專利名稱：：生產(chǎn)改變含油量的植物的制作方法相關(guān)申請本申請要求2004年5月28日提交的美國臨時專利申請60/575,202的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
：操縱農(nóng)作物種子的組成，尤其是種子油類的含量和組成的能力在涉及加工食品油類以及動物飼養(yǎng)油類的農(nóng)業(yè)工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值。農(nóng)作物的種子含有多種有價值的組分，包括油類，蛋白以及淀粉。工業(yè)生產(chǎn)過程可以分離若干或所有這些組分用于專門應(yīng)用的單獨銷售。例如，幾乎60％的美國大豆農(nóng)作物通過大豆加工工業(yè)進(jìn)行壓榨。大豆加工產(chǎn)生高價銷售的精煉油，而殘余物主要作為低價值的飼料銷售(USSoybeanBoard，2001SoyStats)。加拿大油菜(canola)種子被壓榨產(chǎn)生油類以及副產(chǎn)品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜協(xié)會)。幾乎20％的1999/2000年的美國玉米農(nóng)作物經(jīng)過工業(yè)化精煉，主要用于產(chǎn)生淀粉，乙醇以及油類(玉米精煉業(yè)者協(xié)會)。因此，常常需要使種子的含油量最大化。例如，對于諸如大豆以及加拿大油菜的加工含油種子而言，提高種子的絕對含油量將提高這種谷物的價值。對于加工的玉米而言，可能需要根據(jù)其它主要組分的應(yīng)用提高或者降低含油量。降低油類可以通過降低與油類氧化相關(guān)的不希望的味道改善分離的淀粉的質(zhì)量。或者，在味道并不重要的乙醇產(chǎn)生中，提高含油量可以提高總的價值。在許多谷物飼料中，諸如玉米以及小麥，可能希望提高植物含油量，因為油類比諸如碳水化合物的其它種子組分具有較高的能含量。含油種子加工，就像大多數(shù)谷物加工業(yè)一樣是資金密集型產(chǎn)業(yè)；因此產(chǎn)品從低值組分到高價值油類組分的產(chǎn)品分布的較小改變可能對于谷物加工者而言就具有顯著的經(jīng)濟影響。油類的生物技術(shù)處理可以提供組成的改變以及油產(chǎn)量的改進(jìn)。組成的改變尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美國專利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的種子(美國專利5,639,790)等。組成改變的工作主要集中在加工的含油種子但是已經(jīng)可以很容易地延伸至非-含油種子農(nóng)作物包括玉米。雖然對提高含油量具有相當(dāng)?shù)呐d趣，在這一領(lǐng)域目前唯一可行的生物技術(shù)是高油類玉米(HOC)技術(shù)(杜邦，美國專利5,704,160)。HOC利用通過標(biāo)準(zhǔn)的選擇育種連同生產(chǎn)系統(tǒng)中稱為頂交(TopCross)的優(yōu)良品種(不孕雄性)雜交雌性得到的高油類授粉者。頂交高油類系統(tǒng)使玉米收獲的谷物含油量從～3.5％提高到～7％，改善了谷物的能含量。雖然HOC生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，擔(dān)負(fù)全部的土地的種子栽植的低授粉者百分比的系統(tǒng)含有固有風(fēng)險，尤其是在旱年。第二，當(dāng)前HOC領(lǐng)域含油量已經(jīng)平穩(wěn)在大約9％的油類。最后，高油類玉米主要不是生物化學(xué)變化，而是對于提高含油量產(chǎn)生間接結(jié)果的解剖學(xué)上的突變體(提高胚芽尺寸)。為此，可選擇的高油類策略，尤其是來源于改變生化產(chǎn)量的高油類策略將是非常重要的。操作油市場最明顯的目標(biāo)農(nóng)作物是大豆以及油菜籽，并且大量商業(yè)工作(例如美國專利5,952,544；PCT申請WO9411516)證明擬南芥是這些農(nóng)作物中油類代謝的優(yōu)良模型。種子油組合物的生物化學(xué)篩選已經(jīng)鑒定了擬南芥的許多關(guān)鍵生物合成酶基因并且導(dǎo)致農(nóng)業(yè)上重要基因的直向同源物被鑒定出來。例如，利用化學(xué)誘變處理群的篩選已經(jīng)鑒定了其種子顯示脂肪酸成份改變的脂類突變體(LemieuxB等1990，James以及Dooner，1990)。檢測脂肪酸成份改變的T-DNA誘變篩選(Feldmann等1989)鑒定了ω3脫氫酶(FAD3)以及δ-12脫氫酶(FAD2)基因(美國專利5952544；Yadav等，1993；Okuley等，1994)。集中在含油量而非油類質(zhì)量的篩選分析化學(xué)上誘導(dǎo)的皺縮種子或籽粒密度改變的突變體，據(jù)此推斷出改變的植物含油量(Focks以及Benning，1998)。用來鑒定參與非常長鏈脂肪酸產(chǎn)生的酶的另一種篩選鑒定了編碼負(fù)責(zé)降低種子中三酰甘油聚集的甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因的突變(KatavicV等，1995)。此外，還顯示DGATcDNA的種子特異性過表達(dá)與提高的植物含油量有關(guān)(Jako等，2001)。植物中的激活標(biāo)簽法是一種通過插入包含調(diào)節(jié)序列(例如，增強子)的異源核酸構(gòu)建體到植物基因組中而產(chǎn)生隨機突變的方法。調(diào)節(jié)序列可起到增強一個或多個天然植物基因轉(zhuǎn)錄的作用；因此，激活標(biāo)簽法是一種用于產(chǎn)生功能獲得(gain-of-function)，通常是顯性突變體的有效方法(參見，例如，Hayashi等，1992；WeigelD等，2000)。插入的構(gòu)建體提供了一種分子標(biāo)簽，其用于快速鑒定由于其錯表達(dá)引起突變表型的天然植物。激活標(biāo)簽法同時可導(dǎo)致功能喪失的表型。插入可導(dǎo)致天然植物基因的破壞，在該情況中表型通常是隱性的。激活標(biāo)簽法已經(jīng)被用于多種物種，包括煙草和擬南芥，來鑒定各種突變表型和與這些表型相關(guān)的基因(Wilson，等，1996，Schaffer等，1998，F(xiàn)ridborg等，1999；Kardailsky等，1999；ChristensenS等，1998)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有高油類含量表型的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物包括含有編碼或互補于編碼HIO1002多肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化載體。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生油類的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物以及從所述植物回收油類。本發(fā)明還提供了具有高油表型的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包括含有編碼或者互補于編碼高油(下文稱作“HIO1002”)多肽的序列的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化載體。在優(yōu)選的實施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞選自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。在其它實施方案中，所述植物細(xì)胞為種子，花粉，繁殖體或者胚芽細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有編碼HIO1002多肽的核酸序列的飼料，粗粉，谷物，食品或者種子。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物通過包括向植物的祖細(xì)胞導(dǎo)入含有編碼或互補于編碼HIO1002多肽的序列的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體，以及培育轉(zhuǎn)化的祖細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法產(chǎn)生，其中的HIO1002多核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生高油類含量表型。本發(fā)明還提供了從所述轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物細(xì)胞。本發(fā)明還提供了超過約10,000，更優(yōu)選約20,000，甚至優(yōu)選約40,000粒種子的容器，其中超過約10％，更優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％，甚至更優(yōu)選約75％或者更優(yōu)選約90％的種子為來源于本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明還提供了超過約10kg，更優(yōu)選約25kg，甚至更優(yōu)選約50kg種子的容器，其中超過約10％，更優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％，甚至更優(yōu)選約75％或者更優(yōu)選約90％的種子為來源于本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明的任一植物或其部分可以被加工產(chǎn)生飼料，粗粉或者油制劑。用于該目的的尤其優(yōu)選的植物部分為種子。在優(yōu)選的實施方案中，飼料，粗粉或者油制劑被設(shè)計用于反芻動物。生產(chǎn)飼料，粗粉和油制劑的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，參見美國專利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；以及6,156,227。本發(fā)明的粗粉可以與其他的粗粉混合。在優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)自本發(fā)明的植物或者由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的粗粉構(gòu)成任一產(chǎn)品的粗粉組分的超過約0.5％，約1％，約5％，約10％，約25％，約50％，約75％或約90％體積或者重量。在另一實施方案中，可以混合粗粉制劑并可以構(gòu)成混合物超過約10％，約25％，約35％，約50％或約75％的體積。發(fā)明詳述定義除非另有陳述，這里使用的全部技術(shù)以及科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的相同的含義。專業(yè)人員尤其參考Sambrook等，1989，以及AusubelFM等，1993的定義以及術(shù)語。應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法，流程以及試劑，因為這些可以改變。