專利名稱：生產(chǎn)改變含油量的植物的制作方法
相關申請本申請要求2003年4月22日提交的美國臨時專利申請60/464,558的優(yōu)先權，其內(nèi)容全部引入作為參考。
背景技術：
控制農(nóng)作物種子的組合物，尤其是種子油類的含量和組合物的能力在涉及加工食品油類以及動物飼養(yǎng)油類的農(nóng)業(yè)工業(yè)中具有重要的應用價值。農(nóng)作物的種子含有多種有價值的組分包括油類，蛋白以及淀粉。工業(yè)生產(chǎn)過程可以分離若干或所有這些組分用于專門應用的單獨銷售。例如，幾乎60％的美國大豆農(nóng)作物通過大豆加工工業(yè)進行壓榨。大豆加工產(chǎn)生高價銷售的精煉油，而殘余物主要作為低價值的飼料銷售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)種子被壓榨產(chǎn)生油類以及副產(chǎn)品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜協(xié)會)。幾乎20％的1999/2000年的美國玉米農(nóng)作物經(jīng)過工業(yè)化精煉，主要用于產(chǎn)生淀粉，乙醇以及油類(玉米精煉業(yè)者協(xié)會)。因此，常常需要使種子的含油量最大化。例如，對于諸如大豆以及加拿大油菜的加工含油種子而言，提高種子的絕對含油量將提高這種玉米的價值。對于加工的玉米而言，可能需要根據(jù)其它主要組分的應用提高或者降低含油量。降低油類可以通過降低與油類氧化相關的不希望的味道改善分離淀粉的質(zhì)量?；蛘?，在味道不重要的乙醇產(chǎn)生中，提高含油量可以提高總的價值。在許多玉米飼料中，諸如玉米以及小麥，可能希望提高植物含油量，因為油類比諸如碳水化合物的其它種子組分具有較高的能含量。含油種子加工，就像大多數(shù)玉米加工業(yè)一樣是資金密集產(chǎn)業(yè)；因此產(chǎn)品從低值組分到高價值油類組分的分布的較小改變可能對于玉米加工者而言就有顯著的經(jīng)濟影響。
油類的生物技術處理可以提供組成的改變以及油產(chǎn)量的改進。組成的改變尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美國專利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的種子(美國專利5,639,790)等。組成改變的工作主要集中在加工的含油種子但是已經(jīng)可以很容易地延伸至非-含油種子農(nóng)作物包括玉米。雖然對提高含油量具有相當?shù)呐d趣，在這一領域目前唯一實踐的生物技術是高油類玉米(HOC)技術(杜邦，美國專利5,704,160)。HOC利用通過標準的選擇育種連同生產(chǎn)系統(tǒng)中稱為頂交的優(yōu)良品種(不孕雄性)雜交雌性得到的高油類授粉者。頂交高油類系統(tǒng)使玉米收獲的玉米含油量從～3.5％提高到～7％，改善了玉米的能含量。
雖然HOC生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，擔負全部的土地的種子栽植的低授粉者百分比的系統(tǒng)含有固有風險，尤其是在旱年。第二，當前HOC領域含油量已經(jīng)平穩(wěn)在大約9％的油類。最后，高油類玉米主要不是生物化學變化，而是對于提高含油量產(chǎn)生間接結(jié)果的解剖學上的突變體(提高胚芽尺寸)。為此，可選擇的高油類策略，尤其是來源于改變生化產(chǎn)量的高油類策略將是非常重要的。
操作油市場最明顯的目標農(nóng)作物是大豆以及油菜籽，并且大量商業(yè)工作(例如美國專利5,952,544；PCT申請WO9411516)證明擬南芥是這些農(nóng)作物油類代謝的優(yōu)良模型。種子油組合物的生物化學篩選已經(jīng)鑒定了許多關鍵生物合成酶的擬南芥基因并且導致農(nóng)業(yè)上重要基因的直向同源物被鑒定。例如，利用化學誘變處理群的篩選已經(jīng)鑒定了其種子顯示脂肪酸成份改變的脂類突變體(Lemieux B等1990，James以及Dooner，1990)。檢測脂肪酸成份改變的T-DNA誘變篩選(Feldmann等，Science 2431351-1354，1989)鑒定了ω3脫氫酶(FAD3)以及δ-12脫氫酶(FAD2)基因(美國專利5952544；Yadav等，1993；Okuley等，1994)。集中在含油量而非油類質(zhì)量的篩選分析化學上誘導的皺縮種子或籽粒密度改變的突變體，據(jù)此推斷出改變的植物含油量(Focks N以及Benning C，Plant Physiol 11891-101，1998)。用來鑒定參與非常長鏈脂肪酸產(chǎn)生的酶的另一種篩選鑒定了編碼負責降低種子中三酰甘油聚集的甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因的突變(Katavic V等，PlantPhysiol.1995May；108(1)399-409)。此外，還顯示DGAT cDNA的種子特異性過量表達與提高的植物含油量有關(Jako等，2001)。
植物中的激活標簽法，指一種通過插入包含調(diào)節(jié)序列(例如，增強子)的異源核酸構(gòu)建體到植物基因組中，而產(chǎn)生隨機突變的方法。調(diào)節(jié)序列可起到增強一個或多個天然植物基因轉(zhuǎn)錄的作用；因此，激活標簽法是一種用于產(chǎn)生功能獲得(gain-of-function)，通常是顯性突變體的有效方法(參見，例如，Hayashi等，1992；Weigel D等，2000)。插入的構(gòu)建體提供了一種分子標簽，其用于快速鑒定由于其錯表達引起突變表型的天然植物。激活標簽法同時可導致功能喪失表型。插入可導致天然植物基因的破壞，在該情況中表型通常是隱性的。
激活標簽法已經(jīng)用于多種物種，包括煙草和擬南芥，以鑒定各種突變表型和與這些表型相關的基因(Wilson，等，1996，Schaffer等，1998，F(xiàn)ridborg等，1999；Kardailsky等，1999；Christensen S等，1998)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有高油類含量表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物包括含有編碼或互補于編碼HIO103.1多肽的序列的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化載體。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自油菜，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生油類的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物以及從所述植物回收油類。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物通過包括向植物的祖細胞導入含有編碼或互補于編碼HIO103.1多肽的序列的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體，以及培育轉(zhuǎn)化的祖細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法產(chǎn)生，其中HIO103.1多核苷酸序列的表達產(chǎn)生高油類含量表現(xiàn)型。
發(fā)明詳述定義除非另有陳述，這里使用的全部技術以及科學名詞具有與本領域技術人員知曉的相同的含義。專業(yè)人員尤其是參考Sambrook等，1989，以及Ausubel FM等，1993，的定義以及術語。應該理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法，流程以及試劑，因為這些可以改變。
此處所述的術語“載體”是指設計用于在不同宿主細胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_載體”是指可以在異源細胞中整合并表達異源DNA片段的載體。許多原核以及真核生物表達載體是可以市售獲得的。選擇合適的表達載體是本領域述人員所熟知的。
“異源的”核酸構(gòu)建體或序列具有一部分序列不是植物細胞的野生型序列但是在其中表達。異源的控制序列是指不天然調(diào)節(jié)目前正在調(diào)節(jié)的相同基因表達的控制序列(即啟動子或增強子)。通常，異源核酸序列不是它們所存在于的細胞或者基因組的一部分所內(nèi)源產(chǎn)生的，并且已經(jīng)通過傳染，轉(zhuǎn)染，顯微注射，電穿孔法等添加到細胞中?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建體可以含有控制序列/DNA編碼序列組合，其與野生型植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或者不同。
此處所述的術語“基因”是指參與多肽鏈產(chǎn)生的DNA片段，其可能包括或者不包括編碼區(qū)之前以及之后的區(qū)域，例如5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或者“前導”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及單獨的編碼片段(外顯子)以及非-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的內(nèi)含子序列(內(nèi)含子)。
這里使用的“重組體”包括已經(jīng)通過導入異源的核酸序列進行修飾的細胞或者載體，或者所述細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非-重組體)形式的細胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)相同形式的基因或者表達在人為干預下完全表達或者完全不表達的異常表達的天然基因。
