專利名稱：作用于酪氨酸激酶以診斷和治療骨關(guān)節(jié)炎的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
OA主要為非炎性疾病，其特征在于關(guān)節(jié)軟骨的漸進損失引起的關(guān)節(jié)疼痛和強直。OA為最常見的年齡相關(guān)疾病之一，估計其影響全世界約5,600萬人或60歲以上人口的80％。雖然一般認為OA為退化病癥，但是此疾病與軟骨細胞的活化相關(guān)，其中所述的軟骨細胞為正常關(guān)節(jié)軟骨中存在的主要細胞類型。此細胞活化的標(biāo)志包括肥大、增殖、去分化、現(xiàn)存細胞外基質(zhì)的降解和最終的細胞凋亡。
OA的分子病因?qū)W仍然未知。因此當(dāng)前治療OA的療法針對于緩解癥狀(如減少關(guān)節(jié)疼痛和續(xù)發(fā)的炎性變化)，而不是針對于治療疾病的根本原因。目前還沒有阻止疾病進程的藥物介入。許多患者因此發(fā)展到必需進行全關(guān)節(jié)置換術(shù)的疾病晚期。綜述請見Pritzker，Brandt等編，《(Osteoarthritis》，Oxford University Press，50-61頁(1998)。也見Sandell &Aigner，Arthritis Res.，第3卷，No.2，107-113頁(2001)。
大規(guī)模的OA cDNA文庫測序鑒定出多種推定的病態(tài)軟骨細胞表達的基因產(chǎn)物或“標(biāo)記基因”。見Stokes等，Arthritis Rheum.，第46卷，No.2，404-419頁(2002)；Hu等，J.Biol.Chem.，第273卷，No.51，34406-34412頁(1998)，Aigner等，Arthritis Rheum.，第44卷，No.12，pp.2777-2789(2001)；以及Kumar等，Osteoarthritis Cartilage.，第9卷，No.7，641-653頁(2001)。然而尚未獲得這些基因產(chǎn)物的功能信息，它們即使與OA有關(guān)，其作用也仍然未知。因此，OA的分子基礎(chǔ)仍然未知，并且只知道極有限數(shù)量的潛在藥物靶。
因此仍然需要治療OA和相關(guān)疾病的治療化合物和方法。還需要可能有用的新基因和基因產(chǎn)物，例如此類OA療法的藥物靶。還需要新的方法，尤其需要新的鑒定此類藥物靶的新篩選測定法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療和診斷OA的方法和組合物。本發(fā)明具體提供了受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員和其配體(例如GAS6和PROS1)的新用途，該亞家族包括TYRO3、Axl和cMer。申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)TYRO3和其配體(特別是GAS6)在來自患有OA的個體的軟骨細胞和組織中表達水平有所提高。此外，軟骨細胞中TYRO3或Axl表達的提高和/或用TYRO3配體處理軟骨細胞引起OA相關(guān)的若干不同基因的表達，而TYRO3、Axl或cMer的抑制(例如通過RNA干擾)阻斷了IL-1或TNF介導(dǎo)的OA遺傳標(biāo)記的誘導(dǎo)表明受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族可能在體內(nèi)介導(dǎo)軟骨降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用并因此是發(fā)展治療、預(yù)防或減輕OA的新治療法的有用的藥物靶。
因此，本發(fā)明提供使用受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員(例如TYRO3、AXL和cMer)和/或其配體例如(GAS6或PROS1)的新篩選測定法來鑒定治療OA的化合物。一方面，這些方法包括使測試化合物與含有TYRO3亞家族成員多肽和其配體的反應(yīng)混合物接觸，尤其是在允許配體與多肽結(jié)合以形成結(jié)合復(fù)合體的條件下接觸。在優(yōu)選的方面，TYRO3亞家族成員多肽為TYRO3，并且配體為TYRO3配體。然后可在存在測試化合物的反應(yīng)混合物中檢測結(jié)合復(fù)合體的形成水平，將這些水平與在不含測試化合物的條件下形成的結(jié)合復(fù)合體水平相比較。在這樣的方法中，存在測試化合物條件下形成的結(jié)合復(fù)合體水平的下降表明測試化合物可用于治療OA。
在這些方法的優(yōu)選實施方案中，TYRO3多肽為包含SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的多肽。在其他優(yōu)選的實施方案中，TYRO3配體為GAS6多肽，優(yōu)選為包含SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的多肽。
其他方面，本發(fā)明還提供確診患有OA的個體的診斷方法。在一個實施方案中，這些方法包括檢測來源于個體(例如OA患者或懷疑患有OA的其它個體的)生物試樣(例如軟骨細胞、軟骨組織和/或滑膜液或血清)中編碼受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員的核酸，優(yōu)選TYRO3核酸，并比較所述生物試樣中該核酸的水平與未患有OA的個體的核酸水平。在這樣的實施方案中，所述生物試樣中該核酸提高的水平表明該個體確實患有OA或個體要么具有增加的出現(xiàn)OA的危險。
在其他的實施方案中，本發(fā)明的診斷方面包括檢測檢測來源于個體(例如OA患者或懷疑患有OA的其它個體)的生物試樣(例如軟骨細胞、軟骨組織和/或滑膜液或血清)中屬于受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族的多肽的水平，優(yōu)選檢測TYRO3多肽的水平，并比較所述生物試樣中該多肽的水平與未患有OA個體中該多肽的水平。在這樣的實施方案中，個體生物試樣中該多肽提高的水平表明個體確實患有OA或個體要么具有增加的出現(xiàn)OA的危險。
這些診斷方法特別優(yōu)選的實施方案中，TYRO3多肽可為具有SEQ IDNO2中所列氨基酸序列的多肽，TYRO3核酸可為編碼具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列多肽的核酸。
另外，本發(fā)明還提供了使用受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員的配體，優(yōu)選使用TYRO3配體(如GAS6或PROS1)鑒定患有OA的個體的診斷方法。例如，在一個實施方案中，此類方法包括檢測來源于個體(例如OA患者或懷疑患有OA的其它個體)的生物試樣(例如軟骨細胞、軟骨組織和/或滑膜液或血清)中編碼TYRO3亞家族成員配體的核酸，并比較所述生物試樣中核酸水平與未患有OA的個體的核酸水平。在這樣的實施方案中，編碼該配體核酸的提高的水平表明個體確實患有OA或個體要么具有增加的出現(xiàn)OA的危險。
在其他的實施方案中，本發(fā)明的診斷方面包括檢測來源于個體(例如OA患者或懷疑患有OA的其它個體的生物試樣(例如軟骨細胞、軟骨組織和/或滑膜液或血清)中TYRO3亞家族成員配體多肽，優(yōu)選檢測TYRO3配體多肽并比較所述生物試樣中該配體多肽的水平與未患有OA的個體中配體多肽的水平。在這樣的實施方案中，所述個體生物試樣中該配體多肽提高的水平表明個體確實患有OA或個體要么具有增加的出現(xiàn)OA的危險。
在這些診斷方法特別優(yōu)選的實施方案中，TYRO3配體優(yōu)選為GAS6多肽，如包含SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的多肽。同樣，編碼TYRO3配體的核酸優(yōu)選為編碼GAS6的核酸，如編碼SEQ ID NO3中所列氨基酸序列的核酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，編碼TYRO3配體的核酸包含SEQID NO4中所列的核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療、預(yù)防或減輕OA的方法，其包括給需要的受試者施用包含有效劑量的TYRO3亞家族成員和/或其配體調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。在多種優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物包含一種或多種TYRO3、Axl、cMer和/或其配體的調(diào)節(jié)劑。
另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含能在需要的受試者中治療、預(yù)防或減輕OA的有效劑量劑量的TYRO3亞家族成員和/或其配體的調(diào)節(jié)劑，其中所述調(diào)節(jié)劑例如可抑制或與任何一個或多個此亞家族成員(例如TYRO3、Axl和cMer)結(jié)合的配體的活性、表達。在一個實施方案中，該藥物組合物包含任何一種或多種選自針對TYRO3亞家族成員或其配體核酸序列的反義寡核苷酸、三螺旋DNA、siRNA、核酶、RNA適體或雙鏈或單鏈RNA的物質(zhì)，其中設(shè)計所述的物質(zhì)用以抑制該家族成員或配體的表達。在另一個實施方案中，該藥物組合物包含TYRO3亞家族成員或其配體的抗體，其中該抗體可例如抑制該成員和/或配體的活性。
還在本發(fā)明的另一方面，提供了包含檢測來源于患者的生物試樣中編碼TYRO3亞家族成員或其配體的多核苷酸表達水平或檢測該成員或其配體或其片段多肽水平的必需組分的測定法和試劑盒，此類試劑盒包含，例如與該多肽或其片段結(jié)合的抗體或與該多核苷酸雜交的寡核苷酸探針。在優(yōu)選的實施方案中，此類試劑盒也包含詳述操作的說明書，通過它使用試劑盒組分。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在此稱為受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族的受體酪氨酸激酶亞家族，其包含同源蛋白質(zhì)TYRO3、Axl和cMer。在此公開的數(shù)據(jù)表明這些多肽參與OA的發(fā)病機理并因此設(shè)想這些多肽和其配體為發(fā)展治療、預(yù)防或減輕OA及相關(guān)病癥的療法的適當(dāng)藥物靶。
TYRO3多肽已在例如Polvi等，Gene，第134卷，No.2，289-293頁(1993)；Schultz等，Mol.Brain Res.，第28卷，273-280頁(1995)中有所描述。TYRO3也稱為SKY、TIF、RSE、DTK和BRT。見Ohashi等，Oncogene，第9卷，699-705頁(1994)；Dai等，Oncogene，第9卷，975-979頁(1994)；Mark等；J.Biol.Chem.；第269卷；10720-10728頁(1994)；Fujimoto等，Oncogene，第9卷，693-698頁(1994)。優(yōu)選的TYRO3氨基酸序列可從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得并且登錄號為NP_006284(SEQ IDNO2)。優(yōu)選的編碼此TYRO3多肽的cDNA序列也可從GenBank獲得并具有登錄號NM_006293(SEQ ID NO1)。cDNA序列的225-2897核苷酸與編碼SEQ ID NO2氨基酸序列的開放閱讀框(ORF)或“編碼序列”(CDS)相對應(yīng)。