此處所述的術(shù)語“載體”是指設(shè)計用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。“表達(dá)載體”是指可以在異源細(xì)胞中整合并表達(dá)異源DNA片段的載體。許多原核以及真核生物表達(dá)載體是可以市售獲得的。選擇合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域述人員所熟知的?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建體或序列具有一部分序列不是植物細(xì)胞的野生型序列但是在其中表達(dá)。異源的控制序列是指不天然調(diào)節(jié)目前正在調(diào)節(jié)的相同基因表達(dá)的控制序列(即啟動子或增強子)。通常，異源核酸序列不是它們所存在于的細(xì)胞或者基因組的一部分所內(nèi)源產(chǎn)生的，但是已經(jīng)通過傳染，轉(zhuǎn)染，顯微注射，電穿孔法等添加到細(xì)胞中?！爱愒吹摹焙怂針?gòu)建體可以含有控制序列/DNA編碼序列組合，其與野生型植物中發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列組合相同或者不同。此處所述的術(shù)語“基因”是指參與多肽鏈產(chǎn)生的DNA片段，其可能包括或者不包括編碼區(qū)之前以及之后的區(qū)域，例如5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或者“前導(dǎo)”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及單獨的編碼片段(外顯子)以及非-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的內(nèi)含子序列(內(nèi)含子)。這里使用的“重組體”包括已經(jīng)通過導(dǎo)入異源的核酸序列進(jìn)行修飾的細(xì)胞或者載體，或者所述細(xì)胞來源于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非-重組體)形式的細(xì)胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)相同形式的基因或者表達(dá)在人為干預(yù)下完全表達(dá)或者完全不表達(dá)的異常表達(dá)的天然基因。此處所述的術(shù)語“基因表達(dá)”是指基于基因的核酸序列產(chǎn)生的多肽的過程。所述過程包括轉(zhuǎn)錄以及翻譯；因此“表達(dá)”可以是針對多核苷酸或者多肽序列或者兩者。有時，多核苷酸序列的表達(dá)不會引起蛋白翻譯?！斑^表達(dá)”是指相對于其在野生型(或者其它的參考[例如，非-轉(zhuǎn)基因])植物中的表達(dá)，多核苷酸和/或多肽序列表達(dá)增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列。“異位表達(dá)”是指在未-改變或者野生型植物中不自然發(fā)生的，在某時，某地和/或提高水平的表達(dá)?！跋抡{(diào)表達(dá)”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是內(nèi)源性基因相對于其在野生型植物中表達(dá)的降低表達(dá)。術(shù)語“錯誤表達(dá)”以及“改變表達(dá)”包括過表達(dá)，下調(diào)表達(dá)以及異位表達(dá)。在將核酸序列插入細(xì)胞的概念中，術(shù)語“引入的”是指“轉(zhuǎn)染”，或者“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括核酸序列整合到真核或者原核細(xì)胞中，其中核酸序列可以整合入細(xì)胞的基因組(例如染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體或者線粒體DNA)，轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或者瞬間表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。本文使用的“植物細(xì)胞”是指來源于植物的任意細(xì)胞，包括來自未分化的組織(例如愈傷組織)以及植物種子，花粉，繁殖體(progagules)以及胚的細(xì)胞。此處所述的術(shù)語“天然的”以及“野生型”相對于給定植物性狀或者表型是指具有在相同種類的植物本身發(fā)現(xiàn)的特征或者表型的形式。此處所述的術(shù)語關(guān)于植物特性的“修飾”是指轉(zhuǎn)基因植物相對于類似的非-轉(zhuǎn)基因植物的表型的改變。對于轉(zhuǎn)基因植物的“目的表型(性狀)”，指通過T1和/或后代植物證明的可觀察到的或可測量的表型，相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物不顯示該表型(也即，在相似條件下培養(yǎng)或分析的基因型類似的植物)。目的表型可表示對植物的改良，或可提供一種在其他植物中產(chǎn)生改良的方法?！案牧肌笔且环N通過給植物提供獨特的和/或新的品質(zhì)，而增強植物物種或品種的實用性的特征。“改變含油量表型”指遺傳修飾植物的可測量表型，其中與類似的，但是非修飾的植物相比，該植物顯示統(tǒng)計上顯著增加或減少的總體含油量(即，油類占種子質(zhì)量的百分比)。高油表型指總體含油量增加。本文使用的“突變體”多核苷酸序列或者基因與相應(yīng)的野生型多核苷酸序列或者基因在序列或者表達(dá)上不同，其中的差異導(dǎo)致修飾的植物的表型或者性狀。相對于植物或植物株系，術(shù)語“突變體”是指植物或者株系具有修飾的植物表型或性狀，其中修飾的表型或性狀與野生型多核苷酸序列或基因的修飾表達(dá)有關(guān)。此處所述的術(shù)語“T1”是指來自T0植物的種子的植物子代。T1子代是可通過應(yīng)用選擇性試劑篩選的第一系列轉(zhuǎn)化的植物，所述的選擇性試劑為例如抗生素或除草劑，由此轉(zhuǎn)基因植物含有相應(yīng)的抗性基因。術(shù)語“T2”是指通過T1植物的花進(jìn)行自體受精產(chǎn)生的植物子代，所述T1植物之前被篩選作為轉(zhuǎn)基因植物。T3植物是由T2植物等產(chǎn)生的。這里所述的特定植物的“直系子代”來源于所述植物的種子(或者，有時來自其它的組織)且是緊隨的子代；例如，對于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“間接子代”來源于所述植物直系子代的種子(或其它組織)，或來自該家系隨后子代的種子(或其它組織)；例如，T3植物是T1植物的間接子代。此處所述的術(shù)語“植物部分”包括任意的植物器官或組織，包括，但不限于種子，胚，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉和小孢子。植物細(xì)胞可獲自任意的植物器官或組織以及由其制備的培養(yǎng)物?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物種類通常是廣泛的，其可以是可用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物，包括單子葉的和雙子葉的植物。在這里所述的“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)含有異源多核苷酸的植物。異源的多核苷酸可以穩(wěn)定地整合到基因組中，或可以被插入到染色體外。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組中從而使多核苷酸被連續(xù)傳代。植物細(xì)胞，組織，器官或已被導(dǎo)入異源多核苷酸的植物被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)化的”，“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”植物。也含有該異源多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞的直系和間接子代也被視為是轉(zhuǎn)基因的?？梢岳脤⑺璧木幋a所需蛋白的聚核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞的多種方法，并且這些方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是公知的，包括但不限于(1)諸如微注射，電穿孔和微粒介導(dǎo)的遞送(粒子槍(biolistic)或基因槍技術(shù))；(2)病毒介導(dǎo)的遞送技術(shù)；以及(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。最常使用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化方法和粒子槍或微粒轟擊介導(dǎo)的方法(即，基因槍)。通常，核轉(zhuǎn)化是所希望的，但是當(dāng)需要用于特異性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，諸如葉綠體或者造粉體時，可以利用微粒介導(dǎo)遞送所需的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物質(zhì)粒。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通過使用基因工程化的屬于農(nóng)桿菌屬的土壤細(xì)菌實現(xiàn)。具有Ti或Ri質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)以及發(fā)根農(nóng)桿菌(AgrobacteriumRhizogenes)的大量野生型以及卸甲(disarmed)株可用于向植物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。通過將可被基因工程化攜帶任一所需DNA片段的稱作“T-DNA”的特異性DNA轉(zhuǎn)化到很多品種的植物內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物的遺傳轉(zhuǎn)化包括若干步驟。第一步，首先將毒性的農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞彼此接觸，通常這一步稱作“接種”。接種后，使農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞/組織在一起培養(yǎng)幾小時到幾天的時間或者更長時間，培養(yǎng)條件適于生長和T-DNA的轉(zhuǎn)化。這一步稱作“共培養(yǎng)”。共培養(yǎng)和T-DNA遞送以后，用殺細(xì)菌或者制菌劑處理植物細(xì)胞滅殺與外植體接觸或者保留在含有外植體分容器中的農(nóng)桿菌。如果在缺乏任一選擇劑促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞相比非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的優(yōu)先生長的條件下進(jìn)行，通常這一步稱作“延遲”步驟。