此處所述的術語“基因表達”是指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的方法。所述方法包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯；因此“表達”可以是針對多核苷酸或者多肽序列或者兩者。有時，多核苷酸序列的表達不會引起蛋白翻譯?！斑^量表達”是指相對于其在野生型(或者其它的參考[例如，非-轉(zhuǎn)基因])植物中的表達，多核苷酸和/或多肽序列表達增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列?！爱愇槐磉_”是指在未-改變或者野生型植物中不自然發(fā)生的，在某時，某地和/或提高水平的表達?！跋抡{(diào)表達”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是內(nèi)源性基因相對于其在野生型植物中表達的降低表達。術語“錯誤表達”以及“改變表達”包括過量表達，下調(diào)表達以及異位表達。
在將核酸序列插入細胞的概念中，術語“引入的”是指“轉(zhuǎn)染”，或者“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)導”，并且包括針對核酸序列整合到真核或者原核細胞中，其中核酸序列可以整合入細胞的基因組(例如染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體或者線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復制子，或者瞬間表達(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
本文使用的“植物細胞”是指來源于植物的任意細胞，包括來自未分化的組織(例如愈傷組織)以及植物種子，花粉，繁殖體(progagules)以及胚的細胞。
此處所述的術語“天然的”以及“野生型”相對于給定植物性狀或者表現(xiàn)型是指具有在相同種類的植物本身發(fā)現(xiàn)的特征或者表現(xiàn)型的形式。
此處所述的術語關于植物特性的“修飾”是指轉(zhuǎn)基因植物相對于類似的非-轉(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)型的改變。對于轉(zhuǎn)基因植物的“目的表型(性狀)”，指通過T1和/或后代植物證明的可觀察到的或可測量的表型，相應的非轉(zhuǎn)基因植物不顯示該表型(也即，在相似條件下培養(yǎng)或分析的基因型類似植物)。目的表型可表示對植物的改良，或可提供一種在其他植物中產(chǎn)生改良的方法?！案牧肌笔且环N通過給植物提供獨特的和/或新的品質(zhì)，而增強植物物種或品種的實用性的特征?！案淖兒土勘硇汀敝高z傳修飾植物的可測量表型，其中與類似的，但是非修飾的植物相比，該植物顯示統(tǒng)計上顯著增加或減少的總體含油量(即，油類占種子質(zhì)量的百分比)。高油表型指總體含油量增加。
本文使用的“突變體”多核苷酸序列或者基因與相應的野生型多核苷酸序列或者基因是在序列或者表達上不同，其中的差異導致修飾的植物的表現(xiàn)型或者性狀。相對于植物或植物株系，術語“突變體”是指植物或者株系具有修飾的植物表現(xiàn)型或性狀，其中修飾的表現(xiàn)型或性狀與野生型多核苷酸序列或基因的修飾表達有關。
此處所述的術語“T1”是指來自T0植物的種子的植物子代。T1子代是可通過應用選擇性試劑篩選的第一系列轉(zhuǎn)化的植物，所述的選擇性試劑為例如抗生素或除草劑，由此轉(zhuǎn)基因植物含有相應的抗性基因。術語“T2”是指通過T1植物的花進行自體受精產(chǎn)生的植物子代，所述T1植物之前被篩選作為轉(zhuǎn)基因植物。T3植物是由T2植物等產(chǎn)生的。這里所述的特定植物的“直系子代”來源于所述植物的種子(或者，有時來自其它的組織)且是緊隨的子代；例如，對于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“間接子代”來源于所述植物直系子代的種子(或其它組織)，或來自該家系隨后子代的種子(或其它組織)；例如，T3植物是T1植物的間接子代。
此處所述的術語“植物部分”包括任意的植物器官或組織，包括，但不限于種子，胚，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉，和小孢子。植物細胞可獲自任意的植物器官或組織以及由其制備的培養(yǎng)物?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物種類通常是廣泛的，其可以是可用于轉(zhuǎn)化技術的高等植物，包括單子葉的和雙子葉的植物。
在這里所述的“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)含有異源多核苷酸的植物。異源的多核苷酸可以穩(wěn)定地整合到基因組中，或可以被插入到染色體外。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組中從而使多核苷酸被連續(xù)傳代。植物細胞，組織，器官，或已被導入異源多核苷酸的植物被認為是“轉(zhuǎn)化的”，“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”植物。也含有該異源多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物或植物細胞的直系和間接子代也被視為是轉(zhuǎn)基因的。
具有改變的含油量表現(xiàn)型的植物的鑒定我們使用擬南芥激活標簽篩選，來鑒定我們命名為編碼核蛋白(又名F21M12.34，GI# 15218335)的“HIO103.1”基因(Atlg09950；GI#18391091)與改變的含油量表型(具體地，高油表型)之間的關聯(lián)。簡要地，而且如實施例中進一步描述的，用pSKI015載體對許多擬南芥植物進行了突變，所述載體包含來自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，病毒增強子元件，和選擇標記基因(Weigel等，2000)。當T-DNA插入到轉(zhuǎn)化植物的基因組中時，增強子元件可導致附近基因的上調(diào)，通常在插入的大約10千堿基(kb)內(nèi)。把T1植物暴露于選擇劑，以便特異性地回收表達選擇標記，并因此具有T-DNA插入的轉(zhuǎn)化植物。從轉(zhuǎn)化的T1植物收集大約15-20 T2種子的樣本，并從所有的種子提取脂類。進行氣相色譜(GC)分析，以測定種子樣本的脂肪酸含量和組成。
對顯示高油表型的擬南芥系進行了鑒定，其中含油量(也即，脂肪酸)相當于植物日平均含油量的35.0％(111％的PDA)為大約39.0％。通過鑒定系中的T-DNA插入片段側(cè)翼的基因組DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)了HIO103.1基因與高油表型之間的關聯(lián)。因此，HIO103.1基因和/或多肽可用于開發(fā)具有修飾的含油量表型(“HIO103.1表型”)的基因修飾植物。HIO103.1基因可用于生產(chǎn)含油種子作物，其從含油種子加工提供提高的產(chǎn)油量，和用于生產(chǎn)能提供增加的能量的飼料谷物作物用于動物飼養(yǎng)。HIO103.1基因可進一步用于增加特種油料作物的含油量，以便增加所需稀有脂肪酸的產(chǎn)量。已經(jīng)進行遺傳修飾以表達HIO103.1的轉(zhuǎn)基因植物，可用于生產(chǎn)油，其中利用標準方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，并從植物部分(例如，種子)獲得油。
HIO103.1核酸和多肽擬南芥HIO103.1核酸(基因組DNA)序列提供于SEQ ID NO1以及Genbank登錄號GI# 18391091中。對應的蛋白序列提供于SEQ IDNO2以及登錄號GI# 15218335中。擬南芥S0103.1的直系同源物或旁系同源物的核酸和/或蛋白，描述于下面的實施例3中。
如這里使用的術語“HIO103.1多肽”指全長HIO103.1蛋白或其“功能活性”片段，衍生物(變體)，或者直系同源物，指該蛋白片段，衍生物或者直系同源物顯示與SEQ ID NO2的多肽相關的一種或多種功能活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，功能活性HIO103.1多肽，當在植物中錯表達時，導致改變的含油量表型。在更進一步優(yōu)選的實施方案中，HIO103.1多肽在植物中的錯表達導致高油表型。在另一個實施方案中，功能活性HIO103.1多肽當在植物或植物細胞中表達時，能拯救缺陷的(包括缺乏的)內(nèi)源HIO103.1活性；該拯救多肽可來自與具有缺陷的活性的植物相同的或不同的物種。在另一個實施方案中，全長HIO103.1多肽的功能活性片段(也即，具有SEQ ID NO2的序列的天然多肽或其天然存在的直系同源物)，保留與全長HIO103.1多肽相關的一種或多種生物學特性，例如信號活性，結(jié)合活性，催化活性，或細胞或者細胞外定位活性。HIO103.1片段優(yōu)選包括HIO103.1結(jié)構(gòu)域，例如C-或N-末端或者催化結(jié)構(gòu)域，尤其，優(yōu)選包括HIO103.1蛋白的至少10，優(yōu)選至少20，更優(yōu)選至少25，最優(yōu)選至少50的連續(xù)氨基酸。功能域可使用PFAM程序進行鑒定(Bateman A等，1999 NucleicAcids Res 27260-262；website at pfam.wustl.edu)。全長HIO103.1多肽的功能活性變體或其片段，包括具有氨基酸插入，缺失，或者置換，但保留與全長HIO103.1多肽相關的一種或多種生物學特性的多肽。有時，產(chǎn)生的變體能改變HIO103.1多肽的翻譯后加工。例如，與天然多肽相比，變體可以具有改變的蛋白轉(zhuǎn)運或者蛋白定位特性，或者改變的蛋白的半衰期。