TYRO3受體與也稱為UFO或ARK的受體酪氨酸激酶Axl(描述見O’Bryan等，Mol.Cell Biol.，第11卷，5016-5013頁(1991)；Janssen等，Oncogene，第6卷，2113-2120頁(1991)；Rescigno等；Oncogene；第6卷；1909-1913頁(1991)；Axl剪接變體Axlv1和Axlv2的GenBank登錄號分別為NM_021913，SEQ ID NO32和NM_001699，SEQ ID NO30)和也稱為EYK的受體酪氨酸激酶cMer(見Graham等，Cell Growth Differ.，第5卷，647-657頁(1994)；Jia等，J.Biol.Chem.，第269卷，1839-1844頁(1994)；GenBank登錄號NM_006343和NP_006334；SEQ ID NO34和SEQ ID NO35)具有結(jié)構(gòu)和序列同源性。總之，這三個多肽限定了這樣一個酪氨酸激酶受體亞家族，它們各具有相似的胞外域，共有約35％的氨基酸序列同一性并包含兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和兩個纖連蛋白III型重復(fù)。見Schulz等，Mol.Brain Res.，第28卷，273-280頁(1995)。
已經(jīng)描述了至少一個特異結(jié)合并活化TYRO3的配體。見例如Varnum等，Nature，第373卷，623-626頁(1995)；Stitt等，Cell，第80卷，No.4，661-670頁(1995)；Manfioletti等，Mol.Cell Biol.，第13卷，4976-4985頁(1993)。此配體的代表性氨基酸序列也稱為“生長抑制特異蛋白質(zhì) 6”或“GAS6”，其可以從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得并且登錄號為NP_000811(SEQID NO3)。優(yōu)選的編碼GAS6多肽的核苷酸序列可從GenBank登錄號NM_000820(SEQ ID NO4)獲得。此cDNA序列尤其含有包含SEQ IDNO4135-2171核苷酸殘基的開放閱讀框。GAS6也表現(xiàn)為其他TYRO3亞家族成員、Axl和cMer的配體。見例如Nagata等，J.Biol.Chem.，第271卷，30022-30027頁(1996)。
另一個特異結(jié)合TYRO3的配體是稱為Protein S的蛋白質(zhì)。見Stitt等(1995)，前文；Wimmel等，Cancer，第86卷，No.1，43-49頁(1999)。優(yōu)選的編碼Protein S多肽(PROS1)的核苷酸序列可從GenBank登錄號NM_000313獲得并且在此也以SEQ ID NO28提供。代表性的優(yōu)選PROS1氨基酸序列也可從GenBank登錄號NP_000304(SEQ ID NO29)獲得。
如下面實施例中公開的，申請人發(fā)現(xiàn)TYRO3、Axl、cMer和GAS6與OA的發(fā)病機理相關(guān)。例如數(shù)據(jù)表明軟骨細胞中TYRO3基因的表達誘導(dǎo)若干與OA相關(guān)的遺傳標(biāo)記，包括可聚蛋白聚糖-1、MMP-13、iNOS和COX-2-，而軟骨細胞中TYRO3的抑制降低了這些標(biāo)記基因的表達。申請人也發(fā)現(xiàn)與正常軟骨細胞中所見的TYRO3和GAS6基因的表達相比，它們在OA患者軟骨細胞中都以提高的水平表達。此外，用GAS6處理軟骨細胞也誘導(dǎo)OA標(biāo)記基因。另外，siRNA實驗也支持cMer和Axl剪接變體在OA發(fā)病機理中的作用。
這些令人吃驚的發(fā)現(xiàn)表明這些受體酪氨酸激酶其配體(例如GAS6和PROS1)可能在介導(dǎo)OA以及其他軟骨障礙中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)尤其表明這些受體酪氨酸激酶及其配體可用作例如發(fā)展治療、預(yù)防或減輕OA的療法(本文也簡稱為“治療”O(jiān)A)的藥物靶。
因此，本發(fā)明提供了可鑒定治療OA的藥物和其他治療化合物的篩選測定法。本發(fā)明的篩選測定法具體包括鑒定特異結(jié)合編碼TYRO3亞家族成員基因，優(yōu)選與TYRO3基因或基因產(chǎn)物結(jié)合并抑制其表達或活性的化合物的篩選測定法。作為備選，本發(fā)明也提供了鑒定結(jié)合TYRO3亞家族特異配體的基因或基因產(chǎn)物(例如GAS6的基因或基因產(chǎn)物)并抑制配體的表達或活性的化合物的篩選測定法。此外，本發(fā)明也提供了鑒定抑制或者調(diào)節(jié)TYRO3受體與TYRO3配體結(jié)合(例如與GAS6結(jié)合)的化合物的篩選測定法。此類鑒定法中鑒定的化合物和調(diào)節(jié)劑可自身用于例如治療OA的藥物組合物和/或治療方法中。因此下文提供了此類藥物組合物和治療方法，并為本發(fā)明的部分。
最后，申請人的發(fā)現(xiàn)也表明在此公開的TYRO3亞家族成員多肽和各自的配體可用于預(yù)后和診斷方法中以鑒定骨關(guān)節(jié)炎細胞和/或鑒定個體，例如患有OA的患者。下面提供了此類診斷和預(yù)后方法并且也為本發(fā)明的部分。
本發(fā)明及其說明可使用多種分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)為本領(lǐng)域熟知并在文獻中詳細闡明。見例如Sambrook，F(xiàn)itsch & Maniatis，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，在此稱為“Sambrook等(1989)”；D.N.Glover等，《DNA CloningA Practical Approach》，卷I和II(1985)，Gait編，《Oligonucleotide Synthesis》(1984)；Hames & S.J.Higgins編，《Nucleic Acid Hybridization》(1984)；Freshney編，《Animal Cell Culture》(1986)；《Immobilized Cells andEnzymes》IRL Press(1986)；Perbal，《A Practical Guide to MolecularCloning》(1984)；Ausubel等編，《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，Inc。
TYRO3多肽本發(fā)明涉及包括TYRO3、Axl、cMer和其變體的酪氨酸激酶亞家族。更具體而言，本發(fā)明涉及例如Polvi等，Gene，第134卷，No.2289-293頁(1993)描述的TYRO3多肽。本發(fā)明具體提供了TYRO3、cMer和Axl在用于治療OA和其他軟骨障礙的藥劑和藥物組合物中的用途。因此，本發(fā)明提供使用TYRO3亞家族成員診斷和/或治療OA和其他軟骨障礙的方法和組合物。
在一個具體的實施方案中，TYRO3多肽來源于人類細胞和/或具有人類細胞TYRO3多肽的氨基酸序列。例如，特別優(yōu)選的TYRO3多肽可包含GenBank登錄號NP_006284(SEQ ID NO2)所列的氨基酸序列。然而，應(yīng)當(dāng)理解TYRO3多肽并不限于此特定序列，而是也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的同系物和變體。
因此，TYRO3多肽也包括含有一個或多個全長TYRO3多肽的表位或結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的多肽。多肽的表位代表了可產(chǎn)生針對它的抗體并且抗體所結(jié)合的多肽位點。所以包含TYRO3表位氨基酸序列的多肽可用于制作TYRO3多肽的抗體。表位優(yōu)選包含至少5個，更優(yōu)選至少10、15、20、25或50個氨基酸殘基的長度。因此，包含TYRO3表位的多肽優(yōu)選含有與全長TYRO3多肽序列的至少5個，至少10個，至少15個，至少20個，至少25個或至少50個氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列。
TYRO3多肽也包括SEQ ID NO2提供的代表性全長TYRO3多肽序列的類似物和衍生物。TYRO3多肽的類似物和衍生物具有與SEQ IDNO2中所列的代表性TYRO3多肽相同的或同源的特點。也可制備嵌合或融合多肽，其中融合多肽的TYRO3部分具有一個或多個TYRO3多肽的特征。因此此類融合多肽代表TYRO3多肽的實施方案。此類融合多肽也可包含標(biāo)記多肽的氨基酸序列，例如包含F(xiàn)LAG、組氨酸標(biāo)簽、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或IgG的Fc部分等。此外，融合多肽可包含增加多肽溶解性的氨基酸序列，如硫代還原酶氨基酸序列或一個或多個免疫球蛋白蛋白質(zhì)(例如IgG1或IgG2)的序列。
TYRO3亞家族成員多肽的類似物或變體也可通過改變編碼核酸分子(例如通過取代、添加或刪除)得到。優(yōu)選的TYRO3多肽類似物或變體具體包括SEQ ID NO2說明的特定TYRO3多肽序列的“功能保守變體”。多肽或多核苷酸的“功能保守變體”為已經(jīng)改變或變化多肽中特定氨基酸殘基或多核苷酸的密碼子編碼的氨基酸殘基、但不改變多肽的全部構(gòu)象和功能的變體。預(yù)計此類改變對的多肽的表觀分子量或等電點只有微小影響或無影響。因此，此類改變的核酸分子優(yōu)選編碼功能相似的分子，即執(zhí)行TYRO3多肽的一種或多種功能和/或具有一種或多種TYRO3多肽生物活性。
除了在此特別鑒定為保守的氨基酸殘基外，在蛋白質(zhì)或多肽的變體中氨基酸殘基可以不同。因此，任意兩個TYRO3亞家族的多肽成員變體或類似物之間的蛋白質(zhì)或氨基酸序列相似性百分比可以變化。一般地，根據(jù)如Cluster Method和/或MEGALIGN或GCG比對算法之類的比對方案測定的這些多肽的變體或類似物之間的蛋白質(zhì)或氨基酸序列之間的相似性百分比可為70-99％。優(yōu)選這些多肽變體和類似物具有如通過BLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等序列比較算法測定的至少約75％，更優(yōu)選至少約80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
如上面定義的功能保守變體不僅包括在此討論的全長TYRO3亞家族多肽的變體，還包括經(jīng)修飾(例如截短和刪除)的TYRO3亞家族多肽的功能保守變體；所述的全長TYRO3亞家族多肽的變體包括例如含有下文實施例中說明的特定TYRO3亞家族多肽序列的多肽變體，功能保守變體包括片段的功能保守變體，例如與全長TYRO3亞家族多肽的結(jié)構(gòu)域或表位相應(yīng)的片段。
還在其他的實施方案中，TYRO3多肽的類似物為SEQ ID NO2提供的TYRO3多肽序列的等位變體或突變體。術(shù)語等位變體和突變體，當(dāng)在此使用以描述多肽時指等位變體或突變體基因編碼的多肽。因此，等位變體和突變體TYRO3多肽為TYRO3核酸等位變體和突變體編碼的多肽。