如果在存在選擇性好壓轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的條件下進(jìn)行，這一步稱作“選擇”步驟。在使用“延遲”步驟時，通常緊接著一個或者多個“選擇步驟”。對于微粒轟擊(美國專利5,550,318(Adams等)；美國專利5,538,880(Lundquist等)，美國專利5,610,042(Chang等)；以及PCT公開WO95/06128(Admas等)；每一個都在此處具體引入作為參考)而言，粒子涂覆有核酸并通過推進(jìn)力遞送到細(xì)胞中。示范性的粒子包括鎢，鉑，并優(yōu)選金。通過加速將DNA遞送到植物細(xì)胞中的方法的示范性實施方案為粒子槍粒子遞送系統(tǒng)(BiolisticsParticleDeliverySystem)(BioRad，Hercule，CA)，該系統(tǒng)可被用于將通過篩子，諸如不銹鋼或者Nytex篩子涂覆DNA或者細(xì)胞的粒子推進(jìn)到用懸浮培養(yǎng)的單子葉植物細(xì)胞覆蓋的過濾器表面上。微粒轟擊技術(shù)是廣泛應(yīng)用的技術(shù)，并且可幾乎被用于轉(zhuǎn)化任一的植物品種。已通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化的植物品種的實例包括單子葉植物品種，諸如玉米(國際公開WO95/06128)(Adams等)，大麥，小麥(美國專利5,563,055(Townsend等)，在此處全文引入作為參考)，大米，燕麥，黑麥(rye)，甘蔗以及高粱；以及大量包括煙草，大豆的雙子葉植物(美國專利5,322,783(Tomes等)，在此處全文引入作為參考)，向日葵，花生，棉花，番茄以及豆類(美國專利5,563,055(Townsend等)在此處全文引入作為參考)。為了不考慮轉(zhuǎn)化方法對轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行選擇或者記分，導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA含有在可再生的植物組織中發(fā)揮產(chǎn)生對植物組織賦予對其他毒性化合物抗性的化合物的基因。用作可選擇的，可篩選的或者可記分的標(biāo)記的目的基因包括但不限于GUS，綠色熒光蛋白(GFP)，熒光酶(LUX)，抗生素或者除草劑耐受基因。抗生素抗性基因的實例包括青霉素，卡那霉素(以及新霉素，G418，博來霉素)；氨甲蝶呤(以及三甲氧芐二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素以及四環(huán)素。編碼參與除草劑耐受的蛋白的多核苷酸分子是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于美國專利5,627,061(Barry等)，美國專利5,633,435(Barry等)，以及美國專利6,040,497(Spencer等)記載的編碼5-烯醇丙酮基莽草酸鹽-3-磷酸鹽合成酶(EPSPS)以及美國專利5,094,945(Comai)描述的用于耐受glyphosate的aroA；描述于美國專利4,810,648(Duerrschnabel等)用于耐受溴苯腈(bromoxynil)的編碼溴苯腈水解酶(Nitrilase)(Bxn)的多核苷酸分子；描述于Misawaetal，(1993)PlantJ.4833-840andMisawaetal，(1994)PlantJ.6481-489用于耐受噠草伏(norflurazon)的編碼八氫番茄紅素脫氫酶(crtI)的多核苷酸分子；描述于Sathasiivan等，(1990)Nucl.AcidsRes.182188-2193a用于耐受磺酰脲類除草劑的編碼乙酰羥基酸合成酶(AHAS，akaALS)的多核苷酸分子；以及描述于DeBlock，etal.(1987)EMBOJ.62513-2519用于耐受草銨膦(Glufosinate)和雙丙氨膦(bialaphos)的bar基因。從多種轉(zhuǎn)化的外植體再生，發(fā)育和培育植物是本領(lǐng)域公知的。這種再生和生長過程通常包括選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及通過常規(guī)的胚芽發(fā)育到生根的小苗發(fā)育階段培育這些單獨的細(xì)胞的階段。類似地再生轉(zhuǎn)基因胚芽和種子。然后將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生根的小苗種植在合適的植物生長介質(zhì)，諸如土壤中。暴露選擇性試劑單存活下來的細(xì)胞，或者在篩選分析中記分為陽性的細(xì)胞可以培養(yǎng)在支持植物體再生的培養(yǎng)基中。將發(fā)育中的小苗轉(zhuǎn)移到土壤較少的植物生長混合物中，并在轉(zhuǎn)移到溫室或者用于成熟的生長室之前使(幼苗)受冷而變得耐寒。本發(fā)明可以與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者組織一起使用。本文中所使用的“可轉(zhuǎn)化的”是指能夠進(jìn)一步繁殖產(chǎn)生植物體的細(xì)胞或者組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到大量插入外源DNA的植物細(xì)胞或者組織是可以轉(zhuǎn)化的，并且在合適的培養(yǎng)條件下，該植物細(xì)胞或者組織可以形成分化的植物。適于這些目的的組織可以包括但不限于未成熟的胚芽，小組織，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，未成熟的花序，莖分生組織，結(jié)外植體，愈傷組織，下胚軸組織，子葉，根和葉?？梢允褂萌我缓线m的培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的實例包括但不限于基于MS-的培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，Physiol.Plant，15473-497，1962)或填充有包括但不限于植物激素，細(xì)胞分裂素，ABA和赤霉素的其他植物生長調(diào)節(jié)劑的基于N6-的培養(yǎng)基(Chu等，ScientiaSinica18659，1975)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種組織培養(yǎng)基，其當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)補充時可以支持植物組織生長和發(fā)育并適于植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基可以作為市售制劑，或者用戶制備以及改進(jìn)的試劑出售。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到用于轉(zhuǎn)化和再生的諸如營養(yǎng)劑和生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補充劑以及其他培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)期間的光密度，pH，可被優(yōu)化用于特定的多種目的的培養(yǎng)溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到將表達(dá)盒穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)基因植物并證實可以操作后，可以通過有性雜交導(dǎo)入其他的植物體內(nèi)。取決于所雜交的品種，可以使用大量標(biāo)準(zhǔn)的繁殖技術(shù)。具有改變的含油量表型的植物的鑒定我們使用擬南芥激活標(biāo)簽篩選來鑒定我們已經(jīng)鑒定并命名為“HIO1002”(Atlg73650；GI#30698954)編碼蛋白(GI#18410409)的基因與改變的含油量表型(具體地，高油表型)之間的關(guān)聯(lián)。剪接變體及其相應(yīng)的GenBank入口如下所述。簡要地，而且如實施例中進(jìn)一步描述的，用pSKI015載體對許多擬南芥植物進(jìn)行了突變，所述載體包含來自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，病毒增強子元件和選擇標(biāo)記基因(Weigel等，2000)。當(dāng)T-DNA插入到轉(zhuǎn)化植物的基因組中時，增強子元件可導(dǎo)致附近基因的上調(diào)，通常在增強子的大約10千堿基(kb)內(nèi)。為了特異性回收表達(dá)選擇性標(biāo)記并因此具有T-DNA插入序列的轉(zhuǎn)化植物，把T1植物暴露于選擇劑。從這些轉(zhuǎn)化的T1植物收集大約15-20顆T2種子，并從全種子提取脂類。進(jìn)行氣相色譜(GC)分析，以測定種子樣本的脂肪酸含量和組成。對顯示高油表型的擬南芥系進(jìn)行了鑒定。通過分析所鑒定的品系中側(cè)翼T-DNA插入片段基因組DNA序列發(fā)現(xiàn)了HIO1002基因與高油表型之間的關(guān)聯(lián)。因此，HIO1002基因和/或多肽可用于開發(fā)具有修飾的含油量表型(“HIO1002表型”)的基因修飾的植物。HIO1002基因可用于產(chǎn)生含油種子作物，其從含油種子加工提供提高的產(chǎn)油量，以及用于生產(chǎn)能提供能量增加的飼料谷物作物用于動物飼養(yǎng)。HIO1002基因可進(jìn)一步用于增加特種油料作物的含油量，以便增加所需稀有脂肪酸的產(chǎn)量。已經(jīng)進(jìn)行遺傳修飾表達(dá)HIO1002的轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)油，其中利用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，并從植物部分(例如，種子)獲得油。HIO1002核酸和名肽擬南芥HIO1002核酸序列提供于SEQIDNO1，3或5以及Genbank登錄號GI#30698954。對應(yīng)的蛋白序列提供于SEQIDNO2以及GI#18410409中。還鑒定了兩個推定的剪接變體，其編碼COOH末端不同于SEQIDNO2的蛋白GI#30698952(SEQIDNO3)，具有相應(yīng)的蛋白序列GI#30698953(SEQIDNO4)，與SEQIDNO2直至E288具有100％的同一性，并結(jié)束于LG，氨基酸位置分別為289以及290；以及GI#42572098(SEQIDNO5)具有相應(yīng)的蛋白序列為GI#42572099(SEQIDNO6)，與SEQIDNO2直至E288具有100％的同一性，并且結(jié)束于GRLQNSKEKEVKDD，氨基酸分別為289-302。擬南芥HIO1002的直系同源物或旁系同源物的核酸和/或蛋白描述于下面的實施例3中。如這里使用的術(shù)語“HIO1002多肽”指全長HIO1002蛋白或其“功能活性”的片段，衍生物(變體)或者直系同源物，指該蛋白片段，衍生物或者直系同源物顯示與SEQIDNO2，4或6的多肽相關(guān)的一種或多種功能活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，功能活性HIO1002多肽，當(dāng)在植物中錯表達(dá)時，導(dǎo)致改變的含油量表型。