如這里使用的術語“HIO103.1核酸”包含具有SEQ ID NO1提供的序列，或者與SEQ ID NO1提供的序列互補的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直系同源物。本發(fā)明的HIO103.1核酸可以是來源于基因組DNA或者cDNA的DNA，或者RNA。
在一個實施方案中，功能活性HIO103.1核酸編碼或者互補于編碼功能活性HIO103.1多肽的核酸?；蚪MDNA包括在該定義內(nèi)，其用作原始RNA轉(zhuǎn)錄本(也即，mRNA前體)的模板，其在編碼功能活性HIO103.1多肽之前需要加工，例如剪接。HIO103.1核酸可包括其他的非編碼序列，其可以轉(zhuǎn)錄或者不被轉(zhuǎn)錄；這種序列包括5’和3’UTRs，聚腺苷酸化信號和尤其是本領域已知的調(diào)控基因表達的調(diào)節(jié)序列。一些多肽需要加工事件，例如蛋白水解剪切，共價修飾，等等，以便完全活化。因此，功能活性核酸可編碼成熟的或者預先加工的HIO103.1多肽，或者中間體形式。HIO103.1多核苷酸還可以包括異源編碼序列，例如，編碼包括的促進融合多肽純化的標記或者轉(zhuǎn)化標記的序列。
在另一個實施方案中，功能活性HIO103.1核酸可用于例如，通過反義抑制，共抑制等等產(chǎn)生功能喪失的HIO103.1表型。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的HIO103.1核酸，包括編碼或互補于編碼HIO103.1多肽的序列的核酸序列，該HIO103.1多肽與SEQ ID NO2提供的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或以上的序列同一性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的HIO103.1多肽包括與SEQ ID NO2的HIO103.1多肽序列具有至少50％或60％同一性的多肽序列，而且與SEQ ID NO2的HIO103.1多肽序列可具有至少70％，80％，85％，，90％或95％或以上的序列同一性。在另一個實施方案中，HIO103.1多肽包括與SEQ ID NO2所示的多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性的多肽序列。在另一個實施方案中，HIO103.1多肽包括與SEQ ID NO2的多肽序列的全長具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性的多肽序列。
在另一個方面，HIO103.1多核苷酸序列與SEQ ID NO1所示的HIO103.1核酸序列的全長或是與這種HIO103.1序列互補的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，而且可包含與SEQ ID NO1所示的HIO103.1序列或其功能活性片斷，或互補序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。
如這里使用的，對于特定的目標序列或其特定部分，“百分比(％)序列同一性”被定義為如果必要獲得最大的百分比序列同一性，如通過WU-BLAST-2.0al9程序(Altschul等，J.Mol.Biol.(1997)215403-410；website at blast.wustl.edu/blast/README.html)所產(chǎn)生的，其中搜索參數(shù)設為缺省值，在進行序列比對和引入缺口之后，候選的衍生序列中核苷酸或氨基酸與目標序列(或其特定部分)中核苷酸或氨基酸相同的百分比。HSP S和HSP S2參數(shù)是機動值，而且是通過程序本身取決于特定序列的組成和在其中對感興趣的序列進行搜索的特定數(shù)據(jù)庫的組成而確定的?！埃ネ恍灾怠蓖ㄟ^把匹配的相同核苷酸或氨基酸的數(shù)目除以報告百分比同一性的序列的序列長度而確定?！鞍俜直?％)氨基酸序列相似性”通過進行與確定百分比氨基酸序列同一性相同的計算而確定，但是在計算中除了相同的氨基酸之外還包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代，即其中氨基酸被具有相似特性的另一個氨基酸所取代，而對蛋白的折疊或活性沒有顯著的影響。可以互相取代的芳香族氨基酸為苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；可互換的疏水氨基酸為亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸；可互換的極性氨基酸為谷氨酰胺和天門冬酰胺；可互換的堿性氨基酸為精氨酸，賴氨酸和組氨酸；可互換的酸性氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸；可互換的小氨基酸為丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。
目標核酸分子的衍生核酸分子，包括能選擇性地與SEQ ID NO1的核酸序列雜交的序列。雜交的嚴謹度可通過溫度，離子強度，pH，以及雜交和洗滌期間變性劑諸如甲酰胺的存在來進行控制。通常使用的條件是大家所熟知的(參見，例如，Current Protocol in MolecularBiology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些實施方案子中，本發(fā)明的核酸分子能在如下的嚴謹雜交條件下與包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子雜交含有核酸的濾紙，在含有6X單倍濃度的檸檬酸鹽(SSC)(1X SSC為0.15 M NaCl，0.015M檸檬酸鈉；pH 7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml的鯡魚精子DNA的溶液中，65預雜交8小時到過夜；在含有6X SSC，1X Denhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸鈉的溶液中，65雜交18-20小時；在含有0.1X SSC和0.1％ SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中，65洗滌濾紙1小時。在其他的實施方案中，使用如下的中等嚴謹雜交條件包含核酸的濾紙，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％ PVP，1％ Ficoll，1％ BSA和500μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中，40預處理6小時；在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.02％ PVP，0.02％ Ficoll，0.2％ BSA，100μg/ml鮭魚精子DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中，40雜交18-20小時；接著，在含有2X SSC和0.1％ SDS的溶液中，55洗滌兩次，1小時。或者，可使用如下的低嚴謹條件在含有20％甲酰胺，5 x SSC，50mM磷酸鈉(pH 7.6)，5X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中，37孵育8小時到過夜；在相同的緩沖液中雜交18到20小時；在1 x SSC中，大約37洗滌濾紙1小時。
由于遺傳密碼的簡并性，可產(chǎn)生許多編碼HIO103.1多肽的多核苷酸序列。例如，根據(jù)特定宿主顯示的最佳密碼子使用，可選擇密碼子以增加多肽在特定的宿主物種中的表達率(參見，例如，Nakamura等，1999)。這種序列變體可用于本發(fā)明的方法。
本發(fā)明的方法可使用擬南芥HIO103.1的直系同源物。鑒定其他植物品種中直系同源物的方法是本領域已知的。一般說來，不同物種中的直系同源物保持相同的功能，由于存在一個或多個蛋白基序和/或三維結(jié)構(gòu)。在進化過程中，當物種形成后發(fā)生基因重復事件時，一個物種，例如擬南芥中的單個基因，可能相應于另一個物種中的多個基因(旁系同源物)。如這里使用的，術語“直系同源物”包括旁系同源物。當序列數(shù)據(jù)可用于特定的植物物種時，通?？赏ㄟ^序列同源性分析，例如BLAST分析，一般使用蛋白餌序列，來鑒定直系同源物。如果來自正向BLAST結(jié)果的top hit序列檢索到了反向BLAST中原始的查詢序列，該序列則為可能的直系同源物(Huynen MA and Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)955849-5856；Huynen MA等，GenomeResearch(2000)101204-1210)。用于多個序列比對的程序，例如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守區(qū)域和/或殘基，并產(chǎn)生系統(tǒng)樹。在表示來自不同物種的多個同源序列(例如，通過BLAST分析檢索到的)的系統(tǒng)樹中，來自2個物種的直系同源序列，相對于來自者2個物種的所有其他的序列，通常在系統(tǒng)樹上顯得最靠近。結(jié)構(gòu)串線(threading)或蛋白折疊的其他分析(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的軟件)也可鑒定可能的直系同源物。