還在其他的實施方案中，TYRO3亞家族成員多肽的類似物為相同物種的基本同源多肽，例如等位變體；或其他物種的基本同源多肽，例如直向同源多肽。術(shù)語“同源的”指擁有“共同進化起源”的兩個蛋白質(zhì)或核酸之間的關(guān)系，所述蛋白質(zhì)包括同一生物物種的超家族蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白超家族，以及不同生物物種的同源蛋白質(zhì)，例如肌球蛋白輕鏈多肽等。見Reeck等，Cell，第50卷，667頁(1987)。此類蛋白質(zhì)(及其編碼核酸)具有序列同源性，如通過其序列相似性以百分比同一性形式或存在特定殘基或基序和保守位點反映的序列同源性。本發(fā)明優(yōu)選的同源多肽具有上述為本發(fā)明其他TYRO3亞家族成員多肽變體和類似物指定的序列相似性或同源性水平。這些多肽的同系物或類似物也可從例如哺乳動物獲得，所述哺乳動物如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、狗、貓、綿羊、山羊、豬、馬和牛等。
在其他的實施方案中，包括類似物、同系物等的TYRO3多肽變體為與編碼一個或多個SEQ ID NO2中所列的具體TYRO3多肽序列的核酸分子的互補鏈雜交的核酸分子編碼的多肽。當(dāng)在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強度條件下單鏈形式的核酸分子可與其他核酸分子退火時，核酸分子與另一個核酸分子(例如cDNA、基因組DNA或RNA)“可雜交”。見于例如Sambrook等，前文。溫度和離子強度條件決定了雜交的“嚴謹性”。為初篩同源核酸，可使用相應(yīng)于解鏈溫度約55C的低嚴謹性雜交條件，例如5xSSC、0.1％SDS、0.25％乳液并且無甲酰胺；或者另選30％甲酰胺、5xSSC和0.5％SDS。中度嚴謹雜交條件相應(yīng)于更高的Tm，例如具有40％甲酰胺的5x或6xSSC。高度嚴謹性雜交條件相應(yīng)于最高的Tm，例如50％甲酰胺，5x或6xSSC。1xSSC溶液應(yīng)理解為含有0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉的溶液。
雜交需要兩個核酸含有互補序列，雖然依賴于雜交的嚴謹性，可能存在堿基間的錯配。雜交核酸的適當(dāng)嚴謹性依賴于核酸的長度和互補的程度，本領(lǐng)域熟知可發(fā)生改變。兩個核苷酸序列間相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸雜交的Tm值越高。
為長度大于100個核苷酸的雜交，推導(dǎo)了計算Tm的方程式。見Sambrook等，前文，9.50-9.51頁。
在具體的實施方案中，術(shù)語“標(biāo)準雜交條件”指Tm約55℃并使用前述條件。在優(yōu)選的實施方案中，Tm為60℃；在更優(yōu)選的實施方案中，Tm為65℃。在具體的實施方案中，術(shù)語“高嚴謹性”指68℃在0.2x SSC中，42C在50％甲酰胺、4xSSC中的雜交和/或洗滌條件，或者這樣的雜交條件，其提供的雜交水平與上述兩條件之一中觀察到相等。
還在其他的實施方案中，TYRO3亞家族成員多肽的變體(包括類似物、同系物和直向同源物)可通過分離TYRO3亞家族成員基因的變體鑒定，例如用基于亞家族多肽的氨基酸序列設(shè)計的簡并寡核苷酸引物使用PCR鑒定并如下所述。
TYRO3亞家族多肽的衍生物還包括磷酸化多肽、十四烷基化多肽、甲基化多肽和其他化學(xué)修飾的多肽。TYRO3亞家族多肽還包括標(biāo)記的變體，例如用碘或磷放射標(biāo)記(見例如EP 372707B)，或其他可探測分子標(biāo)記，所述分子如(但決不限于)生物素、熒光染料(例如Cy5或Cy3)、絡(luò)合金屬離子的螯合基團、生色團或熒光團、膠體金、粒子(如橡膠球)，或者與水溶性高分子連接，如與聚乙二醇(PEG)連接。TYRO3亞家族多肽的化學(xué)修飾可提供特定情況下的其他優(yōu)勢。見例如U.S.專利No.4,179,337。綜述也見于Abuchowski等，《Enzymes as Drugs》，Holcerberg & Roberts編，367-383頁(1981)。描述蛋白質(zhì)修飾和融合蛋白的綜述論文也可在Fracis，《Focus on Growth Factors》，第3卷4-10頁，MediscriptMountviewCourt，F(xiàn)riern Barnet Lane，London N20，OLD，UK(1992)中找到。
TYRO3亞家族成員核酸通常，編碼酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員的核酸包含編碼TYRO3亞家族成員多肽和其片段的核酸序列互補鏈的核酸序列。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，TYRO3核酸分子包含編碼SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的核苷酸序列。在此實施方案特別優(yōu)選的方面，TYRO3核酸分子具有包含編碼部分的核苷酸序列，編碼部分即GenBank登錄號NM_006293中所列并在此于SEQ ID NO1中提供的核苷酸序列的ORF。特別優(yōu)選的核酸分子包含SEQ ID NO1中所列核苷酸序列的225-2897核苷酸序列。類似地，Axl激酶多肽變體AXLv1和AXLv2分別具有本文SEQID NO.30和32中提供的核苷酸序列和SEQ ID NO.34中提供的cMer。
還在其他的實施方案中，TYRO3亞家族核酸分子包含編碼一個和多個TYRO3亞家族成員多肽關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，所述結(jié)構(gòu)域如受體結(jié)合位點、激酶結(jié)構(gòu)域、胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。
TYRO3亞家族核酸分子也包括含有編碼一個和多個TYRO3亞家族多肽序列片段的核酸。
TYRO3亞家族核酸分子也包括含有經(jīng)修飾的多肽、變體編碼序列的核酸分子，其中所述經(jīng)修飾的多肽例如具有氨基酸取代、刪除或截短，所述變體包括多肽的來自同一物種或不同物種的等位變體、類似物和同系物。在優(yōu)選的實施方案中，此類核酸分子與TYRO3亞家族多肽編碼序列，例如與SEQ ID NO1、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34中所列的編碼序列具有至少50％，優(yōu)選至少75％和更優(yōu)選至少90％的序列同一性。
此外，編碼TYRO3亞家族成員多肽的核酸分子包括與另一個核酸分子雜交的核酸分子，例如確定條件下的DNA印跡鑒定法中與另一個核酸分子雜交的核酸分子。例如，在特定的實施方案中TYRO3核酸分子包含與特定核酸序列(如SEQ ID NO1中所列的TYRO3編碼序列)雜交的核苷酸序列。另外，核酸分子可在相同的確定的雜交條件下與編碼全長TYRO3多肽的核苷酸序列的片段互補鏈雜交。優(yōu)選雜交的實例包括上述所列的。
在其他的實施方案中，核酸分子包含全長TYRO3亞家族成員核酸序列的片段。此類核酸片段包含與編碼全長TYRO3亞家族成員多肽的核苷酸序列的至少10個核苷酸，優(yōu)選至少15個核苷酸和更優(yōu)選至少20個核苷酸的序列對應(yīng)的核苷酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，核酸片段包含至少10個，優(yōu)選至少15個和更優(yōu)選至少20個與全長TYRO3亞家族成員核酸序列或其片段互補和/或雜交的核苷酸的序列。為與更短核酸(即寡核苷酸)雜交，錯配的位置更加重要，并且寡核苷酸的長度決定其特異性。見Sambrook等，前文，11.7-11.8頁?？呻s交核酸的最小長度優(yōu)選為至少約10個核苷酸，更優(yōu)選至少約15個核苷酸，還更優(yōu)選至少約20個核苷酸。
包含此類片段核酸分子可用作寡核苷酸探針和引物，例如作為檢測和擴增其他編碼TYRO3亞家族成員多肽的核酸分子(包括編碼變體多肽的基因)的PCR引物。寡核苷酸片段也可用作例如反義核酸來調(diào)節(jié)細胞中TYRO3亞家族成員基因的表達或轉(zhuǎn)錄水平。
核酸分子也包括“嵌合”核酸分子。此類嵌合核酸分子為這樣的多核苷酸，其包含至少一個TYRO3亞家族成員核酸序列，例如可為任一上述全長或部分TYRO3、AXL或cMer核酸序列，還包含至少一個非TYRO3亞家族成員核酸序列，即一般與天然存在的亞家族成員基因無關(guān)的核酸序列。例如，非亞家族成員核酸序列可為來源于另一基因并一般與天然存在的亞家族成員基因無關(guān)的異源調(diào)節(jié)序列，例如啟動子序列。非亞家族成員核酸序列也可為另一多肽的編碼序列，所述多肽如FLAG、組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、血凝素、β-半乳糖苷酶、硫代還原酶或免疫球蛋白的一個或多個結(jié)構(gòu)域，例如Fc區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，嵌合體核酸分子編碼本發(fā)明的融合多肽。
可從任何來源分離核酸分子，不管是DNA、cDNA還是其他核酸分子，其包括例如來源于具有所需TYRO3亞家族成員基因的生物的細胞或細胞系的cDNA或基因組文庫。就cDNA文庫而言，優(yōu)選來源于表達特定TYRO3亞家族成員基因的細胞或細胞系。獲得基因的方法為本領(lǐng)域所熟知。見于例如Sambrook等(1989)，前文。
DNA可通過已知的標(biāo)準方法從克隆DNA中獲得，例如從DNA“文庫”中獲得，并優(yōu)選從該蛋白質(zhì)高水平表達組織制備的cDNA文庫獲得。在一個優(yōu)選的實施方案中，DNA從“扣除”文庫獲得，以富集特定細胞類型或在特定條件下特定表達的基因的cDNA文庫。使用此種扣除文庫可增加分離特殊基因cDNA的機率。還在其他的實施方案中，文庫可通過化學(xué)合成、cDNA克隆或從所需細胞純化的基因組DNA或其片段的克隆制備。見例如Sambrook等(1989)，前文；Glover編，《DNA CloningA PracticalApproach》MRL Press，Ltd.Oxford，U.K.，卷I和II(1985)。
在一個實施方案中，可通過鑒定編碼與TYRO3亞家族成員多肽(例如SEQ ID NO2中所列的TYRO3多肽)同源或基本相似的多肽的cDNA插入物從cDNA文庫篩選所需TYRO3亞家族成員核酸。類似地，可通過鑒定具有與TYRO3亞家族成員核苷酸序列同源或基本相似的核酸序列的cDNA插入物從cDNA文庫篩選所需TYRO3亞家族成員核酸。
來源于基因組DNA的克隆除了編碼區(qū)域外可含有調(diào)節(jié)和內(nèi)含子DNA區(qū)域。來源于cDNA的克隆通常不含有內(nèi)含子序列。無論什么來源，基因優(yōu)選分子克隆到增殖該基因的適當(dāng)載體中?？梢栽S多方法鑒定含有所需TYRO3亞家族成員基因的特定DNA片段。例如，可純化并標(biāo)記TYRO3亞家族成員基因的部分，以制備標(biāo)記探針。見Benton & Davis，Science，第196卷，180頁(1977)；Grunstein & Hogness；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；第72卷；3961頁(1975)。與探針基本同源的DNA片段(如來自另一個體的等位變體)將發(fā)生雜交。在特定的實施方案中，最高嚴謹性雜交條件用于鑒定同源TYRO3亞家族成員基因。
編碼目的TYRO3亞家族成員基因衍生物和類似物的基因可通過多種本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。引起其產(chǎn)生的操作可在基因或蛋白質(zhì)水平上進行。例如，克隆序列可通過大量本領(lǐng)域已知策略中的任一種修飾。見Sambrook等(1989)，前文。序列可在適當(dāng)位點用限制性內(nèi)切酶切割，然后在體外進行其他酶促修飾(必要的話)、分離和連接。在產(chǎn)生編碼目的基因衍生物或類似物的基因的過程中，應(yīng)注意確保經(jīng)修飾的基因保留在與其來源基因相同的翻譯閱讀框中，在編碼所需活性的基因區(qū)域中未受翻譯終止信號中斷。