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，HIO1002多肽在植物中的錯表達(dá)導(dǎo)致高油表型。在另一個實施方案中，功能活性HIO1002多肽當(dāng)在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)時，能拯救缺陷的(包括缺失的)內(nèi)源HIO1002活性；該拯救多肽可來自與具有缺陷活性的植物相同的或不同的物種。在另一個實施方案中，全長HIO1002多肽的功能活性片段(也即，具有SEQIDNO2的序列的天然多肽或其天然存在的直系同源物)保留與全長HIO1002多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性，例如信號活性，結(jié)合活性，催化活性或細(xì)胞或者細(xì)胞外定位活性。HIO1002片段優(yōu)選包括HIO1002結(jié)構(gòu)域，例如C-或N-末端或者催化結(jié)構(gòu)域，尤其，優(yōu)選包括HIO1002蛋白的至少10個，優(yōu)選至少20個，更優(yōu)選至少25個，最優(yōu)選至少50個的連續(xù)氨基酸。功能域可使用PFAM程序進(jìn)行鑒定(BatemanA等，1999NucleicAcidsRes27260-262)。優(yōu)選HIO1002片段包括一或者多個跨膜結(jié)構(gòu)域。全長HIO1002多肽或其片段的功能活性變體包括具有氨基酸插入序列，缺失，或者置換，但保留與全長HIO1002多肽相關(guān)的一種或多種生物學(xué)特性的多肽。有時，產(chǎn)生的變體能改變HIO1002多肽的翻譯后加工。例如，與天然多肽相比，變體可以具有改變的蛋白轉(zhuǎn)運或者蛋白定位特性，或者改變的蛋白的半衰期。這里使用的術(shù)語“HIO1002核酸”包含具有SEQIDNO1，3或5提供的序列，或者與SEQIDNO1，3或5提供的序列互補的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直系同源物。本發(fā)明的HIO1002核酸可以是來源于基因組DNA或者cDNA的DNA，或者RNA。在一個實施方案中，功能活性的HIO1002核酸編碼或者互補于編碼功能活性的HIO1002多肽的核酸?；蚪MDNA包括在該定義內(nèi)，其用作原始RNA轉(zhuǎn)錄本(也即，mRNA前體)的模板，其在編碼功能活性HIO1002多肽之前需要加工，例如剪接。HIO1002核酸可包括其他的非編碼序列，其可以轉(zhuǎn)錄或者不被轉(zhuǎn)錄；這種序列包括5’和3’UTRs，聚腺苷酸化信號和尤其是本領(lǐng)域已知的控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。一些多肽需要加工事件，例如蛋白水解剪切，共價修飾，等等，以便完全活化。因此，功能活性核酸可編碼成熟的或者預(yù)先加工的HIO1002多肽，或者中間體形式。HIO1002多核苷酸還可以包括異源編碼序列，例如，編碼包括的促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記或者轉(zhuǎn)化標(biāo)記的序列。在另一個實施方案中，功能活性HIO1002核酸可用于例如，通過反義抑制，共抑制等產(chǎn)生功能喪失的HIO1002表型。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的HIO1002核酸，包括編碼或互補于編碼HIO1002多肽的序列的核酸序列，該HIO1002多肽與SEQIDNO2，4或6提供的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或以上的序列同一性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的HIO1002多肽包括與SEQIDNO2，4或6的HIO1002多肽序列具有至少50％或60％同一性的多肽序列，而且與SEQIDNO2，4或6的HIO1002多肽序列可具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性，諸如一或者多個跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，HIO1002多肽包括與SEQIDNO2，4或6所示的多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性的多肽序列。在另一個實施方案中，HIO1002多肽包括與SEQIDNO2，4或6的多肽序列的全長具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性的多肽序列并且包括一或者多個跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一個方面，HIO1002多核苷酸序列與SEQIDNO1，3或5所示的HIO1002核酸序列的全長或是與這種HIO1002序列互補的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，而且可包含與SEQIDNO1，3或5所示的HIO1002序列或其功能活性片段，或互補序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。這里使用的，特定的目標(biāo)序列或其特定部分的“百分比(％)序列同一性”被定義為如果需要獲得最大的百分比序列同一性，如通過WU-BLAST-2.0a19程序(Altschul等，J.Mol.Biol.(1990)215403-410)所產(chǎn)生的，其中搜索參數(shù)設(shè)為缺省值，在進(jìn)行序列比對和引入缺口之后，候選的衍生序列中核苷酸或氨基酸與目標(biāo)序列(或其特定部分)中核苷酸或氨基酸相同的百分比。HSPS和HSPS2參數(shù)是機動值，而且是通過程序本身取決于特定序列的組成和在其中對感興趣的序列進(jìn)行搜索的特定數(shù)據(jù)庫的組成而確定的?！埃ネ恍灾怠蓖ㄟ^把匹配的相同核苷酸或氨基酸的數(shù)目除以報告的百分比同一性的序列的序列長度而確定?！鞍俜直?％)氨基酸序列相似性”通過進(jìn)行與確定百分比氨基酸序列同一性相同的計算而確定，但是在計算中除了相同的氨基酸之外還包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代，即其中氨基酸被具有相似特性的另一個氨基酸所取代，而對蛋白的折疊或活性沒有顯著的影響?？梢曰ハ嗳〈姆枷阕灏被釣楸奖彼?，色氨酸和酪氨酸；可互換的疏水氨基酸為亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸和纈氨酸；可互換的極性氨基酸為谷氨酰胺和天門冬酰胺；可互換的堿性氨基酸為精氨酸，賴氨酸和組氨酸；可互換的酸性氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸；可互換的小氨基酸為丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。目標(biāo)核酸分子的衍生核酸分子包括能選擇性地與SEQIDNO1的核酸序列雜交的序列。雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度可通過溫度，離子強度，pH，以及雜交和洗滌期間變性劑諸如甲酰胺的存在來進(jìn)行控制。通常使用的條件是大家所熟知的(參見，例如，CurrentProtocolinMolecularBiology，Vol.1，Chap.2.10，JohnWiley&Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，MolecularCloning，ColdSpringHarbor(1989))。在一些實施方案子中，本發(fā)明的核酸分子能在如下的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與包含SEQIDNO1的核苷酸序列的核酸分子雜交含有核酸的濾紙，在含有6X單倍濃度的檸檬酸鹽(SSC)(1XSSC為0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉；pH7.0)，5XDenhardt溶液，0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml的鯡魚精子DNA的溶液中，65℃預(yù)雜交8小時至過夜；在含有6XSSC，1XDenhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸鈉的溶液中，65℃雜交18-20小時；在含有0.1XSSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中，65℃洗滌濾紙1小時。在其他的實施方案中，使用如下的中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包含核酸的濾紙，在含有35％甲酰胺，5XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mMEDTA，0.1％PVP，1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中，40℃預(yù)處理6小時；在含有35％甲酰胺，5XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，5mMEDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鮭魚精子DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中，40℃雜交18-20小時；接著，在含有2XSSC和0.1％SDS的溶液中，55℃洗滌兩次1小時。或者，可使用如下的低嚴(yán)謹(jǐn)條件在含有20％甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5XDenhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中，37℃孵育8小時到過夜；在相同的緩沖液中雜交18到20小時；在1×SSC中，大約37℃洗滌濾紙1小時。由于遺傳密碼的簡并性，可產(chǎn)生許多編碼HIO1002多肽的多核苷酸序列。例如，根據(jù)特定宿主生物顯示的最佳密碼子使用，可選擇密碼子以增加多肽在特定的宿主物種中的表達(dá)(參見，例如，Nakamura等，1999)。這種序列變體可用于本發(fā)明的方法中。本發(fā)明的方法可使用擬南芥HIO1002的直系同源物。鑒定其他植物品種中直系同源物的方法是本領(lǐng)域已知的。一般說來，不同物種中的直系同源物保持相同的功能，由于存在一個或多個蛋白基序和/或三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)化過程中，當(dāng)物種形成后發(fā)生基因重復(fù)事件時，一個物種，例如擬南芥中的單個基因可能相應(yīng)于另一個物種中的多個基因(旁系同源物)。這里使用的，術(shù)語“直系同源物”包括旁系同源物。當(dāng)序列數(shù)據(jù)可用于特定的植物物種時，通常可通過序列同源性分析，例如BLAST分析，一般使用蛋白餌序列，來鑒定直系同源物。