的感染復(fù)數(shù)(M.O.I)感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，感染復(fù)數(shù)小于1。在某些實(shí)施方案中，感染復(fù)數(shù)小于0.5。
在某些實(shí)施方案中，鑒別包含反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IPCR)。在某些實(shí)施方案中，反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包含至少一種選自Pfu、Taq、Isis、Vent、Pwo、Phusion和Tth的聚合酶。在某些實(shí)施方案中，通過測(cè)序來鑒別所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因誘捕構(gòu)建體的整合前病毒形式附近的基因組DNA的至少50個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，鑒別不涉及逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。
在某些實(shí)施方案中，選擇了至少10,000個(gè)不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆的集群。在某些實(shí)施方案中，選擇了至少10,000個(gè)不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆的集群，其包含至少10,000個(gè)不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆，每個(gè)克隆都在不同的基因中含有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因誘捕構(gòu)建體的整合的前病毒形式。
在某些實(shí)施方案中，提供了一組單獨(dú)表征的被插入突變的哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆。
4.0附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(IPCR)的示意圖。
圖2顯示了VICTR48的示意圖?！癓TR”是逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)?！癝A”是剪接受體位點(diǎn)?！癗EO”是新霉素抗性基因?！癙A”是多腺苷酸化位點(diǎn)?！癝V40tpA”是SV40的三重多腺苷酸化序列?！癙GK”是PGK啟動(dòng)子。“BTK”和“SD”是小鼠BTK基因第一外顯子和剪接供體位點(diǎn)。剪接供體之后是BTK基因第一內(nèi)含子的一部分。標(biāo)出了限制性位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)名稱后面的星號(hào)(*)表示其是在構(gòu)建體上的獨(dú)特位點(diǎn)。
圖3顯示了來自數(shù)個(gè)被基因誘捕的ES細(xì)胞克隆的IPCR分析的示例產(chǎn)物，如實(shí)施例6.2所討論。
圖4顯示了莫洛尼鼠類白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的序列，缺少至少一部分的增強(qiáng)子區(qū)(SEQ ID NO5)。
圖5顯示了被修飾的LTR，其缺少至少一部分的增強(qiáng)子區(qū)還缺少LTR內(nèi)的隱蔽剪接供體(SEQ ID NO6)。
圖6A-C顯示了VICTR 48的序列(SEQ ID NO7)。
5.0詳細(xì)說明本文所用的本節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的而不能被解釋為限制所述對(duì)象的內(nèi)容。本申請(qǐng)引用的所有參考在此特別引入作為用于任何目的的參考。
在本申請(qǐng)中，除非特別聲明，單數(shù)的使用包含了復(fù)數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非特別聲明，“或”的使用意指“和/或”。此外，術(shù)語“包含”，還有其它形式，如“包括”，的使用，不具限制意義。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染。在多個(gè)實(shí)施方案中，可依據(jù)制造商說明書或依據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)成熟技術(shù)或依據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。在多個(gè)實(shí)施方案中，通?？梢园凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)方法，也可以按照本說明書各處引用和討論的各種一般性的和較具體的參考文獻(xiàn)所述，和/或按照本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知的方法實(shí)施技術(shù)和程序。見，例如，Sambrook等.Molecular CloningALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989).
在某些實(shí)施方案中，提供了在哺乳動(dòng)物生物學(xué)意義上鑒別遺傳編碼的生物序列(包括，但不限于，蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸序列，多核苷酸和核苷酸序列)的生理作用的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了培養(yǎng)和處理真核細(xì)胞的方法以產(chǎn)生具有確定的基因組插入/突變的遺傳改造的真核細(xì)胞克隆。本方法所用的真核細(xì)胞，在多個(gè)實(shí)施方案中，包括但不限于昆蟲細(xì)胞(包括但不限于黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細(xì)胞)，線蟲(C.elegans)細(xì)胞，嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞(包括但不限于小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞和倉鼠細(xì)胞)，雞細(xì)胞，靈長(zhǎng)類細(xì)胞，(包括但不限于猴細(xì)胞和人細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，用非特異性插入突變對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造。在某些實(shí)施方案中，提供了培養(yǎng)和處理小鼠ES細(xì)胞的方法以產(chǎn)生具有確定的基因組插入/突變的遺傳改造的ES細(xì)胞克隆。
在某些實(shí)施案方中，方法不包括某些昂貴的和/或費(fèi)時(shí)的處理步驟。在某些實(shí)施方案中，方法可以適用于突變的真核細(xì)胞，包括但不限于，突變的小鼠ES細(xì)胞的工業(yè)化生產(chǎn)。
某些實(shí)施方案涉及培養(yǎng)、產(chǎn)生和鑒別突變的真核細(xì)胞，包括但不限于小鼠ES細(xì)胞的方法。在某些實(shí)施方案中，突變的真核細(xì)胞可以被用于產(chǎn)生能進(jìn)行插入的突變等位基因的種系傳遞的生物。在某些實(shí)施方案中，突變的小鼠ES細(xì)胞被用于產(chǎn)生能進(jìn)行插入的突變等位基因的種系傳遞的小鼠。
在某些實(shí)施方案中，基因誘捕是使用DNA作為誘變劑的隨機(jī)插入誘變方法。在某些實(shí)施方案中，DNA最初被作為逆轉(zhuǎn)錄病毒引入，其在細(xì)胞內(nèi)被逆轉(zhuǎn)錄以生成起誘變劑作用的DNA前病毒。在某些實(shí)施方案中，DNA的一部分編碼可選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，基因誘捕構(gòu)建體整合入一個(gè)基因的內(nèi)含子或外顯子中。在某些實(shí)施方案中，基因誘捕構(gòu)建體被設(shè)計(jì)為優(yōu)選整合入內(nèi)含子和/或外顯子中。在多個(gè)實(shí)施方案中，整合入內(nèi)含子或外顯子后，細(xì)胞的剪接器將構(gòu)建體編碼序列剪接成一個(gè)或多個(gè)共轉(zhuǎn)錄在相同mRNA上的內(nèi)源序列。在某些實(shí)施方案中，基因誘捕構(gòu)建體包含編碼可選擇標(biāo)記的序列。在某些實(shí)施方案中，剪接受體序列處于編碼可選擇標(biāo)記的序列之前。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子不處于編碼可選擇標(biāo)記的序列之前。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞的剪接器將內(nèi)源序列從被誘捕的基因剪接到編碼可選擇標(biāo)記的序列的5’端。在某些實(shí)施方案中，可選擇標(biāo)記只在編碼可選擇標(biāo)記的基因誘捕構(gòu)建體整合入內(nèi)含子時(shí)才被表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，可選擇標(biāo)記只在編碼可選擇標(biāo)記的基因誘捕構(gòu)建體整合入外顯子時(shí)才被表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，例如，當(dāng)可選擇標(biāo)記基因編碼抗生素抗性時(shí)，可以在培養(yǎng)物中選擇以表達(dá)可選擇標(biāo)記的方式將基因誘捕構(gòu)建體整合到它們基因組內(nèi)的細(xì)胞。
示范性的真核細(xì)胞插入突變述于，例如，F(xiàn)riedrich和Soriano，1991，Genes Dev.5(9)1513-23；Friedrich和Soriano，1993，Methods Enzymol.1993；225681-701；PCT
發(fā)明者G·漢森, A·阿武因, B·贊布羅維奇, C·J·弗里德勒, W·P·登普西 申請(qǐng)人:萊克康遺傳公司