此外，編碼TYRO3亞家族成員的核酸序列可在體外或體內(nèi)突變以建立和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區(qū)造成變化和/或形成新的限制酶位點或破壞已存在的位點，以便于進一步的體外修飾。也可進行修飾以引入限制性酶切位點并便于將基因克隆到表達載體中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，這包括(但不限于)體外定向誘變(見Hutchinson等，J.Biol.Chem.，第253卷，6551頁(1978)；Zoller和Smith，DNA，第3卷，479-488頁(1984)；Oliphant等，Gene，第44卷，177頁(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第83卷，710頁(1986))；使用TAB接頭。見Pharmacia Corp.，Peapack，NJ等。PCR技術(shù)優(yōu)選用于定向誘變。見Higuchi，《PCR TechnologyPrinciples and Applications forDNA Amplification》，Erlich編，Stockton Press，第6章，61-70頁(1989)。
然后經(jīng)鑒定和分離的基因可插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體中?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的大量載體-宿主系統(tǒng)?？赡艿妮d體包括(但不限于)質(zhì)粒或經(jīng)修飾的病毒，但是載體系統(tǒng)必需與所用宿主細胞相容。載體的實例包括(但不限于)大腸桿菌、噬菌體(如λ衍生物)或者質(zhì)粒(如pBR322衍生物或pUC質(zhì)粒衍生物)，例如pGEX載體、pmal-c、pFLAG、pKK質(zhì)粒(Clonetech，Palo Alto，CA)、pET質(zhì)粒(Novagen，Inc.，Madison，WI)、pRSET或pREP質(zhì)粒、pcDNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)或pMAL質(zhì)粒(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)等等。可通過例如將DNA片段連入具有互補粘性末端的克隆載體中完成插入克隆載體。然而，如果克隆載體中不存在用于片段化DNA的互補限制性酶切位點，DNA分子的末端可進行酶促修飾。備選地，可通過將核苷酸序列(接頭)連接到DNA末端產(chǎn)生任何所需位點。這些連接的接頭可包含編碼限制酶識別序列的特定化學(xué)合成寡核苷酸。
重組分子可經(jīng)由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等引入宿主細胞以產(chǎn)生基因序列的多個拷貝。優(yōu)選克隆基因包含在穿梭載體質(zhì)粒上，其提供在克隆細胞(如大腸桿菌)中擴增，并使為隨后插入適當(dāng)表達細胞系的純化更容易(如果需要這樣的話)。例如，可通過連接大腸桿菌質(zhì)粒的序列與酵母2m質(zhì)粒的序列制備可在多于一種類型生物中復(fù)制的穿梭載體，以在大腸桿菌和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中都能復(fù)制。
應(yīng)當(dāng)理解，在此公開的編碼TYRO3亞家族成員的核酸可為DNA或RNA并可為單鏈、雙鏈或甚至三鏈，例如TYRO3單鏈TYRO3核酸和/或其互補鏈的三螺旋。TYRO3亞家族成員核酸包括基因組DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA等；以及合成的或遺傳操作的多核苷酸和有義和反義多核苷酸。此類合成的多核苷酸包括例如核苷堿基與氨基酸主鏈綴合形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PNA)。其他代表性的合成核酸包括含有經(jīng)修飾堿基(如硫尿嘧啶、硫鳥嘌呤和氟尿嘧啶)的核酸。為方便起見，在本說明書中提供的代表性核苷酸序列以DNA序列提供。然而，應(yīng)理解，其他類型核酸的相同序列(如RNA)也可使用并且是等價的。因此，例如在本說明書中當(dāng)特定的核苷酸序列指特定位點的胸腺嘧啶時，應(yīng)理解尿嘧啶(U)可在那一位點取代并為功能等價的。其他等價取代對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言也是顯而易見的并且因此包括在本文公開的TYRO3亞家族成員核酸中。
多核苷酸可與天然調(diào)節(jié)序列相鄰，或者其可與異源序列聯(lián)系，這些序列如啟動子、增強子、反應(yīng)元件、信號序列、多腺苷酸化序列、內(nèi)含子、5’和3’非編碼區(qū)等。術(shù)語“異源的”在本文中指元件(如非天然存在序列)的組合。因此，TYRO3亞家族成員核酸可具有如啟動子等一般不與TYRO3亞家族成員基因聯(lián)系的序列。
核酸也可通過本領(lǐng)域公知的任何方法修飾。此類修飾的非限制性實例包括甲基化、“加帽”、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，如不帶電連接(uncharged linkage)的修飾，例如甲基磷酸鹽、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等修飾；帶電連接(charged linkage)的修飾，例如，磷酸酰、二硫代磷酸酯等修飾。核酸可含有一個或多個其他共價連接的部分，如蛋白質(zhì)，例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚-L-賴氨酸等；嵌入劑，如吖啶、補骨脂素等；螯合劑，例如金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等螯合劑；和烷化劑(alkylator)等。多核苷酸可通過形成甲基或乙基磷酸三酯或者烷基亞磷酰胺鍵而衍生。此外，本文的多核苷酸也可用能直接或間接提供可檢測信號的標(biāo)記修飾。代表性的標(biāo)記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。
TYRO3配體多肽和核酸本發(fā)明還涉及屬于在此公開的受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族的多肽的配體。因此，也提供了該配體多肽和核酸并認為是本發(fā)明有用的方面。
“配體”廣義地說為任何與另一個分子結(jié)合的分子。在優(yōu)選的實施方案中，配體為兩個結(jié)合分子中可溶的或更小的分子，或者兩者兼是。另一個分子稱為“受體”。在優(yōu)選的實施方案中，配體和其受體均為細胞產(chǎn)生的分子(優(yōu)選為多肽)。優(yōu)選地，配體為可溶性分子，受體為膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，即在細胞表面呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選配體“特異結(jié)合”其受體和/或反之亦然。術(shù)語“特異結(jié)合”指配體區(qū)分其受體和其他物質(zhì)(例如生理條件下的分子)的能力。優(yōu)選配體以某種親和力與其受體結(jié)合并且反之亦然。配體與其受體的親合力一般由解離常數(shù)Kd定義。解離常數(shù)Kd優(yōu)選具有低于約10μM的值，更優(yōu)選低于約1μM，還更優(yōu)選低于約100nM。在特別優(yōu)選的實施方案中，解離常數(shù)Kd具有低于約10nM的值。
配體與其受體的結(jié)合常常為細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。配體-受體相互作用的非限制性實例包括(但不限于)激素與激素受體的結(jié)合，例如雌激素與雌激素受體的結(jié)合，以及神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)元表面受體的結(jié)合。在這種情況下，TYRO3配體一旦與TYRO3受體結(jié)合就刺激酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶活性的測定法為本領(lǐng)域所熟知并可用于鑒定配體。
特別優(yōu)選的特異結(jié)合并活化TYRO3的配體在例如Varnum等(1995)，前文，中有所描述；也見于Stitt等(1995)，前文；Manfioletti等(1993)，前文。通常稱為“生長抑制特異蛋白6”或“GAS6的此配體的代表性氨基酸序列以登錄號NP_000811陳列于GenBank并在本文SEQ ID NO3中提供。此氨基酸序列由包含以登錄號NM_000820陳列于GenBank的全長cDNA序列135-2171殘基的開放閱讀框編碼并在本文以SEQ ID NO4提供。
因此，優(yōu)選的TYRO3亞家族配體多肽包括GAS6多肽，如SEQ IDNO3氨基酸序列中所列的GAS6多肽。本發(fā)明提供了下文描述的測定法，通過該測定法本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可鑒定其他TYRO3配體多肽和編碼此類TYRO3配體多肽的核酸。TYRO3亞家族配體多肽也包括變體TYRO3亞家族配體多肽，包括變體GAS6多肽。這些包括變體，如TYRO3亞家族配體多肽的同系物、直向同源物、衍生物、突變體、嵌合體、融合物、片段、截短形式等。此類TYRO3亞家族配體變體按前文對TYRO3亞家族受體多肽的定義來限定。
類似地，本發(fā)明也提供了作為本文公開的OA的適當(dāng)藥物靶的TYRO3亞家族配體核酸，其包括編碼SEQ ID NO3GAS6多肽的核酸，例如包含SEQ ID NO4中核苷酸135-2171序列的核酸。使用下文描述的篩選測定法還可鑒定其他TYRO3亞家族配體核酸，并且此類TYRO3亞家族配體核酸可根據(jù)本發(fā)明的方法使用。TYRO3亞家族配體核酸也包括變體TYRO3亞家族配體核酸，包括變體GAS6核酸。這些包括變體，如TYRO3亞家族配體核酸的同系物、直向同源物、衍生物、突變體、嵌合體、融合物、片段、截短形式等。此類變體TYRO3亞家族配體核酸按前文對TYRO3亞家族受體核酸的定義來限定。
TYRO3亞家族成員和其配體的表達可將編碼酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員或其配體的核苷酸序列(包括嵌合蛋白質(zhì)、抗原片段、其衍生物或類似物)的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體，即含有轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的蛋白質(zhì)編碼序列必需元件的載體。因此，例如編碼TYRO3亞家族受體或配體的核酸可與表達載體中的啟動子有效連接。cDNA和基因組序列都可在此類調(diào)節(jié)序列的控制下克隆和表達。此類載體可用于表達功能性或功能失活的TYRO3亞家族受體或其配體。
必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可提供于重組表達載體。