如果來自正向BLAST結(jié)果的最合適序列檢索到了反向BLAST中原始的查詢序列，該序列則為可能的直系同源物(HuynenMA和BorkP，ProcNatlAcadSci(1998)955849-5856；HuynenMA等，GenomeResearch(2000)101204-1210)。用于多個序列比對的程序，例如CLUSTAL(ThompsonJD等，1994，NucleicAcidsRes224673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守區(qū)域和/或殘基，并產(chǎn)生系統(tǒng)樹。在表示來自不同物種的多個同源序列(例如，通過BLAST分析檢索到的)的系統(tǒng)樹中，來自2個物種的直系同源序列，相對于來自2個物種的所有其他的序列，通常在系統(tǒng)樹上顯得最靠近。結(jié)構(gòu)串線(threading)或蛋白折疊的其他分析(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的軟件)也可鑒定可能的直系同源物。核酸雜交方法也可用于尋找直向同源基因，而且當(dāng)不能獲得序列數(shù)據(jù)是優(yōu)選的。簡并PCR和cDNA或基因組DNA文庫篩選是尋找相關(guān)基因序列的常見方法，而且是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Sambrook，1989；DieffenbachandDveksler，1995)。例如，Sambrook等中描述了用于從感興趣的植物物種產(chǎn)生cDNA文庫，和用部分同源基因探針探測文庫的方法。擬南芥HIO1002編碼序列的高度保守部分可用作探針。HIO1002直系同源核酸可在高度，中度或低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO1，3或5的核酸雜交。擴增或分離假定的直系同源物的部分之后，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆該部分并進(jìn)行測序，而且用作探針來分離完整的cDNA或基因組克隆?；蛘撸梢詥覧ST方案來產(chǎn)生感興趣的植物物種的序列信息數(shù)據(jù)庫。在另一種方法中，能特異性結(jié)合已知的HIO1002多肽的抗體，用于直系同源物分離(參見，例如，HarlowandLane，1988，1999)。Western印跡分析可確定HIO1002直系同源物(也即，直系同源蛋白)存在于特定植物物種的粗提取物中。當(dāng)觀察反應(yīng)性時，可通過篩選顯示特定植物物種的表達(dá)文庫，來分離編碼候選直系同源物的序列。如Sambrook等1989中所述，可在各種商業(yè)可獲得的載體中構(gòu)建表達(dá)文庫，包括λgt11。一旦通過任何這些方法鑒定到了候選的直系同源物，候選的直系同源序列可用作餌(“查詢”)，用于從其中已經(jīng)鑒定到HIO1002核酸和/或多肽序列的擬南芥或其他的物種中對序列進(jìn)行反向BLAST?？墒褂萌魏慰捎玫姆椒▉慝@得HIO1002核酸和多肽。例如，通過如前所述的篩選DNA文庫或通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，分離感興趣的cDNA或基因組DNA序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的?；蛘?，可合成核酸序列。任何已知的方法，例如位點定向誘變(KunkelTA等，1991)，可用于將所需的改變引入到克隆的核酸中。通常，本發(fā)明的方法包括把所需形式的HIO1002核酸整合到用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物表達(dá)載體中，并在宿主植物中表達(dá)HIO1002多肽。分離的HIO1002核酸分子是不同于天然發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置的核酸分子，而且從至少一個雜質(zhì)核酸分子中鑒定和分離，該雜質(zhì)核酸分子通常結(jié)合在HIO1002核酸的天然來源中。然而，分離的HIO1002核酸分子包括包含在通常表達(dá)HIO1002的細(xì)胞中的HIO1002核酸分子，例如，該核酸分子位于與天然細(xì)胞的核酸分子不同的染色體位置中。產(chǎn)生具有改變的含油量表型的遺傳修飾的植物HIO1002核酸和多肽可用于產(chǎn)生具有修飾的含油量表型的遺傳修飾的植物。這里使用的，“修飾的含油量表型”可指植物任何部分中修飾的含油量；經(jīng)常在種子中觀察到修飾的含油量。在一個優(yōu)選的實施方案中，植物中HIO1002基因的改變表達(dá)可用于產(chǎn)生具有高油表型的植物。這里所述的方法一般適用于所有植物。盡管在擬南芥中進(jìn)行了激活標(biāo)簽法和基因鑒定，但是HIO1002基因(或其直系同源物，變體或片段)可在任何植物種類中表達(dá)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)油植物，其在特異性器官，主要是在種子中生產(chǎn)和儲存三?；视汀＿@些物種包括大豆(Glycinemax)，油菜籽和canola(包括甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)，B.campestris)，向日葵(Helianthusannus)，棉花(陸地棉)，玉米(Zeamaya)，可可(Theobromacacao)，紅花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeisguineensis)，椰子(Cocosnucifera)，亞麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinuscommunis)和花生(Arachishypogaea)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生果實和蔬菜的植物，產(chǎn)生谷物的植物，產(chǎn)生堅果的植物，快速周期的蕓苔品種，紫花苜蓿(Medicagosativa)，煙草(Nicotiana)，草坪草(Poaceaefamily)，其他的飼料作物，和可能是稀有脂肪酸來源的野生物種。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解本領(lǐng)域存在的各式各樣的轉(zhuǎn)化技術(shù)，而且新技術(shù)不斷地變成可用的。適于靶宿主植物的任何技術(shù)可用于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可引入各種形式的構(gòu)建體，包括但不限于DNA鏈，到質(zhì)粒，或人工染色體中。可通過各種技術(shù)將構(gòu)建體引入到靶植物細(xì)胞中，包括但不限于異源核酸的土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，電穿孔法，顯微注射，微粒轟擊，磷酸鈣-DNA共沉淀或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化優(yōu)選是永久的，也即通過使導(dǎo)入的表達(dá)構(gòu)建體整合到宿主植物基因組中，以便該導(dǎo)入的構(gòu)建體傳遞給連續(xù)的植物世代。根據(jù)計劃的用途，包含HIO1002多核苷酸的異源核酸構(gòu)建體可編碼完整的蛋白或其生物學(xué)活性部分。在一個實施方案中，雙元的基于Ti的載體系統(tǒng)可用于轉(zhuǎn)移多核苷酸。標(biāo)準(zhǔn)的土壤農(nóng)桿菌雙元載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且許多是可商業(yè)獲得的(例如，pBI121ClontechLaboratories，PaloAlto，CA)。構(gòu)建體或者載體可以包括植物啟動子來表達(dá)所選擇的核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子為植物啟動子。用土壤農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化植物的最佳方法隨待轉(zhuǎn)化的植物種類而變化。用于土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的示例性方法包括轉(zhuǎn)化來源于無菌籽苗和/或小植株的胚軸，芽，莖或葉組織的外植體。這種轉(zhuǎn)化的植物可有性繁殖，或通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)繁殖。先前已經(jīng)描述了土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用于許多不同類型的植物，而且可在科學(xué)文獻(xiàn)中找到這種轉(zhuǎn)化方法。其中特別相關(guān)的是轉(zhuǎn)化商業(yè)上重要的作物，例如油菜籽(DeBlock等，1989)，向日葵(Everett等，1987)和大豆(Christou等，1989；Kline等，1987)的方法。根據(jù)表達(dá)水平，發(fā)生表達(dá)的組織類型和/或表達(dá)的發(fā)育階段，可調(diào)節(jié)HIO1002的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯)。許多異源調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子和增強子)可用于控制HIO1002核酸的表達(dá)。這些包括組成型，誘導(dǎo)型和可調(diào)節(jié)的啟動子，以及能以組織或瞬時特異性方式調(diào)控表達(dá)的啟動子和增強因子。示例性的組成型啟動子包括樹莓E4啟動子(美國專利5,783,393和5,783,394)，胭脂堿合成酶(NOS)啟動子(Ebert等，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A)845745-5749，1987)，章魚堿合成酶(OCS)啟動子(其由根癌農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒攜帶)，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等，PlantMol.Biol，9315-324，1987)以及CaMV35S啟動子(Odelletal.，Nature313810-812，1985andJonesJDetal，1992)的花椰菜病毒啟動子，甜瓜肌動蛋白啟動子(公開的PCT申請WO0056863)，玄參花葉病毒35S-啟動子(美國專利5,378,619)，光誘導(dǎo)的來自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基的啟動子(ssRUBISCO)，Adh啟動子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)846624-6628，1987)，蔗糖合成酶啟動子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)874144-4148，1990)，R基因復(fù)合啟動子(Chandler等，ThePlantCell11175-1183，1989)，葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子，CsVMV啟動子(VerdaguerB等，1998)；這些啟動子也被用于產(chǎn)生在植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體，例如PCT公開WO84/02913。