核酸雜交方法也可用于尋找直向同源基因，而且當不能獲得序列數(shù)據(jù)是優(yōu)選的。簡并PCR和cDNA或基因組DNA文庫篩選，是尋找相關基因序列的常見方法，而且是本領域熟知的(參見，例如，Sambrook，1989；Dieffenbach andDveksler，1995)。例如，Sambrook等中描述了用于從感興趣的植物物種產(chǎn)生cDNA文庫，和用部分同源基因探針探測文庫的方法。擬南芥HIO103.1編碼序列的高度保守部分可用作探針。HIO103.1直系同源核酸可在高度，中度或低度嚴謹條件下與SEQ ID NO1的核酸雜交。擴增或分離假定的直系同源物的部分之后，可通過標準技術克隆該部分并進行測序，而且用作探針來分離完整的cDNA或基因組克隆。或者，可以啟動EST方案來產(chǎn)生感興趣的植物物種的序列信息數(shù)據(jù)庫。在另一種方法中，能特異性結(jié)合已知的HIO103.1多肽的抗體，用于直系同源物分離(參見，例如，Harlow and Lane，1988，1999)。Western印跡分析可確定HIO103.1直系同源物(也即，直系同源蛋白)存在于特定植物物種的粗提取物中。當觀察反應性時，可通過篩選顯示特定植物物種的表達文庫，來分離編碼候選直系同源物的序列。如Sambrook等1989中所述，可在各種商業(yè)可獲得的載體中構(gòu)建表達文庫，包括λgt11。一旦通過任何這些方法鑒定到了候選的直系同源物，候選的直系同源序列可用作餌(“查詢”)，用于從其中已經(jīng)鑒定到HIO103.1核酸和/或多肽序列的擬南芥或其他的物種中對序列進行反向BLAST。
可使用任何可用的方法來獲得HIO103.1核酸和多肽。例如，通過如前所述的通過篩選DNA文庫或通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)，分離感興趣的cDNA或基因組DNA序列的技術是本領域熟知的?；蛘?，可合成核酸序列。任何已知的方法，例如位點定向誘變(Kunkel TA等，1991)，可用于將所需的改變引入到克隆的核酸中。
通常，本發(fā)明的方法包括把所需形式的HIO103.1核酸整合到用于轉(zhuǎn)化植物細胞的植物表達載體中，并在宿主植物中表達HIO103.1多肽。
分離的HIO103.1核酸分子是不同于天然發(fā)現(xiàn)的形式或設置的核酸分子，而且從至少一個雜質(zhì)核酸分子中鑒定和分離，該雜質(zhì)核酸分子通常結(jié)合在HIO103.1核酸的天然來源中。然而，分離的HIO103.1核酸分子包括包含在通常表達HIO103.1的細胞中的HIO103.1核酸分子，例如，該核酸分子位于與天然細胞的核酸分子不同的染色體位置。
產(chǎn)生具有改變的含油量表型的遺傳修飾的植物HIO103.1核酸和多肽可用于產(chǎn)生具有修飾的含油量表型的遺傳修飾的植物。如這里使用的，“修飾的含油量表型”可指植物任何部分中修飾的含油量；經(jīng)常在種子中觀察到修飾的含油量。在一個優(yōu)選的實施方案中，植物中HIO103.1基因的0改變表達可用于產(chǎn)生具有高油表型的植物。
這里所述的方法一般適用于所有植物。盡管在擬南芥中進行了激活標簽法和基因鑒定，但是HIO103.1基因(或其直系同源物，變體或片段)可在任何植物種類中表達。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)油植物，其在特異性器官，主要是在種子中生產(chǎn)和儲存三酰基甘油。這些物種包括大豆(Glycine max)，油菜籽和canola(包括甘藍型油菜(Brassica napus)，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(陸地棉)，玉米(Zea maya)，可可(Theobroma cacao)，紅花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亞麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生果實和蔬菜的植物，產(chǎn)生谷物的植物，產(chǎn)生堅果的植物，快速周期的蕓苔品種，紫花苜蓿(Medicago sativa)，煙草(Nicotiana)，草坪草(Poaceae family)，其他的飼料作物，和可能是稀有脂肪酸來源的野生物種。
本領域技術人員應該了解本領域存在的各式各樣的轉(zhuǎn)化技術，而且新技術不斷地變成可用的。適于靶宿主植物的任何技術可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可引入各種形式的構(gòu)建體，包括但不限于DNA鏈，到質(zhì)粒，或人工染色體中?？赏ㄟ^各種技術將構(gòu)建體引入到靶植物細胞中，包括但不限于異源核酸的土壤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，電穿孔法，顯微注射，微粒轟擊，磷酸鈣-DNA共沉淀或脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化優(yōu)選永久的，也即通過使導入的表達構(gòu)建體整合到宿主植物基因組中，以便該導入的構(gòu)建體傳遞給連續(xù)的植物世代。根據(jù)計劃的用途，包含HIO103.1多核苷酸的異源核酸構(gòu)建體可編碼完整的蛋白或其生物學活性部分。
在一個實施方案中，雙元Ti載體系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)移多核苷酸。標準的土壤農(nóng)桿菌雙元載體是本領域技術人員已知的，而且許多是可商業(yè)獲得的(例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。
用土壤農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最佳方法隨待轉(zhuǎn)化的植物種類而變化。用于土壤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化的示例性方法包括轉(zhuǎn)化來源于無菌籽苗和/或小植株的胚軸，芽，莖或葉組織的外植體。這種轉(zhuǎn)化的植物可有性繁殖，或通過細胞或組織培養(yǎng)繁殖。以前已經(jīng)描述了土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用于許多不同類型的植物，而且可在科學文獻中找到這種轉(zhuǎn)化方法。其中特別相關是轉(zhuǎn)化商業(yè)上重要的作物，例如油菜籽(De Block等，1989)，向日葵(Everett等，1987)和大豆(Christou等，1989；Kline等，1987)的方法。
根據(jù)表達水平，發(fā)生表達的組織類型和/或表達的發(fā)育階段，可調(diào)節(jié)HIO103.1的表達(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯)。許多異源調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子和增強因子)可用于調(diào)控HIO103.1核酸的表達。這些包括組成型，誘導型和可調(diào)節(jié)的啟動子，以及能以組織或瞬時特異性方式調(diào)控表達的啟動子和增強因子。示例性的組成型啟動子包括樹莓E4啟動子(美國專利5,783,393和5,783,394)，35S CaMV(Jones JD等，1992)，CsVMV啟動子(Verdaguer B等，1998)和甜瓜肌動蛋白啟動子(公開的PCT申請WO0056863)。示例性的組織特異性啟動子包括番茄E4和E8啟動子(美國專利5,859,330)和番茄2AH基因啟動子(Van Haaren MJJ等，1993)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，HIO103.1表達在來自其表達與早期種子和/或胚胎發(fā)育相關的基因的調(diào)節(jié)序列的調(diào)控下。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關的豆科植物基因包括V.faba豆球蛋白(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2233-9)，V.faba usp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22669-79)，豌豆convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251717-26)，豌豆凝集素(dePater等，1993，Plant Cell 5877-86)，P.vulgaris β菜豆蛋白(Bustos等，1991，EMBO J 101469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[β](Bobb等，1997，Nucleic Acids Res 25641-7)和大豆β-conglycinin，7S貯藏蛋白(Chamberland等，1992，Plant Mol Biol 19937-49)。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關的谷類基因包括水稻谷蛋白(″GluA-3，″Yoshihara and Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 301207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol 401-12；″Gt3，″Leisy等，1990，Plant Mol Biol 1441-50)，水稻醇溶谷蛋白(Zhou & Fan，1993，Transgenic Res 2141-6)，小麥醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12545-54)，玉米醇溶蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14323-32)和大麥B-hordein(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 171217-31)。