可能的宿主-載體系統(tǒng)包括(但不限于)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒(例如痘苗病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒等)感染的哺乳動物和其他脊椎動物細胞、病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系、微生物(如含有酵母載體的酵母)，或者噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細菌。載體表達元件的長度和專一性有所不同。依賴于所使用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用大量適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一個。
TYRO3亞家族成員多肽或其配體的表達可由本領(lǐng)域已知的任何啟動子/增強子元件控制，但是這些調(diào)節(jié)元件必需在用于表達的所選宿主中具有功能?？捎糜诳刂苹虮磉_的啟動子包括(但不限于)巨細胞病毒(CMV)啟動子(U.S.專利No.5,385,839和5,168,062)、SV40早期啟動子區(qū)域(見Benoist和Chambon，Nature，第290卷，304-310頁(1981))、勞斯肉瘤病毒3’長末端重復(fù)中含有的啟動子(見Yamamoto等，Cell，第22卷，787-797頁(1980))、皰疹胸腺嘧啶激酶啟動子(見Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第78卷，1441-1445頁(1981))、金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(見Brinster等，Nature，第296卷，39-42頁(1982)；原核表達載體，如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(見Villa-Komaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第75卷，3727-373l頁(1978))或tac啟動子。見DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，21-25頁(1983)和“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”，Sci.Am.，第242卷，74-94頁。其他可使用的有用啟動子元件包括來自酵母和其他真菌的啟動子元件，如Gal 4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子，以及表現(xiàn)造血組織特異性的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，具體為骨髓細胞中有活性的β-珠蛋白基因控制區(qū)域(見Mogram等，Nature，第315卷，338-340頁(1985)；Kollias等，Cell，第46頁，89-94頁(1986))、造血干細胞分化因子啟動子、促紅細胞生成素受體啟動子(見Maouche等，Blood，第15頁，2557頁(1991))等。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過使用非內(nèi)源啟動子控制細胞中編碼TYRO3亞家族成員多肽和配體的內(nèi)源基因的表達來表達該多肽和配體的方法。細胞中的內(nèi)源基因為通常(即天然)發(fā)現(xiàn)于在該細胞基因組中的基因。然而非內(nèi)源啟動子為可用于控制基因表達但通?；蛱烊坏嘏c內(nèi)源基因無關(guān)的啟動子或其他核苷酸序列。作為實例，可使用同源重組方法(優(yōu)選使用本發(fā)明的非蛋白質(zhì)編碼核酸序列)以在內(nèi)源基因附近插入可擴增基因或其他調(diào)節(jié)序列。然后插入序列可用于例如提供比細胞中天然存在的更高的基因表達水平，或者克服內(nèi)源基因調(diào)節(jié)序列中的一個或多個妨礙正常的基因表達水平的突變。此類同源重組方法為本領(lǐng)域熟知。見例如由Skoultchi于1991年5月16日公布的國際專利申請WO 91/06666、由Chappel于1991年7月11日公布的國際專利申請WO 91/099555、由Kucherlapati和Campbell于1990年11月29日公布的國際專利申請WO90/14092。
蛋白質(zhì)的可溶形式可通過收集培養(yǎng)液獲得，或通過溶解包涵體獲得，如用去污劑處理和如前述必要的話用超聲或其他機械方法處理。溶解的或可溶蛋白質(zhì)可使用多種技術(shù)分離，如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、等電聚焦、雙向凝膠電泳、層析法(例如離子交換、親和、免疫親和和大小柱層析)、離心、溶解度差異、免疫沉淀作用，或者任何其他純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準技術(shù)。
優(yōu)選的載體為病毒載體，如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、桿狀病毒和其他具有目的細胞趨性的重組病毒。因此，可使用病毒載體或通過直接引入DNA在體內(nèi)、離體或體外引入編碼功能的或突變體TYRO3亞家族成員多肽或配體或編碼其結(jié)構(gòu)域或片段的基因。可通過如用病毒載體或受體配體或通過使用組織特異性啟動子或兩者均使用，將轉(zhuǎn)基因載體靶向特定細胞，從而實現(xiàn)在靶組織中的表達。
TYRO3亞家族成員多肽和其配體的抗體如下文所述，TYRO3亞家族成員多肽和/或配體的抗體尤其可用于診斷和治療方法。根據(jù)本發(fā)明，TYRO3亞家族成員多肽或配體(例如重組或通過化學(xué)合成產(chǎn)生的)，及其片段或其他衍生物或類似物(包括融合蛋白)可用作免疫原，以產(chǎn)生識別這些多肽或配體的抗體。此類抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫。此種抗體優(yōu)選對特定TYRO3亞家族成員多肽或配體特異，即特異結(jié)合例如分別具有SEQ ID NO2和3所列氨基酸序列的TYRO3受體或配體。然而，作為備選，抗體可對其他種生物的直向同源物特異，優(yōu)選對另一種哺乳動物(如小鼠、大鼠或倉鼠等)的直向同源物特異?？贵w可識別野生型、突變體或兩種形式的多肽或其配體。
可使用多種本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生多克隆抗體。為產(chǎn)生多克隆抗體，可通過注射多肽或衍生物(例如片段或融合蛋白)免疫多種宿主動物，其中所述的宿主動物包括(但不限于)兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等等。在一個實施方案中，TYRO3亞家族多肽或其片段可與免疫原載體綴合，例如與牛血清白蛋白(BSA)或匙孔槭血藍蛋白(KLH)綴合。依賴于宿主物種，可使用多種佐劑以增強免疫應(yīng)答，所述佐劑包括(但不限于)付氏(完全或不完全)佐劑、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人類佐劑(如卡介苗(BCG)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum))。
為制備針對TYRO3亞家族成員多肽或配體或其片段、類似物或衍生物的多克隆抗體，可使用任何為通過培養(yǎng)連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。這包括(但不限于)最初由Kohler和Milstein，Nature，第256卷，495-497頁(1975)創(chuàng)立的雜交瘤(trioma)技術(shù)，以及三源雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(見Kozbor等，Immunol.Today，第4卷，72頁(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第80卷，2026-2030頁(1983))和產(chǎn)生人類多克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)。見Cole等，《Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)》，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(1985)。在本發(fā)明額外的實施方案中，可在無菌動物中產(chǎn)生單克隆抗體。見國際專利出版號WO89/12690。實際上，根據(jù)本發(fā)明，也可使用為產(chǎn)生“嵌合抗體”發(fā)展的技術(shù)(見Morrison等，J.Bacteriol.，第159卷，870頁(1984)；Neuberger等，Nature，第312卷，604-608頁(1984)；Takeda等；Nature，第314卷；452-454頁(1985))。簡言之，此類技術(shù)包括將第一種生物(例如小鼠)的特定受體或配體特異的抗體分子基因與來源于第二種生物(例如人)的適當(dāng)生物活性的抗體分子基因拼接。此類嵌合抗體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可通過已知技術(shù)產(chǎn)生含有抗體分子獨特型的抗體片段。例如此類片段包括(但不限于)可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段、可通過還原F(ab’)2的二硫鍵產(chǎn)生的Fab’片段和用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
根據(jù)本發(fā)明，描述的為產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(見U.S.專利No.5,476,786、5,132,405和4,946,778)可改變來產(chǎn)生特異與特定TYRO3亞家族成員多肽或配體結(jié)合的特異單鏈抗體。本發(fā)明額外的實施方案使用為構(gòu)建Fab表達文庫而描述的技術(shù)(見Huse等，Science，第246卷，1275-1281頁(1989))以允許迅速且容易地鑒定對TYRO3亞家族成員多肽或配體或者其衍生物或類似物具有目的特異性的單克隆Fab片段。
在產(chǎn)生和使用抗體過程中，篩選或檢測目的抗體可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)完成，例如放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、“夾層”免疫測定法、免疫放射測定法、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散測定法、原位免疫測定法(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記的原位免疫測定法)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定法(例如凝膠凝集測定法和血細胞凝集測定法)、補體結(jié)合測定法、免疫熒光測定法、A蛋白測定法和免疫電泳測定法等。在一個實施方案中，通過檢測初級抗體上的標(biāo)記檢測抗體結(jié)合。在另一個實施方案中，通過檢測二級抗體或試劑與初級抗體的結(jié)合檢測初級抗體。在還有的實施方案中，標(biāo)記二級抗體。本領(lǐng)域已知許多在免疫測定法中檢測結(jié)合的方法，并且這些方法在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