示例性的組織特異性啟動子包括番茄E4和E8啟動子(美國專利5,859,330)和番茄2AII基因啟動子(VanHaarenMJJ等，1993)。在一個優(yōu)選的實施方案中，HIO1002表達(dá)在來自其表達(dá)與早期種子和/或胚胎發(fā)育相關(guān)的基因的調(diào)節(jié)序列的調(diào)控下。實際上，在優(yōu)選的實施方案中，所使用的啟動子為種子增強的啟動子。這種啟動子的實例包括來自諸如napin(Kridl等，SeedSci.Res.1209219，1991)，球蛋白(BelangerandKriz，Genet.，129863-872，1991，GenBankAccessionNo.L22295)，γ玉米醇溶蛋白Z27(Lopes等，MolGenGenet.，247603-613，1995)，L3油質(zhì)蛋白啟動子(美國專利6,433,252)，菜豆蛋白(Bustos等，PlantCell，1(9)839-853，1989)，arcelin5(US2003/0046727)，大豆7S啟動子，7Sα啟動子(US2003/0093828)，大豆7Sα’β黃豆蛋白啟動子，7Sα’啟動子(Beachy等，EMBOJ.，43047，1985；Schuler等，NucleicAcidRes.，10(24)8225-8244，1982)，大豆胰蛋白酶抑制劑(Riggs等，PlantCell1(6)609-621，1989)，ACP(Baerson等，PlantMol.Biol.，22(2)255-267，1993)，硬脂酰-ACP脫氫酶(Slocombe等，PlantPhysiol.104(4)167-176，1994)，β黃豆蛋白的大豆a′亞基(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.838560-8564，1986)，蠶豆USP(P-Vf.Usp，SEQIDNO1，2，和3(US2003/229918)以及玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子(Hong等，PlantMol.Biol.，34(3)549-555，1997)等基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)域。還包括玉米醇溶蛋白，是在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)的一組貯藏蛋白。玉米醇溶蛋白基因的基因組克隆已被分離(Pedersen等，Cell291015-1026，1982；以及Russell等，TransgenicRes.6(2)157-168)并且來自這些克隆的啟動子，包括15kD，16kD，19kD，22kD，27kD以及這些基因也可被利用。已知例如在玉米內(nèi)發(fā)揮功能的其他啟動子包括下列基因的啟動子waxy，Brittle，Shrunken2，分支酶I和II，淀粉合成酶，去分支酶，油質(zhì)蛋白，谷蛋白以及蔗糖合成酶。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的豆科植物基因包括V.faba豆球蛋白(Baumlein等，1991，MolGenGenet225121-8；Baumlein等，1992，PlantJ2233-9)，V.fabausp(Fiedler等，1993，PlantMolBiol22669-79)，豌豆convicilin(Bown等，1988，BiochemJ251717-26)，豌豆凝集素(dePater等，1993，PlantCell5877-86)，P.vulgarisβ菜豆蛋白(Bustos等，1991，EMBOJ101469-79)，P.vulgarisDLEC2和PHS[β](Bobb等，1997，NucleicAcidsRes25641-7)和大豆β-conglycinin，7S貯藏蛋白(Chamberland等，1992，PlantMolBiol19937-49)。其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的谷類基因包括水稻谷蛋白(″GluA-3，″YoshiharaandTakaiwa，1996，PlantCellPhysiol37107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，PlantMolBiol301207-21；Washida等，1999，PlantMolBiol401-12；″Gt3，″Leisy等，1990，PlantMolBiol1441-50)，水稻醇溶谷蛋白(Zhou&Fan，1993，TransgenicRes2141-6)，小麥醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBOJ12545-54)，玉米醇溶蛋白(Z4，Matzke等，1990，PlantMolBiol14323-32)和大麥B-hordein(Entwistle等，1991，PlantMolBiol171217-31)。其他的其啟動子與早期種子和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，PhysiolPlant112233-243)，甘藍(lán)型油菜napin，2S貯藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，JBiolChem26212196-201；Stalberg等，1993，PlantMolBiol199323671-83；Ellerstrom等，1996，PlantMolBiol321019-27)，甘藍(lán)型油菜油質(zhì)蛋白(Keddie等，1994，PlantMolBiol24327-40)，擬南芥油質(zhì)蛋白(Plant等，1994，PlantMolBiol25193-205)，擬南芥FAE1(Rossak等，2001，PlantMolBiol46717-25)，刀豆conA(Yamamoto等，1995，PlantMolBiol27729-41)和長春花異胡豆苷合成酶(Str，OuwerkerkandMemelink，1999，MolGenGenet261635-43)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用來自在油生物合成期間表達(dá)的基因的調(diào)節(jié)序列(參見，例如，美國專利5,952,544)?？蛇x擇的啟動子來自于植物貯藏蛋白基因(Bevan等，1993，PhilosTransRSocLondBBiolSci342209-15)。其他可使用的啟動子例如描述于美國專利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435和4,633,436。在另一個方面，有時可能需要抑制宿主細(xì)胞中內(nèi)源HIO1002的表達(dá)。用于實施本發(fā)明該方面的示例性方法包括，但不限于反義抑制(Smith等，1988；vanderKrol等，1988)；共抑制(Napoli，等，1990)；核酶(PCT公開WO97/10328)；和正義與反義的組合(Waterhouse，等，1998)。抑制宿主細(xì)胞中內(nèi)源序列的方法，一般使用待抑制序列的至少一部分的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種序列可以與內(nèi)源序列的編碼以及非編碼區(qū)同源。反義抑制可使用完整的cDNA序列(Sheehy等，1988)，部分cDNA序列包括5’編碼序列(Cannon等，1990)或3’非編碼序列(Ch′ng等，1989)的片段。共抑制技術(shù)可使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990；vanderKrol等，1990)或部分cDNA序列(Smith等，1990)?？蛇M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分子和遺傳試驗，以更進(jìn)一步分析基因與觀察到的表型之間的關(guān)聯(lián)。示例性技術(shù)描述如下。DNA/RNA分析例如，通過原位雜交，可通過突變體與野生型系的對比確定階段-與組織特異性基因表達(dá)模式?？蛇M(jìn)行基因，尤其是側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)甲基化狀況的分析。其他的適用技術(shù)包括過表達(dá)，異位表達(dá)，在其他植物物種中的表達(dá)和基因敲除(反向遺傳學(xué)，靶向敲除，病毒誘導(dǎo)的基因沉默[VIGS，參見BaulcombeD，1999])。在優(yōu)選的應(yīng)用中，通過微陣列分析的表達(dá)分布被用于同時測量許多不同基因表達(dá)中的差異或誘導(dǎo)的改變。用于微陣列分析的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(SchenaM等，Science(1995)270467-470；BaldwinD等，1999；DangondF，PhysiolGenomics(2000)253-58；vanHalNL等，JBiotechnol(2000)78271-280；RichmondTandSomervilleS，CurrOpinPlantBiol(2000)3108-116)?？梢赃M(jìn)行單獨標(biāo)簽的株系的表達(dá)分布分析。這種分析可鑒定由于感興趣基因的過表達(dá)而協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的其它基因，其可有助于把未知基因置于特定的途徑。基因產(chǎn)物的分析基因產(chǎn)物分析可包括重組蛋白表達(dá)，抗血清產(chǎn)生，免疫定位，催化或其他的活性的生物化學(xué)分析，磷酸化狀況分析和通過酵母雙雜交分析進(jìn)行與其他蛋白之間的相互作用分析。途徑分析途徑分析可包括，基于它的錯表達(dá)表型或通過與相關(guān)基因的序列同源性，把基因或基因產(chǎn)物置于特定的生物化學(xué)，新陳代謝或信號途徑中?；蛘?，分析可包括與野生型系和其它突變系的遺傳交叉(產(chǎn)生雙突變體)，以把基因指定于途徑中，或確定在途徑中突變對下游“報告”基因表達(dá)的作用。產(chǎn)生具有改變含油量的表型的突變植物本發(fā)明更進(jìn)一步提供了鑒定在內(nèi)源HIO1002或者其等位基因中具有能賦予這些植物及其后代HIO1002表型的突變的非轉(zhuǎn)基因植物的方法。在一種稱為“TILLING”的方法中(用于在基因組中靶向誘導(dǎo)的局部病變)，例如，使用EMS處理，在感興趣植物的種子中誘導(dǎo)突變。培養(yǎng)得到的植物，并且自花受精，后代用于制備DNA樣品。HIO1002-特異性PCR被用于鑒定突變的植物是否具有HIO1002突變。然后測試具有HIO1002突變的植物含油量的改變，或者，測試植物的含油量的改變，然后使用HIO1002-特異性PCR確定具有改變含油量的植物是否具有突變的HIO1002基因。