其他的其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關的基因，包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112233-243)，甘藍型油菜napin，2S貯藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J Biol Chem 26212196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 199323671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 321019-27)，甘藍型油菜油質(zhì)蛋白(Keddie等，1994，Plant Mol Biol 24327-40)，擬南芥油質(zhì)蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol 25193-205)，擬南芥FAE1(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46717-25)，刀豆conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol 27729-41)和長春花異胡豆苷合成酶(Str，Ouwerkerkand Memelink，1999，Mol Gen Genet 261635-43)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用來自在油生物合成期間表達的基因的調(diào)節(jié)序列(參見，例如，美國專利5,952,544)?？蛇x擇的啟動子來自于植物貯藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342209-15)。
在另一個方面，有時可能需要抑制宿主細胞中內(nèi)源HIO103.1的表達。用于實施本發(fā)明該方面的示例性方法包括，但不限于反義抑制(Smith等，1988；van der Krol等，1988)；共抑制(Napoli，等，1990)；核酶(PCT公開WO 97/10328)；和正義與反義的組合(Waterhouse，等，1998)。抑制宿主細胞內(nèi)源序列的方法，一般使用待抑制序列的至少一部分的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種序列可以與內(nèi)源序列的編碼以及非編碼區(qū)同源。反義抑制可使用完整的cDNA序列(Sheehy等，1988)，部分cDNA序列包括5’編碼序列(Cannon等，1990)或3’非編碼序列(Ch′ng等，1989)的片段。共抑制技術可使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)或部分cDNA序列(Smith等，1990)。
可進行標準的分子和遺傳試驗，以更進一步分析基因與觀察到的表型之間的關聯(lián)。示例性技術描述如下。
1.DNA/RNA分析例如，通過原位雜交，可在突變體中對比野生型系確定階段-與組織特異性基因表達模式?？蛇M行基因，尤其是側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)甲基化狀況分析。其他的適用技術包括過量表達，異位表達，在其他植物物種中的表達和基因敲除反向遺傳學，靶向敲除，病毒誘導的基因沉默[VIGS，參見Baulcombe D，1999])。
在優(yōu)選的應用中，通過微陣列分析的表達分布被用于同時測量許多不同基因表達中的差異或誘導的改變。用于微陣列分析的技術是本領域熟知的(Schena M等，Science(1995)270467-470；Baldwin D等，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)253-58；van Hal NL等，J Biotechnol(2000)78271-280；Richmond T and Somerville S，CurrOpin Plant Biol(2000)3108-116)?？梢赃M行單獨標簽的株系的表達分布分析。這種分析可鑒定由于感興趣基因的過量表達而協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的其它基因，其可有助于把未知基因置于特定的途徑。
2.基因產(chǎn)物分析基因產(chǎn)物分析可包括重組蛋白表達，抗血清產(chǎn)生，免疫定位，催化或其他的活性的生物化學分析，磷酸化狀況分析，和通過酵母雙雜交分析進行與其他蛋白之間的相互作用分析。
3.涂徑分析途徑分析可包括，基于它的錯表達表型或通過與相關基因的序列同源性，把基因或基因產(chǎn)物置于特定的生物化學，新陳代謝或信號途徑中。或者，分析可包括與野生型系和其它突變系的遺傳雜交(產(chǎn)生雙突變體)，以把基因指定于途徑中，或確定在途徑中突變對下游“報告”基因的作用。
用改變的含油量表型產(chǎn)生突變植物本發(fā)明更進一步提供了鑒定在內(nèi)源HIO103.1中具有能賦予改變的含油量的突變的植物，和產(chǎn)生這些沒有遺傳修飾的植物的改變的含油量后代的方法。在一種稱為“TILLING”的方法中(用于在基因組中靶向誘導的局部病變)，例如，使用EMS處理，在感興趣植物的種子中誘導突變。生長得到的植物，并且自體受精，該后代用于制備DNA樣品。HIO103.1-特異性PCR被用于鑒定突變的植物是否具有HIO103.1突變。然后測試具有HIO103.1突變的植物的改變的含油量，或者，測試植物的改變的含油量，然后HIO103.1-特異性PCR被用于確定具有改變的含油量的植物是否具有突變的HIO103.1基因。TILLING可鑒定能改變特異性基因的表達或這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見Colbert等(2001)Plant Physiol 126480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18455-457)。
在另一種方法中，候選基因/數(shù)量性狀基因座(QTL)方法可用于標記輔助的育種項目，以鑒定HIO103.1基因或HIO103.1直系同源物中的等位基因或突變，其能賦予改變的含油量(參見Bert等，Theor ApplGenet.2003 Jun；107(1)181-9；以及Lionneton等，Genome.2002 Dec；45(6)1203-15)。因此，在本發(fā)明更進一步的方面中，HIO103.1核酸被用于鑒定具有改變的含油量的植物是否在內(nèi)源HIO103.1中具有突變，或具有能導致改變的含油量的特定等位基因。
雖然參考特定的方法和實施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，應當理解只要不背離本發(fā)明可以進行各種修飾和改變。這里引用的所有出版物都明確地引入這里作為參考，用于描述和公開與本發(fā)明一起使用的組合物和方法的目的。所有引用的專利，專利申請，和參考網(wǎng)址與公共數(shù)據(jù)庫中的序列信息也引入作為參考。
實施例實施例1利用激活標簽構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有HIO103.1表型的植物使用激活標簽“ACTTAG”載體，pSKI015產(chǎn)生突變體(GI# 6537289；Weigel D等，2000)。使用標準方法產(chǎn)生擬南芥轉(zhuǎn)基因植物，基本上如公開的申請PCT WO0183697中所述。簡要地，T0擬南芥(Col-0)植物用攜帶有pSKI015載體的土壤農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，該載體包括來源于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，除草劑抗性選擇性標記基因，和4X CaMV 35S增強子元件。根據(jù)除草劑抗性，在T1世代選擇轉(zhuǎn)基因植物。
通過近紅外光譜法(NIR)，在收獲時分析T3種子庫。使用Bruker22N/F捕獲NIR紅外光譜。使用來自NIR分析的數(shù)據(jù)，和根據(jù)制造商的說明，Bruker軟件用于評估總的種子油和總的種子蛋白含量。通過我們的標準預測的含油量(PDX Oil 3，Predicts hexane Extracted Oil)與40,000個單獨的ACTTAG系進行了比較。為了鑒定高油系，把NIR油結(jié)果與在同一天種植的所有ACTTAG系的平均油結(jié)果進行了比較(相對含油量)。在種子組成分析之后，確定了ACTTAG側(cè)翼序列。在該分析中分析了22,000個具有回收的側(cè)翼序列的系。從22,000評定的ACTTAG系中，819(～4％)具有高油(定義為含油量＞＝種植日平均含油量的107％)。對高油ACTTAG系的該亞型中基因組的協(xié)同作用進行了評估，鑒定了具有2或多個獨立的ACTTAG插入的系，其也顯示高油，以及通過PCR和測序證實了其側(cè)翼序列。
W000130481系(IN040467)，相對于35.0％的種植日平均含油量(PDA為111％)具有NIR確定的39.0％的含油量。W000151561系(IN053303)相對于34.4％的種植日平均含油量，具有NIR確定的38.3％的含油量。