上述抗體可用于本領(lǐng)域已知的方法中，其中所述的方法與目的多肽或配體的定位和活性有關(guān)，例如為蛋白質(zhì)印跡、原位多肽成像、使用上述和本領(lǐng)域已知的任一檢測方法測量其在適當(dāng)生理樣品中的水平等。此類抗體也可用于與受體結(jié)合的配體的測定法中，例如U.S.專利No.5,679,582所述。抗體結(jié)合一般在生理條件下最容易發(fā)生，例如pH值7-8和生理離子強度。緩沖液中存在載體蛋白質(zhì)能穩(wěn)定測定法。雖然存在對最適條件干擾的耐受性，例如對增加或降低離子強度、溫度或pH值，或者加入去污劑或離液鹽的耐受性，但是此類干擾一般降低結(jié)合穩(wěn)定性。
還在其他的實施方案中，抗體也可用于通過淘選技術(shù)或免疫吸附相關(guān)技術(shù)分離表達目的多肽或配體的細胞，例如OA軟骨細胞。
在特定的實施方案中，可產(chǎn)生刺激或拮抗TYRO3亞家族成員多肽活性的抗體。胞內(nèi)單鏈Fv抗體尤其可用于調(diào)節(jié)(抑制)多肽活性。見Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，7884-7893頁(1993)；Chen，Mol.Med.Today，第3卷，160-167頁(1997)；Spitz等，Anticancer Res.，第16卷，3415-3422頁(1996)；Indolfi等，Nat.Med，第2卷，634-635(1996)；Kijma等，Pharmacol.Ther.，第68卷，247-267頁(1995)。此類抗體可使用下文所述的鑒定配體的測定法測試。
應(yīng)用及用途在此描述TYRO3亞家族成員多肽和其配體的應(yīng)用和用途，包括上述的TYRO3、Axl、cMer、GAS6和PROSI核酸、多肽和其抗體的應(yīng)用和用途。此外，在此描述的應(yīng)用和方法包括使用化合物，例如調(diào)節(jié)劑，如調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員多肽和配體的拮抗劑或拮抗物，因此也包括化合物，例如調(diào)節(jié)劑，如調(diào)節(jié)這些多肽和配體表達的反義和/或抑制核酸。
申請人已經(jīng)確定受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員以及其配體可在鑒定治療、預(yù)防和減輕OA和其他具有病理軟骨降解特征的病癥的新療法的篩選測定法和本文包括的在這一點上使用TYRO3亞家族成員和相關(guān)配體核酸和/或多肽的此類方法中作為藥物靶。例如，下面描述的方法，其使用干擾或調(diào)節(jié)TYRO3亞家族受體與配體(如GAS6)結(jié)合的化合物。在其他的實施方案中，此類方法可使用調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員配體與適當(dāng)TYRO3亞家族受體結(jié)合引起的下游信號事件的化合物。此類化合物可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定，例如通過使用本發(fā)明的篩選測定法鑒定。
此外，TYRO3亞家族基因和其基因產(chǎn)物，以及TYRO3亞家族配體(如GAS6或PROS1)的基因和基因產(chǎn)物也可用作組織特異性標(biāo)記以檢測或鑒定OA軟骨或組織，如OA軟骨細胞。因此上文所述的TYRO3亞家族受體和配體的核酸和多肽可用于檢測OA的方法中，例如用于通過使用TYRO3、Axl和/或cMer基因和基因產(chǎn)物(包括變體)檢測樣品中TYRO3、Axl和/或cMer的表達，如活體解剖、個體的組織樣品中TYRO3、Axl和/或cMer的表達的診斷和預(yù)后應(yīng)用中。在此提供了使用TYRO3亞家族成員核酸和多肽檢測軟骨降解，如與OA和其他關(guān)節(jié)炎病癥相關(guān)的降解的方法。
藥物篩選測定法使用篩選測定法，如使用下述篩選測定法，可以鑒定出與TYRO3亞家族成員受體和/或配體結(jié)合或相互作用的化合物，包括胞內(nèi)化合物，例如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分；與TYRO3亞家族成員受體或其配體、其他天然和合成的TYRO3亞家族成員配體和受體的基因相互作用的化合物；干擾TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物相互作用的化合物，例如干擾TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物與GAS6或另一配體特異結(jié)合的化合物；以及調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員基因活性的化合物，例如通過調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員受體或配體基因表達水平調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員基因活性的化合物；或者調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員受體或配體活性，例如生物活性的化合物。此類測定法可以這種方式用于鑒定與TYRO3、Axl或cMer和其各自配體相互作用的化合物。
因此，本發(fā)明的篩選測定法可用于鑒定與TYRO3亞家族成員基因和基因產(chǎn)物特異結(jié)合并且因此能夠調(diào)節(jié)表達的化合物。例如，在此描述的篩選測定法可用于鑒定與TYRO3基因的啟動子和其他調(diào)節(jié)序列結(jié)合并因此可調(diào)節(jié)TYRO3表達水平的化合物。見例如Platt，J.Biol.Chem.，第269卷，28558-28562頁(1994)。篩選測定法也可用于鑒定與TYRO3核酸或多肽結(jié)合從而穩(wěn)定TYRO3核酸或多肽的化合物。此外，這些篩選測定法也可用于鑒定抑制或調(diào)節(jié)此類結(jié)合相互作用并因此有用的化合物，例如TYRO3與特定轉(zhuǎn)錄因子或增強子結(jié)合或者TYRO3與穩(wěn)定劑結(jié)合的激動劑或拮抗劑。在這些或相似的篩選測定法中鑒定的化合物因此可用于治療與異常TYRO3亞家族成員基因表達和/或蛋白質(zhì)(包括，但不限于OA)異常表達的水平相關(guān)的疾病或紊亂。
可通過此類篩選測定法鑒定的化合物種類包括(但不限于)小分子，例如有機和無機分子，其分子量小于約2kDa，更優(yōu)選分子量小于約1kDa和/或能穿越血腦屏障或進入適當(dāng)細胞并影響TYRO3亞家族成員基因或者參與亞家族調(diào)節(jié)通路的某基因的表達；以及大分子，例如分子量大于約2kDa的分子。通過這些篩選測定法鑒定的化合物也可包括核酸、肽和多肽。此類化合物(包括肽)的實例包括(但不限于)可溶性肽；組合文庫的融合肽成員，如Lam等，Nature，第354卷，82-84頁(1991)和Houghten等，Nature，第354卷，84-86頁(1991)描述的組合文庫融合肽成員；組合化學(xué)衍生的文庫成員，如D-和/或L-構(gòu)型氨基酸分子文庫；磷酸肽，如隨機或部分變性的定向磷酸肽文庫成員(見例如Songyang等，Cell，第72卷，767-778頁(1993))；抗體，包括(但不限于)多克隆、單克隆、人化、抗獨特型、嵌合或單鏈抗體；抗體片段，包括(但不限于)Fab、F(ab’)2、Fab表達文庫片段和其表位-結(jié)合片段。這些篩選測定法中使用的核酸可為DNA或RNA或合成核酸。具體的實例包括(但不限于)反義核酸和核酶，以及雙鏈和三螺旋核酸分子。
結(jié)合化合物的測定法可容易地設(shè)計體外系統(tǒng)以鑒定能與本發(fā)明TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物的化合物。此類化合物可用于例如調(diào)節(jié)野生型TYRO3基因產(chǎn)物的表達、穩(wěn)定性或活性或者另外用于調(diào)節(jié)突變體或其他變體TYRO3基因產(chǎn)物的表達、穩(wěn)定性或活性。
通常，此類篩選測定法涉及在允許兩種化合物相互作用(例如結(jié)合)從而形成可檢測的復(fù)合物的條件下和足夠的時間內(nèi)制備包含TYRO3亞家族基因產(chǎn)物和測試化合物的反應(yīng)混合物。測定法可以多種不同方式中的任一種進行。例如，一個實施方案包含將TYRO3亞家族多肽或測試化合物錨定在固相，并在反應(yīng)最后和例如通過洗滌去除未結(jié)合化合物之后檢測固相上的TYRO3亞家族多肽與測試化合物的復(fù)合體。例如在一個此種方法優(yōu)選的實施方案中，TYRO3基因產(chǎn)物可錨定到固相上并且將標(biāo)記化合物(例如根據(jù)上述任一方法標(biāo)記的化合物)與其表面接觸。在TYRO3基因產(chǎn)物和測試化合物之間可形成復(fù)合體的充分條件下孵育測試化合物足夠的時間并從表面去除測試化合物的未結(jié)合分子(例如通過洗去除)之后檢測剩余的標(biāo)記分子。
在另一個備選的實施方案中，一種或多種不同測試化合物的分子與附著于固相并可在此接觸標(biāo)記的TYRO3亞家族多肽分子。在此類實施方案中，不同測試化合物分子優(yōu)選與固相在特定位置結(jié)合，以使與TYRO3亞家族多肽結(jié)合的測試化合物可通過確定固相或表面上結(jié)合的TYRO3亞家族多肽的位置而鑒定。
與TYRO3亞家族多肽和配體相互作用的化合物的測定多種已知檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法的任一種也可用于檢測和/或鑒定與受體和其配體相互作用的蛋白質(zhì)。例如可使用共免疫沉淀、交聯(lián)和通過梯度和層析柱的共純化，以及本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)。可使用此類測定法鑒定的蛋白質(zhì)包括(但不限于)胞外蛋白質(zhì)(如新的TYRO3亞家族成員配體)以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)(如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì))。
與TYRO3亞家族成員多肽和/或配體相互作用的化合物(包括其他胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸)自身可用于本發(fā)明的方法中，例如用于調(diào)節(jié)TYRO3、Axl或cMer基因或基因產(chǎn)物的活性和治療或預(yù)防軟骨降解。另外，此類相互作用化合物自身可用于本發(fā)明的篩選測定法中，以鑒定其他調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員活性的化合物，例如通過與TYRO3配體結(jié)合和/或由此產(chǎn)生的下游信號事件調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員活性，此類相互作的化合物可依次用于治療和預(yù)防軟骨降解。
作為不具有限制性的實例，表達克隆測定法可用于鑒定新的TYRO3配體和其他特異與TYRO3受體相互作用的蛋白質(zhì)。在此類測定法中，cDNA表達文庫可從任何表達TYRO3-特異配體的細胞系產(chǎn)生，例如從表達GAS6的細胞產(chǎn)生。然后此表達文庫的克隆可轉(zhuǎn)染和感染到正常不表達TYRO3-特異配體的細胞中。然后用編碼TYRO3-特異配體的克隆轉(zhuǎn)染的細胞可表達此基因產(chǎn)物，并可使用標(biāo)準技術(shù)(如FACS)或使用吸附有TYRO3多肽(例如TYRO3多肽Fc-融合物)的磁珠鑒定和分離。