TILLING可鑒定能改變特異性基因的表達(dá)或由這些基因編碼的蛋白的活性的突變(參見Colbert等(2001)PlantPhysiol126480-484；McCallum等(2000)NatureBiotechnology18455-457)。在另一種方法中，候選基因/數(shù)量性狀基因座(QTL)方法可用于標(biāo)記輔助的育種項目，以鑒定HIO1002基因或HIO1002直系同源物中能賦予含油量的改變的等位基因或突變(參見Bert等，TheorApplGenet.2003Jun；107(1)181-9；以及Lionneton等，Genome.2002Dec；45(6)1203-15)。因此，在本發(fā)明更進(jìn)一步的方面中，HIO1002核酸被用于鑒定具有改變的含油量的植物是否在內(nèi)源HIO1002中具有突變，或是否具有能導(dǎo)致含油量改變的特定等位基因。雖然參考特定的方法和實施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解只要不背離本發(fā)明可以進(jìn)行各種修飾和改變。這里引用的所有出版物都明確地在這里作為參考引入，用于描述和公開可與本發(fā)明一起使用的組合物和方法的目的。所有引用的專利，專利申請和參考的網(wǎng)站和公共數(shù)據(jù)庫中的序列信息也引入作為參考。實施例實施例1利用激活標(biāo)簽構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有HIO1002表型的植物使用激活標(biāo)簽“ACTTAG”載體，pSKI015產(chǎn)生突變體(GI#6537289；WeigelD等，2000)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生擬南芥轉(zhuǎn)基因植物，基本上如公開的申請PCTWO0183697中所述。簡要地，T0擬南芥(Col-0)植物用攜帶有pSKI015載體的土壤農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該載體包括來源于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA，除草劑抗性選擇性標(biāo)記基因和4XCaMV35S增強子元件。根據(jù)除草劑抗性，在T1世代選擇轉(zhuǎn)基因植物。在收獲時通過近紅外光譜學(xué)(NIR)分析T3種子。利用Bruker22N/F捕獲NIR紅外光譜。利用NIR分析的數(shù)據(jù)和參考廠商說明通過Bruker軟件估計總種子油的含量以及總種子蛋白含量。將我們的校準(zhǔn)預(yù)測的油含量(ren油14731d+sline.q2，預(yù)測己烷萃取油)，緊接美國石油化學(xué)家學(xué)會官方的方法以及推薦作法(OfficialandRecommendedPracticesofAmericanOilChemistsSociety)，第五版本，AOCS，Champaign，Ill的AOCS法AM1-92的一般方法，與38,090個個體ACTTAG系進(jìn)行比較。種子組成分析之后，通過反向PCR以及測序確定各品系基因組中ACTTAG元件的位置。在這個分析中考慮38,090個具有回收的側(cè)翼序列的品系。由于種植了38,090個品系并且長滿12個月，將種子油含量值校正到使環(huán)境差異的影響最小化，所述環(huán)境差異可以改變種子油含量。計算所種植的品系每天的平均種子油含量及其標(biāo)準(zhǔn)偏差。種子油含量表示為“相對標(biāo)準(zhǔn)偏差距離”(SD距離)，通過從各品系種子油含量減去種植日平均種子油含量并由那天標(biāo)準(zhǔn)偏差除差異進(jìn)行計算。該標(biāo)準(zhǔn)化可以比較整年生長的種植種子中的種子油含量。通過評價38,090個品系中所有受ACTTAG元件影響的基因鑒定過表達(dá)時引起高種子油表現(xiàn)型的基因。通過下列方法實現(xiàn)；首先，鑒定各品系中可能由ACTTAG元件激活的基因并將品系的種子油含量指定給這些基因；第二，當(dāng)特定的基因過表達(dá)時通過獲得各基因單獨的種子油值的平均值確定種子油含量。由于評價了38,090個品系，并且各元件影響平均2.5個基因，各基因?qū)⒕哂?個種子油值的平均值。具有最高平均SD距離的基因被確定為過表達(dá)時引起高種子油的基因。過表達(dá)At1g73650，HIO1002的植物具有種植日平均128％的油含量，如下表1所示。表1.實施例2顯示改變的含油量表型的植物中T-DNA插入序列的表征我們進(jìn)行了基本上如專利申請PCTWO0183697中所示的標(biāo)準(zhǔn)分子分析，以確定與改變的含油量表型相關(guān)的T-DNA插入位點。簡而言之，從顯示改變的含油量表型的植物提取基因組DNA。使用pSKI015載體的特異性引物進(jìn)行的PCR，確認(rèn)了來自HIO1002油系的植物中存在35S增強子，Southern印跡分析證實了ACTTAGT-DNA的基因組整合，并且顯示單獨的T-DNA插入序列在轉(zhuǎn)基因系中的存在。反相PCR被用于回收T-DNA插入序列側(cè)翼的基因組DNA，然后使用基礎(chǔ)的BLASTN搜索和/或擬南芥信息源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(可以在公眾可以進(jìn)入的擬南芥信息資源網(wǎng)站獲得)進(jìn)行序列分析。實施例3HIO1002表型的復(fù)述為了檢驗At1g73650的過表達(dá)是否引起高種子油表型，將從過表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子中的油含量與來自非-轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锓N子中的油含量。為了這么做，將At1g73650克隆到種子特異性CsVMV啟動子后植物轉(zhuǎn)化載體中并利用花浸漬法轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。該植物轉(zhuǎn)化載體含有由RE4啟動子啟動的nptII基因提供針對卡那霉素的抗性并用作選擇性標(biāo)記。將來自轉(zhuǎn)化的植物的種子接種在含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上。7天后，轉(zhuǎn)基因植物被鑒定為健康的綠色植物并移植到土壤上。非-轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镌诃傊囵B(yǎng)基上萌芽，生長7天然后移植到土壤上。將22個轉(zhuǎn)基因的幼苗和10個非轉(zhuǎn)基因的對照植物轉(zhuǎn)移到相同的32格平地的隨機位置。植物生長至成熟并自花授精并結(jié)子。從每一植物收獲種子，通過如下所述的方法由NearInfrared(NIR)波譜學(xué)評估種子的含油量。由NIR光譜學(xué)測定的從各植物收獲的種子中的油百分比顯示于表3中。通過用預(yù)測的油值除以對照種子(即沒有轉(zhuǎn)基因的植物的種子)中的平均油值確定相對的油值。已經(jīng)在2個實驗中檢驗了At1g73650的過表達(dá)對種子油的影響。在2個實驗中，過表達(dá)At1g73650的植物具有比生長在相同的平地的對照植物高的種子油含量。整個實驗中，過表達(dá)At1g73650的植物的平均種子油含量比未轉(zhuǎn)化的對照高4.5％。過表達(dá)At1g73650的植物的種子油含量顯著高于非-轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?雙向方差分析；P＝0.0160)。表2實施例4擬南芥HIO1002序列的分析用BLAST(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410)，PFAM(Bateman等，1999，NucleicAcidsRes27260-262)，PSORT(NakaiK，和HortonP，1999，TrendsBiochemSci2434-6)，和/或CLUSTAL(ThompsonJD等，1994，NucleicAcidsRes224673-4680)進(jìn)行序列分析。TBLASTN對比ESTs候選基因At1g73650得到全長cDNAsGI15809973和GI27363285的支持。有許多來自顯示與At1g73650具有相似性不同的植物品種的ESTs。盡可能制備各品種的ESTs重疊群。每一下列品種的最佳符合列于如下并且包括在以下的“直系同源物表2”中小麥(Triticumaestivum)，大豆(Glycinemax)，辣薄荷(Mentha×Piperita)，歐洲山楊(Populustremula)，水稻(Oryzasativa)，番茄(Lycopersiconesculentum)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)以及甜菜(Betavulgaris)1.具有下列GenBankIDS的甜菜ESTsgi|261216302.具有下列GenBankIDS的馬鈴薯ESTsgi|12588047gi|152593473.具有下列GenBankIDS的番茄ESTsgi|5896833gi|5896833gi|12628275gi|12628275gi|12628275gi|162425724.具有下列GenBankIDS的水稻ESTsgi|5456487gi|7001875.具有下列GenBankIDS的白楊ESTsgi|3857688gi|23959842gi|23960044gi|23963690gi|23997967gi|23998879gi|24062476gi|24065210gi|286092306.具有下列GenBankIDS的大豆ESTsgi|9205433gi|12488109gi|12773915gi|15286042gi|187315157.具有下列GenBankIDS的玉米ESTsgi|5739680gi|21208932gi|407242gi|4072438.具有下列GenBankIDS的棉花ESTsgi|33262509.具有下列GenBankIDS的小麥ESTsgi|9742370gi|20309688gi|25194283gi|25235692gi|25237006gi|25243036gi|25261519gi|25280706gi|25431065gi|25547029gi|25560875gi|32546080gi|32670437BLASTP比較氨基酸蛋白At1g73650與來自其他生物的蛋白具有同源性。At1g73650的最上面的7個BLAST結(jié)果列舉如下并且被包含在下表2的直系同源物中。1.來自甜菜(Betavulgaris)的一個EST重疊群ex|13978852|exs|139788512.來自Solanumtubersom的一個EST重疊群ex|11208765|exs|112087643.來自番茄(Lycopersiconesculentum)的一個EST重疊群ex|5891894|exs|58918934.來自水稻(Oryzasativa)的一個EST重疊群ex|7258057|exs|72580565.來自歐洲山楊(Populustremula)的一個EST重疊群ex|10187045|exs|101870446.來自大豆(Glycinemax)的一個EST重疊群ex|9156811|exs|91568107.來自玉米(Zeamays)的一個EST重疊群ex|7766057|exs|77660568.