W000130481系(IN040467)在1號染色體的3244182bp處具有確認的ACTTAG插入。
W000151561系(IN053303)在1號染色體的3251749bp處具有確認的ACTTAG插入。
基于在超過一個的顯示高油表型的獨立突變系中，候選基因附近存在包含增強因子的T-DNA插入序列，我們作出結(jié)論插入序列與性狀相關。這些突變系的實際插入數(shù)量是未知的。
實施例2顯示改變的含油量表型的植物中T-DNA插入的表征我們進行了基本上如專利申請PCT WO0183697中所示的標準分子分析，以確定與改變的含油量表型相關的T-DNA插入位點。簡而言之，從顯示改變的含油量表型的植物提取基因組DNA。使用pSKI015載體的特異性引物進行的PCR，確認了來自IN040467和IN053303系的植物中存在35S增強子，Southern印跡分析證實了ACTTAG T-DNA的基因組整合，并表明了在每個轉(zhuǎn)基因系中都存在T-DNA插入。
反向PCR被用于回收T-DNA插入序列側(cè)翼的基因組DNA，然后使用基礎的BLASTN搜索和/或擬南芥信息資源(TAIR)數(shù)據(jù)庫搜索(在arabidopsis.org網(wǎng)址上可獲得)進行序列分析。對于ACTTAG系IN040467，與擬南芥基因組BAC克隆F21M12的1號染色體上的131064-131227核苷酸(GI# 2160155)存在序列同一性，左側(cè)邊界連接處位于131227(GI# 2160155)的下游。該插入序列的異側(cè)側(cè)翼(預測的右側(cè)邊界連接處)沒有確定。IN040467 T-DNA的左側(cè)邊界位于翻譯起始位點5’端的～2637bp處。
對于ACTTAG系IN053303而言，與擬南芥基因組BAC克隆F21M12的1號染色體上的138824-139118核苷酸(GI# 2160155)存在序列同一性，左側(cè)邊界連接處位于138824(GI# 2160155)的下游。該插入序列的異側(cè)側(cè)翼(預測的右側(cè)邊界連接處)沒有確定。IN053303 T-DNA的左側(cè)邊界位于翻譯起始位點5’端的～10204bp處。
實施例3擬南芥HIO103.1序列的分析利用BLAST(Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27260-262)PSORT(Nakai K和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 2434-6)和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)進行序列分析。
針對EST的BLASTN存在5個與該序列匹配的擬南芥EST。
-gi19876633-gi9785424-gi9785476-gi9785503-gi19743182
有許多來自各種植物物種的EST顯示與Atlg09950具有相似性。如有可能，制備每個物種的EST重疊群。以下每個物種的top hit列于如下，并包括于“直系同系物表”中小麥，陸地棉，玉米，大豆，歐洲山楊，水稻，番茄，馬鈴薯，甘藍型油菜和大麥。
1.來自小麥的1個EST＞gi|21634 HBP-1b(亮氨酸拉鏈類型轉(zhuǎn)錄因子)的小麥1b-c38基因2.來自棉花的1個EST重疊群沒有鑒定到Atlg09950同系物3.來自玉米的1個EST重疊群重疊群序列如下面的SEQ ID NO.3所示。
4.來自大豆的1個EST重疊群重疊群序列如下面的SEQ ID NO.4所示。
5.來自白楊的1個EST重疊群重疊群序列如下面的SEQ ID NO.5所示。
6.來自水稻的1個EST＞gi|10423526|dbj|AU108122.1|AU108122 AU108122 Rice callusOryza sativa(japonica栽培品種-組)cDNA克隆C306237.來自番茄的1個EST＞gi|4384471 EST247439番茄子房，TAMU番茄cDNA克隆cLED18D78.來自馬鈴薯的1個EST重疊群重疊群序列如下面的SEQ ID NO.6所示。
針對所有氨基酸的BLASTP結(jié)果蛋白Atlg09950與已知起轉(zhuǎn)錄因子作用的其他植物蛋白具有高度的同源性。前10個BLAST結(jié)果列于如下，并包括于“直系同源物表”中。
1.本身(3個冗余登錄項)＞gi|15218335|ref|NP_172466.1|推測的蛋白；蛋白idAtlg09950.1[擬南芥]＞gi|25372756|pir‖H86233推測的蛋白[輸入]-擬南芥＞gi|2160187|gb|AAB60750.1|與煙草腫瘤-相關蛋白(gb|26453)相似。分值＝1092(389.5比特)，期望值＝5.2e-110，P＝5.2e-1102.來自擬南芥的Atlg58330(4個冗余登錄項)＞gi|18406255|ref|NP_564730.1|表達的蛋白；蛋白idAtlg58330.1，cDNA支持的gi_6520153提供的[擬南芥]＞gi|25372755|pir|T52443推測的蛋白ZW2[輸入]-擬南芥＞gi|6520154|dbj|BAA87938.1|ZW2[擬南芥]＞gi|8979941|gb|AAF82255.1|AC008051_6與來自擬南芥的gb|AB028196的基因ZW2相同分值＝632(227.5比特)，期望值＝2.9e-61，P＝2.9e-613.來自擬南芥的At4g18650(4個冗余登錄項)＞gi|15233970|ref|NP_193600.1|推測的蛋白；蛋白idAt4g18650.1[擬南芥]＞gi|7486277|pir|T04857推測的蛋白F28A21.60-擬南芥＞gi|4539384|emb|CAB37450.1|推測的蛋白[擬南芥]
＞gi|7268659|emb|CAB78867.1|推測的蛋白[擬南芥]分值＝218(81.8比特)，期望值＝2.2e-17，P＝2.2e-17以下序列是At4g18650其他冗余登錄項。不過，它們有幾個核苷酸不同于上面所列的序列。這可能是測序誤差，或單核苷酸多態(tài)性的結(jié)果，對活性很少或沒有影響。
＞gi|28393021|gb|AAO41945.1|未知蛋白[擬南芥]＞gi|28827732|gb|AAO50710.1|未知蛋白[擬南芥]分值＝218(81.8比特)，期望值＝2.2e-17，P＝2.2e-174.來自水稻的1個基因(japonica栽培品種-組)(2個冗余登錄項)＞gi|15408613|dbi|BAB64034.1|P0552C05.19[水稻(japonica栽培品種-組)]＞gi|21104797|dbi|BAB93383.1|OSJNBb0022N24.3[水稻(japonica栽培品種-組)]分值＝204(76.9比特)，期望值＝6.6e-16，P＝6.6e-165.來自煙草的腫瘤相關蛋白＞gi|688423|dbj|BAA05470.1|腫瘤-相關蛋白[粘毛煙草×藍格斯多夫煙草]分值＝177(67.4比特)，期望值＝6.7e-13，P＝6.7e-136.來自擬南芥的At4g18690(4個冗余登錄項)＞gi|5233979|ref|NP_193604.1|推測的蛋白；蛋白idAt4g18690.1[擬南芥]＞gi|7486266|pir|T04861推測的蛋白F28A21.100-擬南芥＞gi|4539388|emb|CAB37454.1|推測的蛋白[擬南芥]＞gi|7268663|emb|CAB78871.1|推測的蛋白[擬南芥]
分值＝158(60.7比特)，期望值＝2.3e-10，P＝2.3e-107.來自水稻的未命名的蛋白(japonica栽培品種-組)(2個冗余登錄項)＞gi|8570052|dbj|BAA96757.1|未命名的蛋白產(chǎn)物[水稻(japonica栽培品種一組)]＞gi|9757677|dbj|BAB08196.1|ESTs AU057825(S21823)，AU057072(S21123)對應于預測基因的一個區(qū)域?！c粘毛煙草×藍格斯多夫煙草腫瘤-相關蛋白的mRNA相似(D26453)[水稻(japonica栽培品種-組)]分值＝155(59.6比特)，期望值＝8.9e-10，P＝8.9e-108.來自擬南芥的At4g18660(4個冗余登錄項)＞gi|15233972|ref|NP_193601.1|推測的蛋白；蛋白idAt4g18660.1[擬南芥]＞gi|7486278|pir|T04858假定的蛋白F28A21.70-擬南芥＞gi|4539385|emb|CAB37451.1|推測的蛋白[擬南芥]＞gi|7268660|emb|CAB78868.1|推測的蛋白[擬南芥]分值＝129(50.5比特)，期望值＝3.1e-09，Sum P(2)＝3.1e-098.小麥的轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b(3個冗余登錄項)＞gi|122772|sp|P23923|HBPB WHEAT轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b＞gi|100809|pir|S15347轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b-小麥＞gi|21635|emb|CAA40102.1|HBP-1b[小麥]分值＝151(58.2比特)，期望值＝1.1e-08，P＝1.1e-0810.來自水稻的未命名蛋白(japonica栽培品種-組)(3個冗余登錄項)＞gi|6498432|dbj|BAA87835.1|未命名的蛋白產(chǎn)物[水稻(japonica栽培品種-組)]
＞gi|11138060-|bdj|BAB17733.1|推測的轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b-小麥[水稻(japonica栽培品種-組)]＞gi|13873003|dbj|BAB44107.1|推測的轉(zhuǎn)錄因子HBP-1b-小麥[水稻(japonica栽培品種-組)]分值＝146(56.5比特)，期望值＝3.3e-08，P＝3.3e-08