另外，可使用本領(lǐng)域熟知的免疫沉淀技術(shù)從細胞系分離TYRO3亞家族成員多肽和/或配體。
也可使用上面任一種用于鑒定結(jié)合化合物的篩選測定法分離TYRO3亞家族成員多肽和/或配體。例如，TYRO3-Fc融合多肽可與固相結(jié)合或連接，標(biāo)記化合物(例如TYRO3配體)可在允許形成融合多肽與測試化合物的復(fù)合體的條件下與表面接觸足夠的時間。然后從表面去除未結(jié)合的測試化合物分子(例如通過洗滌去除)，并檢測仍然結(jié)合的標(biāo)記化合物。
一旦這樣分離，可使用標(biāo)準技術(shù)以鑒定任何此類測定法中檢測的蛋白質(zhì)。例如可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(如Edman降解技術(shù))確定至少與TYRO3、AXL或cMer基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分。見例如Creighton，《ProteinsStructures and Molecular Principles》，W.H.Freeman & Co.，NY，34-49頁(1983)。
一旦此類蛋白質(zhì)得到鑒定，其氨基酸序列可用作產(chǎn)生使用例如上述常規(guī)的雜交或PCR技術(shù)篩選編碼此類蛋白質(zhì)的基因序列的寡核苷酸混合物的指南。見例如Ausubel，前文和《PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications》，Innis等編，Academic Press，Inc.，NY(1990)對產(chǎn)生此類寡核苷酸混合物的技術(shù)和其在篩選測定法中的用途的描述。
已知其他本領(lǐng)域的方法，其可用于同時鑒定編碼與TYRO3亞家族成員基因或基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)基因，例如可用標(biāo)記的TYRO3多肽探測表達文庫。
作為另一個非限制性實例，可使用雙雜交系統(tǒng)檢測在體內(nèi)與TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。簡言之，使用這樣的系統(tǒng)可構(gòu)建編碼兩個雜合蛋白的質(zhì)粒，其中一個優(yōu)選包含與TYRO3(如情況可以是AXL或eMer)基因產(chǎn)物融合的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一個雜合蛋白優(yōu)選包含用于第一個雜合體的與未知蛋白質(zhì)融合的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的激活結(jié)構(gòu)域，其中所述的未知蛋白由作為部分cDNA文庫重組到質(zhì)粒文庫中的cDNA編碼。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合質(zhì)粒和cDNA文庫可共轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株或其他含有報告基因如HBS、lacZ、HIS3或GFP的適當(dāng)生物中。優(yōu)選此報告基因的調(diào)節(jié)區(qū)域包含兩種雜合蛋白轉(zhuǎn)錄激活子部分的結(jié)合位點。在這樣的雙雜交系統(tǒng)中，兩種雜合蛋白中單獨存在一種不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。具體而言，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活轉(zhuǎn)錄，因為其不能定位于必需的激活功能。同樣激活結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活轉(zhuǎn)錄，因為其不能定位于報告基因上的DNA結(jié)合位點。然而，兩種雜合蛋白的相互作用重構(gòu)了有功能的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白并引起報告基因的表達。因此，在雙雜合系統(tǒng)(如在此描述的系統(tǒng))中，TYRO3多肽(即與轉(zhuǎn)錄激活子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的TYRO3多肽)與測試多肽(即與轉(zhuǎn)錄激活子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的蛋白質(zhì))的相互作用可通過簡單地檢測報告基因基因產(chǎn)物的表達來檢測。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)技術(shù)完成此類雙雜合和其他測定法中DNA文庫的篩選。作為特定的和非限制性實例，cDNA片段可插入載體以使其在翻譯水平上與GAL4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，并與“誘餌”GAL4融合質(zhì)粒(編碼TYRO3基因產(chǎn)物的GAL4融合物)共轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株或其他含有HIS3基因的適當(dāng)生物中，其中所述的HIS3基因由含有GAL4激活序列的的啟動子驅(qū)動。來源于此cDNA文庫的與GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合的蛋白質(zhì)將重構(gòu)并激活GAL4蛋白質(zhì)并從而驅(qū)動HIS3基因的表達，其中所述與GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合的蛋白質(zhì)與GAL4融合物的TYRO3多肽部分相互作用。表達HIS3基因的菌落可通過其在含有缺少組氨酸的半固體瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上的生長來檢測。然后可從這些菌株中純化cDNA，測序并用于鑒定與TYRO3多肽相互作用的編碼蛋白質(zhì)。
一旦鑒定出與本發(fā)明的TYRO3亞家族成員基因或基因產(chǎn)物結(jié)合的化合物，這些方法中所述的篩選方法也可用于鑒定其他化合物，例如與這些結(jié)合化合物結(jié)合的小分子、肽和蛋白質(zhì)。此類化合物也可用于調(diào)節(jié)與TYRO3亞家族成員基因及其基因產(chǎn)物相關(guān)的生物活性，例如通過與天然配體結(jié)合并阻止其與基因產(chǎn)物的相互作用來進行調(diào)節(jié)。
干擾TYRO3亞家族配體相互作用的化合物的測定法如上面提到的，TYRO3亞家族成員可與一種或多種分子相互作用，例如在體內(nèi)或體外與特異配體相互作用。因此，破壞或干擾此結(jié)合相互作用的化合物可用于調(diào)節(jié)與酪氨酸激酶此亞家族相關(guān)的生物活性，例如調(diào)節(jié)酪氨酸激酶活性，包括例如軟骨降解。此類化合物因此可用于治療、預(yù)防或減輕與TYRO3表達和/或活性異常水平相關(guān)的紊亂，例如OA。
此類化合物包括(但不限于)根據(jù)上述篩選測定法鑒定的化合物，所述篩選測定法用于鑒定與TYRO3亞家族成員多肽結(jié)合的化合物，這包括在此描述的大量代表性化合物類別中的任何一種。
通常，鑒定干擾基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體(例如配體)相互作用的化合物的測定法包括在使基因產(chǎn)物和其結(jié)合配偶體結(jié)合并形成復(fù)合體的充足時間內(nèi)和條件下制備含有基因產(chǎn)物及其結(jié)合配偶體測試反應(yīng)混合物。為測試化合物的抑制活性，即抑制結(jié)合復(fù)合體形成或破壞曾經(jīng)形成的結(jié)合復(fù)合體的能力，測試化合物優(yōu)選也存在于測試反應(yīng)混合物中。在一個代表性的實施方案中，測試化合物可最初與基因產(chǎn)物和其配偶體一起包含在測試反應(yīng)混合物中。然而另外，測試化合物也可在稍后的時間加入測試反應(yīng)混合物中，在加入基因產(chǎn)物和其配偶體之后。在優(yōu)選的實施方案中，也可制備一種或多種不含測試化合物的對照反應(yīng)混合物。一般地，對照反應(yīng)混合物含有與測試反應(yīng)混合物中相同的基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體，但是不含測試化合物。對照反應(yīng)混合物也可含有測試反應(yīng)混合物中沒有的對照劑，以替代測試化合物。然后基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體間復(fù)合體的形成可在反應(yīng)混合物中檢測。在無測試化合物條件下，例如在對照反應(yīng)混合物中而不是在存在測試化合物條件下此種復(fù)合體的形成表明測試化合物為干擾或調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物和其結(jié)合配偶體相互作用的化合物。
此類用于篩選調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體相互作用的化合物的測定法可以多相、或者備選地以均相形式進行。多相測定法一般包括將基因產(chǎn)物或結(jié)合配偶體錨定在固相上并在反應(yīng)結(jié)束時檢測錨定到固相上的化合物。因此，此類測定法與上述用于檢測和/或鑒定核酸和基因產(chǎn)物以及檢測或鑒定配體的固相測定法相似。實際上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到上述那些測定法的原理和技術(shù)中的許多方面可在此描述的固相測定法適度的實驗中修改并應(yīng)用，以鑒定調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體間相互作用的化合物。
不考慮所用的特定測定法，例如為鑒定通過競爭干擾TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物與結(jié)合配偶體相互作用的化合物或鑒定破壞已形成的結(jié)合復(fù)合體的化合物，可改變試劑加入反應(yīng)混合物的順序?？赏ㄟ^在存在測試化合物條件下進行反應(yīng)鑒定通過競爭干擾基因產(chǎn)物與結(jié)合配偶體相互作用的化合物。具體而言，在此類鑒定法中，測試化合物可在基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體之前或同時加入反應(yīng)混合物中?？赏ㄟ^在復(fù)合體形成之后加入測試化合物到反應(yīng)混合物中測試破壞基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體已形成復(fù)合體的測試化合物。
在此描述的篩選測定法也可通過使用與全長TYRO3部分對應(yīng)的肽或多肽、Axl或cMer多肽或蛋白質(zhì)或者用包含此類肽或多肽序列的融合蛋白進行。例如，鑒定調(diào)節(jié)TYRO3多肽與結(jié)合配偶體相互作用的篩選測定法可使用相應(yīng)于全長TYRO3多肽與結(jié)合配偶體結(jié)合的特定區(qū)域或結(jié)構(gòu)域(例如受體“結(jié)合位點”)的肽或多肽進行。