來自棉花(Gossypiumhirsutum)的一個EST重疊群ex|9283238|exs|92832379.來自小麥(Triticumaestivum)的一個EST重疊群ex|11024927|exs|11024926表3最接近的植物同系物At1g73650(NP_849882.1)的該NCBI入口是推定的跨膜蛋白。有6個推定的跨膜功能域(由TMHMM推定；氨基酸殘基931；64-86；99-118；138-155；185-204；209-231)。最初的跨膜功能域與信號錨序列重疊(由SignalP推定的；概率＝0.990；氨基酸殘基1-28)。Psort2預(yù)計At1g73650可能是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，原生質(zhì)膜或線粒體(Psort2預(yù)計32％內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，28％原生質(zhì)膜，24％線粒體，4％核，4％高爾基體，4％液泡，4％分泌系統(tǒng)的囊泡)。然而，基于TargetP預(yù)計At1g73650不可能靶向線粒體。Pfam分析預(yù)計At1g73650具有一個未知功能的功能域(PF06966，氨基酸殘基24-252)模型結(jié)構(gòu)域seq-f*seq-thmm-fhmm-t記分E-值-----------------------------------------------PF069661/124252..1266[]453.04.9e-133*Seq-f是指“序列-來自”，seq-t是指“序列-進(jìn)入?！眘eq-t數(shù)后的兩個階段顯示匹配區(qū)域在序列內(nèi)并且沒有延伸到每一末端。兩個括號顯示匹配跨越圖譜HMM的全長。hmm-f和hmm-t是指圖譜HMM的匹配部分的開始和末端坐標(biāo)。實施例5通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或微粒轟擊獲得油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，紅花，油椰，椰子，亞麻，蓖麻以及花生的轉(zhuǎn)化的外植體。由轉(zhuǎn)化的組織再生植物。然后分析溫室生長的植物目的基因的表達(dá)水平以及油的水平。實施例6本實施例提供了測定轉(zhuǎn)基因包谷植物的油以及蛋白含量，質(zhì)量差，氨基酸組成，游離氨基酸水平以及微量元素含量的分析方法。通過低分辯率1H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，711057-1062(1994))確定第一代單個玉米粒以及解剖的胚芽以及胚乳的油水平(基于質(zhì)量以及組織重量百分比)，由此測定單個粒樣品的NMR張弛時間，并基于利用從根據(jù)加速溶劑萃取之后重量分析測定的具有改變的油水平的玉米粒分析產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析計算油水平。進(jìn)行單向方差分析以及Student’st-檢驗(JMP，版本4.04，SASInstituteInc.，Cary，NC，USA)來通過轉(zhuǎn)基因-特異性PCR鑒定轉(zhuǎn)基因以及非-轉(zhuǎn)基因粒之間的顯著差別。通過NIT光譜學(xué)確定第二代種子中油水平以及蛋白水平，由此測定由單株植物收獲的接種樣本品集的NIT譜，并基于利用由玉米粒分析產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析計算油以及蛋白水平，所述玉米粒具有分別由加速溶劑萃取或元素(％N)分析之后重量分析測定的改變的油或蛋白水平。進(jìn)行單向方差分析以及Student’st-檢驗來鑒定陽性標(biāo)記以及陰性標(biāo)記植物的種子之間油(％粒重)以及蛋白(％粒重)的顯著差異。利用下列方法分析來自每一轉(zhuǎn)基因事件的游離氨基酸的水平。將每一轉(zhuǎn)基因植物的種子逐一粉碎成細(xì)小的粉末并將約50mg所產(chǎn)生的粉末轉(zhuǎn)入預(yù)稱重的離心管。記錄精確的樣品重量并將1.0ml的5％三氯乙酸添加到各樣品管中。在室溫下通過渦旋混合樣品然后在Eppendorf微量離心機(Model5415C，BrinkmannInstrument，Westbury，NY)上在14,000rpm離心15分鐘。取出等分樣品的上清液并通過利用AgilentTechnicalPublication“AminoAnalysisUsingtheZorbaxEclipse-AAAColumnsandAgilent1100HPLC，”2000年3月17，所述的方法通過HPLC(Agilent1100)進(jìn)行分析。通過下列方法對來自谷物的總氨基酸進(jìn)行定量測定。研磨谷粒并利用6NHCl在100℃回流條件下24小時酸水解約60mg的產(chǎn)生的粗粉。干燥樣品并在0.1NHCl中重構(gòu)繼之以用α-苯二醛(OPA)預(yù)柱衍生化作用用于HPLC分析。通過反相ZorbaxEclipseXDB-C18HPLC柱在Agilent1100HPLC(Agilent，PaloAlto，CA)上分離氨基酸。通過熒光檢測氨基酸。半胱氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺以及色氨酸并未包括在該氨基酸篩選中(Henderson等，″Rapid，Accurate，SensitiveandReproducibleHPLCAnalysisofAminoacids，AminoAcidAnalysisUsingZorbaxEclipse-AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC，″AgilentPublication(2000)；也參見″MeasurementofAcid-StableAminoAcids，″AACCMethod07-01(AmericanAssociationofCerealChemists，ApprovedMethods，9th版本(LCCC#_9575308))。利用(ApprovedMethodsofthe美國谷物化學(xué)家協(xié)會-10th版本，AACC編輯，(2000)07-20MeasurementofTryptophan-AlaklineHydrolysis)所述的堿解方法測定玉米粒中總的色氨酸。通過本領(lǐng)域已知的方法分析種子中生育酚以及生育三烯酚的水平。簡而言之，將10mg的種子組織添加到已經(jīng)添加了500μl1％連苯三酚(pyrogallol)(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)/乙醇的無菌微量離心管中的1g微株上(BiospecProductInc，Barlesville，OK。微Beadbeater(Biospec)中“快”速振蕩混合物3分鐘，然后過濾通過0.2μm濾膜進(jìn)入自動取樣器管。利用帶有熒光檢測以及帶通以及狹縫的Zorbax硅石HPLC柱(4.6mm×250mm)經(jīng)HPLC分析過濾的提取物，熒光檢測的激發(fā)波長290nm，發(fā)射波長336nm。溶劑成分以及工作條件如下所列，溶劑A為己烷，溶劑B為甲基-叔丁基醚。注射體積為20μl，流速為1.5ml/分鐘并且運行時間為40℃12分鐘。溶劑梯度為90％溶劑A，10％溶劑B10分鐘；25％溶劑A，75％溶劑B11分鐘；以及90％溶劑A，10％溶劑B12分鐘。在1％連苯三酚/乙醇中進(jìn)行生育酚標(biāo)準(zhǔn)的運行用于比較(α-生育酚，γ-生育酚，β-生育酚，δ-生育酚以及生育酚(母育酚))。利用Chemstation軟件(HewlettPackard)計算α，β，δ以及γ生育酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1％連苯三酚/乙醇中運行生育三烯酚標(biāo)準(zhǔn)用于比較(α-生育三烯酚，γ-生育三烯酚，β-生育三烯酚，δ-生育三烯酚。利用Chemstation軟件(HewlettPackard)計算α-，β，δ-以及γ-生育三烯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的方案(Craft，Meth.Enzymol.，213185-205(1992)確定轉(zhuǎn)基因玉米粒內(nèi)類胡蘿卜素的水平。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的方案(Threlfall等，MethodsinEnzymology，XVIII，C部分，369-396(1971)；以及Ramadan等，Eur.FoodRes.Technol.，214(6)521-527(2002))確定plastiquinol以及葉綠醌。參考文獻(xiàn)Altschul，S.F.etal.，J.Mol.Biol.215403-410，1990.Altschul，S.F.etal.，NucleicAcidsRes.253389-3402，1997.AusubelFMetal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.，1993.BaldwinDetal.，CurOpinPlantBiol.2(2)96-103，1999.Batemanetal.，1999，NucleicAcidsRes27260-262(websiteatpfam.wustl.edu).BaulcombeD，ArchVirolSuppl15189-201，1999.Cannonetal.，PlantMolec.Biol.(1990)1539-47.Ch′ngetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)8610006-10010ChristensenSetal.，9thInternationalConferenceonArabidopsisResearch.Univ.ofWisconsin-Madison，June24-28，1998.Abstract165.Christouetal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1989)867500-7504.DeBlocketal.，PlantPhysiol.(1989)91694-701.DieffenbachCandDvekslerG(Eds.)PCRPrimerALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY，1989.Everettetal.，Bio/Technology(1987)51201Feldmannetal.，Science2431351-1354，1989.FocksNandBenningC，PlantPhysiol11891-101，1998.FridborgIetal.，PlantCell111019-1032，1999.HarlowEandLaneD，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1988，NewYork.HarlowEandLaneD，UsingAntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999，NewYorkHayashiHeta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