最接近的擬南芥同系物
Atlg09950是非分泌性蛋白，而且缺乏信號肽(signalP)。通過TMHMM，沒有檢測到Atlg09950的跨膜結(jié)構(gòu)域。Atlg09950可能定位于細胞核(通過PORT2，40％核，28％細胞質(zhì)，16％線粒體)。Pfam分析顯示Atlg09950與已知的蛋白結(jié)構(gòu)域具有有限的同源性。
由于Atlg09950可能是核蛋白，而且與它們的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外已知的轉(zhuǎn)錄因子具有較低程度的同源性的事實，可以得出結(jié)論，Atlg09950調(diào)節(jié)基因在細胞核中的表達。
實施例4產(chǎn)生具有HIO103.1表型的突變植物本發(fā)明更進一步地提供了鑒定能賦予HIO103.1表型的內(nèi)源HIO103.1或其等位基因中具有突變的植物，而且產(chǎn)生也具有HIO103.1表型并且沒有遺傳修改的這些植物的后代的方法。在一種稱為“TILLING”的方法中(用于在基因組中靶向誘導的局部病變)，例如，使用EMS處理，在感興趣植物的種子中誘導突變。生長得到的植物，并且自體受精，該后代用于制備DNA樣品。HIO103.1-特異性PCR被用于鑒定突變的植物是否具有HIO103.1突變。然后測試具有HIO103.1突變的植物的HIO103.1表型，或者，測試植物的HIO103.1表型，然后HIO103.1-特異性PCR被用于確定具有HIO103.1表型的植物是否具有突變的HIO103.1基因。TILLING可鑒定能改變特異性基因的表達或這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見Colbert等(2001)PlantPhysiol 126480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18455-457)。
在另一種方法中，候選基因/數(shù)量性狀基因座(QTL)法可用于標記輔助的育種項目，以鑒定HIO103.1基因或HIO103.1直系同源物的等位基因或突變，其能賦予HIO103.1表型(參見Foolad等，Theor ApplGenet.(2002)104(6-7)945-958；Rothan等，Theor Appl Genet(2002)105(1)145-159)；Dekkers and Hospital，Nat Rev Genet.(2002)Jan；3(1)22-32)。
因此，在本發(fā)明更進一步的方面中，HIO103.1核酸被用于鑒定具有HIO103.1表型的植物在內(nèi)源HIO103.1中是否具有突變，或與缺乏突變或等位基因的植物相比，是否具有能導致HIO103.1表型的特定等位基因，并產(chǎn)生鑒定的具有遺傳的HIO103.1突變或等位基因和具有HIO103.1表型的植物的后代。
實施例5為了證實Atlg09950的過表達導致高含油種子表型HIO103.1，把該基因克隆到了過表達載體中，所述基因位于強組成型CsVMV啟動子后面，并轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。該轉(zhuǎn)化載體含有能提供對卡那霉素抗性的npmII基因，作為選擇標記。通過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中萌發(fā)種子，在T1世代選擇轉(zhuǎn)化體。把對抗生素具有抗性的植物移植到32細胞平板的土壤中并生長到成熟。在瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)的野生型非轉(zhuǎn)基因Col-0植物移植到相同的平面上作為實驗對照。從轉(zhuǎn)基因和對照植物收獲種子，通過如上所述的NIR評估種子的含油量。來自由于CsVMV啟動子過表達Atlg09950的植物的種子的含油量高于來自野生型植物的種子的含油量。來自過表達Atlg09950的植物的種子，在第一個實驗中顯示增加7％的種子含油量(34.8％的油，相比于對照的32.5％的油)，在第二個實驗中顯示增加6％(35.6％的油，相比于對照的33.5％的油)。這些結(jié)果證明，Atlg09950的過表達導致了種子含油量的增加。
參考文獻Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215403-410，1990.
Altschul，S.F.等，Nucleic Acids Res.253389-3402，1997.
Ausubel FM等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York，N.Y.，1993.
Baldwin D等，Cur Opin Plant Biol.2(2)96-103，1999.
Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27260-262(website atpfam.wustl.edu).
Baulcombe D，Arch Virol Suppl 15189-201，1999.
Cannon等，Plant Molec.Biol.(1990)1539-47.
Ch′ng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)8610006-10010Christensen S等，9thInternational Conference on ArabidopsisResearch.Univ.of Wisconsin-Madison，June 24-28，1998.Abstract 165.
Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)867500-7504.
Cough，SJ and Bent，AF，the Plant Journal 16(6)735-743，1998.
De Block等，Plant Physiol.(1989)91694-701.
Dieffenbach C and Dveksler G(Eds.)PCR PrimerA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989.
Everett等，Bio/Technology(1987)51201Feldmann等，Science 2431351-1354，1989.
Focks N and Benning C，Plant Physiol 11891-101，1998.
Fridborg I等，Plant Cell 111019-1032，1999.
Fujita，T等，Plant J.5645-654，1994.
Geest AH and Hall TC，Plant Mol Biol 32(4)579-88，1996.
Gelvin，S.B.，Schilperoort，R.A.，Varma，D.P.S.，eds.PlantMolecular Biology Manual 1990.
Glick，BR and Thompson，JE，Eds.Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，p.213-221，CRC Press，1993.
Harlow E and Lane D，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988，New York.
Harlow E and Lane D，Using AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1999，New YorkHayashi H等，Science 2581350-1353，1992.
Jako等，Plant Physiology 126(2)861-74，2001.
James DW and Dooner HK(1990)Theor Appl Genet 80，241-245.
Jensen，L.G.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 933487-3491，1996.
Jones JD等，Transgenic Res 1285-2971992.
Kardailsky I等，Science 2861962-1965，1999.
Katavic V.等，Plant Physiology 108(1)399-409，1995.
Kline等，Nature(1987)32770.
Kunkel TA等，Methods Enzymol.204125-39，1991.
Lemieux B.，等，1990，Theor Appl Genet 80，234-240.
Nakamura Y.等，1999，Nucleic Acids Res 27292.
Napoli，等，Plant Cell 2279-289，1990.
Okuley等，Plant Cell 6(1)147-158，1994.
Omirulleh等，Plant Mol Biol.21(3)415-28，1993.
Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(SecondEdition)，ColdSasaki，T.，Nature 420312-316，2002.
Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989.
Schaffer R，等，Cell 931219-1229，1998.
Sheehy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)858805-8809.
Smith，等，Nature 334724-726，1988.
Smith等，Mol.Gen.Genetics(1990)224477-481.
Tabata，T.等，EMBO J.101459-1467，1991.
Thompson JD等，Nucleic Acids Res 224673-4680，1994.
van der Krol等，Biotechniques(1988)6958-976.
van der Krol等，The Plant Cell(1990)2291-299.
Van Haaren MJJ等，Plant Mol Bio 21625-640，1993.
Verdaguer B等，Plant Mol Biol 371055-1067，1998.
Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513959-13964，1998.
Weigel D等，Plant Physiolog y，1221003-1013，2000.
Wilson K等，Plant Cell 8659-671，1996.
Yadav NS等，(1993)Plant Physiol 103，467-476.
序列表<110>農(nóng)業(yè)經(jīng)濟有限責任公司(Agrinomics LLC)<120>生產(chǎn)改變含油量的植物(GENERATION OF PLANTS WITH ALTERED OIL CONTENT)<130>SCT054409-66<150>60/464，558<151>2003-04-22<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>693<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>1atgccaaaca ctagcagctc tcaaagcttc actatcttcg ttgatggttg gttaatccgt 60cacaggtatt tcgttgaaca gcttatgtgt gcttcttcct tggatgaaac taatcgtatc120tctctcgaag aacaacaatc tctcgtggcc cagtttctat ctcactgtct tcaatactac180caagagaaat tcgcctccgt ttccctcgcc ggggacaacg ttttcacttt cttctgccca240ccgtggttta actcctacgc taaacttatt ttatgggtcg gcgatttcaa gccttctctt300gtgtttaaac tcaccgaggt ctccgtggcc gacctcacgc gccaccagaa agaccggatc360tcgagtctta agtcggagac taggaggaaa gagagagaag ttatgcgaga tttcgccctc420gtgcaacaaa gcgtggcgga tccgccggtg atgctcgcgg cgaggcgcgt gggagcggtg480ggaatggtgg acggagaaga aacggatttg gaggaggcga tggaggtgct taaagctggg540atggcggcag cgatgaacaa cgctgatcag ctacggtgtt cgacggtggg gaaagtggtg600gagattctta ctccgccgca agcgattaaa gtgttgagga caatcggaca gcttcacctc660cgtctgagag acagagacca agaaagagct taa 693<210>2<211>230<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana
<400>2Met Pro Asn Thr Ser Ser Ser Gln Ser Phe Thr Ile Phe Val Asp Gly1 5 10 15Trp Leu Ile Arg His Arg Tyr Phe Val Glu Gln Leu Met Cys Ala Ser20 25 30Ser Leu Asp Glu Thr Asn Arg Ile Ser Leu Glu Glu Gln Gln Ser Leu35 40 45Val Ala Gln Phe Leu Ser His Cys Leu Gln Tyr Tyr Gln Glu Lys Phe50 55 60Ala Ser Val Ser Leu Ala Gly Asp Asn Val Phe Thr Phe Phe Cys Pro65 70 75 80Pro Trp Phe Asn Ser Tyr Ala Lys Leu Ile Leu Trp Val Gly Asp Phe85 90 95Lys Pro Ser Leu Val Phe Lys Leu Thr Glu Val Ser Val Ala Asp Leu100 105 110Thr Arg His Gln Lys Asp Arg Ile Ser Ser Leu Lys Ser Glu Thr Arg115 120 125Arg Lys Glu Arg Glu Val Met Arg Asp Phe Ala Leu Val Gln Gln Ser130 135 140Val Ala Asp Pro Pro Val Met Leu Ala Ala Arg Arg Val Gly Ala Val145 150 155 160Gly Met Val Asp Gly Glu Glu Thr Asp Leu Glu Glu Ala Met Glu Val165 170 175Leu Lys Ala Gly Met Ala Ala Ala Met Asn Asn Ala Asp Gln Leu Arg180 185 190Cys Ser Thr Val Gly Lys Val Val Glu Ile Leu Thr Pro Pro Gln Ala
195 200 205Ile Lys Val Leu Arg Thr Ile Gly Gln Leu His Leu Arg Leu Arg Asp210 215 220Arg Asp Gln Glu Arg Ala225 230<210>3<211>1163<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>3gagaactggg gagagtcagc tatggctggt agccctatga ctgacacatc tacagatcca 60gacactgatg agaggaacca gatgtttgaa caaggacttg ttgctgtccc cacagcttct 120gattctagtg acaaatcaag ggacaaacta gatcagaaga cacttcggcg tcttgcccaa 180aatcgtgaag ctgcccggaa aagccgttta cgaaagaagg catacatcca aaaccttgag 240agtagcagat tgaaacttac tcagttagag caagagcttc accagactcg tcaacagggt 300atttttattt ctacatcagg agatcaacct caatcaacaa gcggaaatgg agctttggca 360tttgacatgg agtatgcacg ctggttggaa gagcacaaca aacatgtaaa tgagttgagg 420cttgcagtca atgcacatgc cggtgataat gatctccgtg gtattgttgg tagtgttatg 480gcacactacg atgaattttt caggctcaag ggtgtggcag ctagatcaga tgtttttcat 540gtgctgtctg ggatgtggaa gacccctgct gagagatgtt tcatgtggtt aggtggcttc 600cgatcatctg aggttcttaa gttactggca ggtcacctag agcctcttac tgatcagcag 660cttgttggta tatccaacct gcagcagtcc tcccaacaag ctgaagatgc tctttctcaa 720gggatggaag cattacaaca gtcgcttgca gaaactctag catctggatc cctgggccct 780gctggacctt ctggcaatgt tgcaaattac atgggacaaa tggcgatggc tatgggaaaa 840cttggcaccc tagagaactt tctacgacag gctgataatc tacggctgca aacacttcaa 900caaatgcaac gcatcttaac cacccgacaa tccgcacgag ccctacttgc aataagcgac 960tacttctctc ggctgcgtgc tttgagttct ctttggcttg cccgtccaag ggaataaatt1020
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1.包括植物轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物，該植物轉(zhuǎn)化載體含有編碼或互補于編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的HIO103.1多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，因此相對于對照植物，該轉(zhuǎn)基因植物具有高油表型。
2.權利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，其選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻和花生。
3.從權利要求1的植物獲得的植物部分。
4.權利要求3的植物部分，其是種子。
5.種生產(chǎn)油的方法，其包括培育權利要求1的轉(zhuǎn)基因植物，以及從所述植物回收油。
6.產(chǎn)生高油表現(xiàn)型植物的方法，所述方法包括a)把植物轉(zhuǎn)化載體導入到植物的祖細胞中，該植物轉(zhuǎn)化載體含有編碼或互補于編碼包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的HIO103.1多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，和b)培育該轉(zhuǎn)化的祖細胞以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其中表達所述的多核苷酸序列，而且相對于對照植物，所述的轉(zhuǎn)基因植物顯示改變的含油量表型。
7.通過權利要求6的方法獲得的植物。
8.權利要求7的植物，其選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻和花生。
9.產(chǎn)生具有高油表型的植物的方法，其包括鑒定相比于缺乏等位基因的植物，在導致含油量增加的其HIO103.1基因中具有等位基因的植物，以及產(chǎn)生所述鑒定的植物的后代，其中產(chǎn)生的后代遺傳該等位基因而且具有高油表型。
10.權利要求9的方法，其使用候選基因/QTL法。
11.權利要求9的方法，其使用TILLING法。
全文摘要
本發(fā)明涉及由于HIO103.1核酸的改變的表達，而顯示改變的含油量表型的植物。本發(fā)明更進一步涉及生產(chǎn)具有改變的含油量表型的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1780553SQ200480010916
公開日2006年5月31日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權日2003年4月22日
發(fā)明者喬納森·萊特納, 海因·措恩格·額 申請人:農(nóng)業(yè)經(jīng)濟有限責任公司