本領(lǐng)域已知的多種方法可用于鑒定TYRO3亞家族成員多肽的特定結(jié)合位點。例如，可通過突變TYRO3基因并如上所述篩選結(jié)合的破壞鑒定結(jié)合位點。編碼結(jié)合配偶體的基因也可在此類鑒定法中被突變以鑒定補償TYRO3基因突變所致破壞的突變。然后這些突變的序列分析可揭示與兩種蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域?qū)?yīng)的突變。
在備選的實施方案中，蛋白質(zhì)例如TYRO3蛋白質(zhì)或TYRO3蛋白質(zhì)結(jié)合配偶體可使用在此描述的方法錨定到固體表面或支持物上。另一個與錨定到固體表面的蛋白質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記蛋白質(zhì)可用蛋白水解酶處理，可根據(jù)上述結(jié)合測定法的方法允許其片段與連接到固體表面的蛋白質(zhì)相互作用。洗滌之后，處理蛋白質(zhì)的短標(biāo)記肽段仍可與錨定蛋白質(zhì)相聯(lián)。可分離這些肽并且通過氨基酸序列鑒定其來自的全長蛋白質(zhì)區(qū)域。
還在其他的實施方案中，干擾TYRO3亞家族成員多肽與其配體間相互作用的化合物也可通過篩選調(diào)節(jié)多肽(例如TYRO3多肽Fc融合構(gòu)建體)與表達其特異配體的細胞結(jié)合的化合物來鑒定。
診斷和預(yù)后應(yīng)用多種方法可用于使用試劑(如上述TYRO3亞家族成員核酸和多肽，以及此類核酸和多肽的抗體)的診斷和預(yù)后應(yīng)用。例如使用在此描述的方法可以檢測個體生物試樣(如細胞或組織樣品)中TYRO3亞家族核酸或蛋白質(zhì)的表達，其中所述的樣品為例如獲得或來自個體受試者或患者的活檢組織。用于此應(yīng)用的優(yōu)選的細胞或組織為與OA有關(guān)的細胞或組織，例如軟骨細胞或關(guān)節(jié)連接組織(如軟骨)、滑膜液和/或血清。如上面解釋的，TYRO3受體和其配體GAS6在此類OA細胞和組織中以提高的水平表達。
因此，使用在此描述的方法以及其他本領(lǐng)域已知的方法，技術(shù)人員可檢測到個體的細胞或組織樣品中TYRO3或GAS6核酸或多肽提高的水平，并可因此檢測和/或鑒定樣品中的細胞或組織為OA的癥狀。在特定優(yōu)選的實施方案中，此類方法鑒定的具體組織類型為軟骨組織。通過使用此類方法檢測個體的這些細胞或組織，技術(shù)人員可從而診斷個體中OA的存在。在優(yōu)選的實施方案中，在此描述的方法使用預(yù)包裝的診斷試劑盒進行。此類試劑盒可包含至少一種特定的TYRO3核酸或TYRO3基因產(chǎn)物特異的抗體試劑。例如該診斷試劑盒可用于檢測TYRO3亞家族成員基因或基因產(chǎn)物的mRNA水平或蛋白質(zhì)水平，該試劑盒包含(a)TYRO3亞家族成員或其片段的多核苷酸；(b)與(a)互補的核苷酸序列；(c)該TYRO3亞家族成員基因或其片段的表達產(chǎn)物；或者(d)該表達產(chǎn)物的抗體，并且其中組分(a)、(b)、(c)或(d)可包含基本組分。
在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒也含有其使用說明書用于例如檢測患病細胞或組織或者診斷與TYRO3基因或基因產(chǎn)物異常表達相關(guān)的病癥(如OA)。在優(yōu)選的實施方案中，此類說明書可直接與試劑盒包裝。然而在其他實施方案中，說明書可單獨提供。例如，本發(fā)明提供了使用試劑盒的實施方案，其中試劑盒的說明書可例如從互聯(lián)網(wǎng)下載。本發(fā)明的試劑盒也可優(yōu)選在單獨的容器、適當(dāng)?shù)木彌_液和其他使用試劑的溶液中包含例如核酸或TYRO3基因或基因產(chǎn)物的特異抗體，以檢測TYRO3基因或基因產(chǎn)物。試劑盒和其中含有的任何試劑可用于例如臨床情況下診斷表現(xiàn)和懷疑患有OA的患者。
包含TYRO3基因表達的任何組織類型的組織和任何細胞類型的細胞的樣品也可用于此類診斷方法中，例如用于檢測TYRO3基因的表達或TYRO3基因產(chǎn)物(如TYRO3多肽)，以及鑒定表達TYRO3基因或TYRO3基因產(chǎn)物的細胞，例如軟骨細胞。因此，在一個實施方案中，在此描述的方法可原位實施，例如使用從個體(如活檢組織)獲得的細胞或組織。
在此描述的方法不僅限于診斷應(yīng)用，也可用于預(yù)后應(yīng)用，例如監(jiān)測與TYRO3亞家族基因或基因產(chǎn)物異常表達相關(guān)疾病的進程，如OA的進程，或者監(jiān)測其療法。因此，本發(fā)明的預(yù)后方法可包括在代表性的實施方案中于處理或治療過程(例如OA的藥物治療或運動療法過程)中監(jiān)測個體的TYRO3核酸或多肽水平。類似地，本發(fā)明的方法也可用于在治療過程中檢測和鑒定患病細胞或組織，例如與非OA細胞或組織相比過量表達TYRO3的細胞。在此類實施方案中，患病細胞減少的數(shù)量一般為有效治療的標(biāo)志。本發(fā)明的方法還可用于例如篩選候選藥物或化合物和鑒定作為例如抗OA藥物有效的候選藥物和化合物。此類方法可例如使用動物模型在體內(nèi)實施或者在體外實施，例如細胞培養(yǎng)測定。在一個實施方案中，此類方法可包括使測試化合物與細胞接觸并鑒定細胞TYRO3基因或基因產(chǎn)物的表達是否得到抑制。在另一個實施方案中，測試化合物可與細胞接觸或施用于生物，并在例如用于細胞培養(yǎng)測定的細胞培養(yǎng)基中或動物模型測定的組織、血液或其他體液中測量TYRO3核酸或多肽的胞外水平。
TYRO3亞家族核酸的檢測本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法包括測定TYRO3亞家族(優(yōu)選TYRO3)基因表達水平的方法。多種本領(lǐng)域已知的方法可用于檢測樣品中核酸序列的測定水平。例如，可分離已知或懷疑表達特定基因的細胞類型或組織的RNA并使用本領(lǐng)域已知的雜交或PCR技術(shù)測試。分離的細胞可為例如來源于細胞培養(yǎng)或個體的細胞。取自細胞培養(yǎng)的細胞的分析可用于例如檢測化合物對基因表達的影響或者另外驗證細胞為表達目的基因的特定細胞類型的細胞。
作為非限制性實例，檢測例如TYRO3核酸的診斷方法可包括在有利于核酸試劑與樣品核酸中其互補序列特異退火或雜交的條件下接觸和孵育從含有一種或多種標(biāo)記核酸試劑的樣品獲得的核酸(包括重組DNA分子、克隆基因或其簡并變體)，如重組TYRO3 DNA分子、克隆基因或其簡并變體。孵育之后，去除所有非退火或非雜交核酸。然后檢測已雜交核酸的存在(如果任何此類分子存在的話)，核酸試劑與其退火的TYRO3核酸序列水平可與對照樣品預(yù)期的退火模式或水平比較，以確定TYRO3核酸是否以提高的水平表達，其中所述的對照樣品為例如正常的非OA細胞或組織樣品。
在此種檢測方案優(yōu)選的實施方案中，來自目的細胞類型或組織的核酸可固定到例如固體支持物(如膜或塑料表面)上，例如尼龍膜、微滴定板或聚苯乙烯珠上。孵育之后，非退火的標(biāo)記TYRO3亞家族核酸試劑可容易地去除，并且可使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準技術(shù)檢測剩余的退火的標(biāo)記TYRO3亞家族核酸試劑。
備選的檢測患者樣品或其他細胞或組織來源中TYRO3亞家族核酸的診斷方法可包括擴增，例如通過PCR擴增，見例如U.S.專利No.4,683,202教導(dǎo)的實施方案，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)檢測經(jīng)擴增的分子。得到的擴增的TYRO3亞家族核酸水平可與樣品在只含有TYRO3亞家族核酸正常水平如正常細胞或組織條件下擴增預(yù)期的水平(例如健康軟骨細胞中的水平)比較，以確定任一TYRO3亞家族核酸是否提高了表達的水平。
在此種檢測方案的一個優(yōu)選的實施方案中，從目的RNA分子合成cDNA分子，例如通過反轉(zhuǎn)錄合成。然后cDNA中的序列可用作核酸擴增反應(yīng)的模板，如PCR的模板。此種測定法的反轉(zhuǎn)錄和擴增步驟中用作合成起始試劑的核酸反應(yīng)物(例如引物)優(yōu)選選自在此描述的TYRO3亞家族核酸序列或者為其片段。核酸反應(yīng)物的長度優(yōu)選為至少約9-30個核苷酸。擴增反應(yīng)可使用例如放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的核苷酸進行，以便于檢測。備選地，可制備足夠的擴增產(chǎn)物，以使產(chǎn)物可通過常規(guī)的溴化乙錠或其他染色方法顯現(xiàn)。
本發(fā)明的TYRO3亞家族基因表達測定法也可原位進行，即直接在固定和/或冷凍的患者組織的組織切片上進行，從而無需核酸純化。TYRO3亞家族核酸試劑可用作此種原位方法的探針或引物。見例如Nuovo，《PCRIn Situ HybridizationProtocols And Application》，Raven Press，NY(1992)。另外，如果可獲得足量的適當(dāng)細胞，可進行標(biāo)準的Northern分析，以通過檢測TYRO3亞家族mRNA的水平測定TYRO3亞家族基因表達水平。
TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物的檢測本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法也包括這樣的方法，其包括檢測TYRO3亞家族成員蛋白質(zhì)或其他多肽的水平并包括其功能保守變體和片段的水平。例如，完全的野生型或突變體TYRO3(或Axl或cMer)基因產(chǎn)物的抗體或TYRO3基因產(chǎn)物的功能保守變體或肽片段的抗體可用作診斷和預(yù)后試劑。此類試劑可用于例如檢測TYRO3基因產(chǎn)物合成或表達水平的異常或用于檢測TYRO3亞家族基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、表達時間或生理位置的異常。如在此描述的抗體和免疫測定法對于評價治療功效(例如對OA的治療功效)也具有重要的體外應(yīng)用。例如，抗體或抗體片段可用于體外篩選可能的治療化合物，以確定化合物對TYRO3表達或TYRO3多肽生產(chǎn)的影響?？设b定對異常TYRO3亞家族相關(guān)病癥具有有益作用的化合物并可使用此類測定法確定此類化合物的有效治療劑量。
作為一個實例，抗體或抗體片段可用于例如通過使用熒光標(biāo)記抗體結(jié)合光學(xué)顯微鏡、流式細胞儀或熒光檢測技術(shù)的免疫熒光技術(shù)檢測TYRO3亞家族基因產(chǎn)物、該基因產(chǎn)物的變體或其片段的存在。
在特別優(yōu)選的實施方案中，抗體或其片段也可在組織水平上使用，例如在原位檢測TYRO3亞家族成員基因產(chǎn)物的免疫熒光或免疫電子顯微術(shù)中使用。原位檢測可通過去從患者中取下組織學(xué)標(biāo)本(例如組織樣品)并對其應(yīng)用本發(fā)明的標(biāo)記抗體或此種抗體的片段完成。抗體或抗體片段優(yōu)選通過用標(biāo)記的抗體或抗體片段覆蓋生物樣品來應(yīng)用。通過使用此種方法，就可能不僅檢測到例如TYRO3亞家族基因產(chǎn)物的存在，也可以檢測所檢查組織中基因產(chǎn)物的分布。本領(lǐng)域熟知的多種組織學(xué)方法(例如染色方法)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地修改而以恰當(dāng)?shù)膶嶒炌瓿纱朔N原位檢測。
可用于鑒定基因產(chǎn)物的免疫測定法一般包括在能與目的基因產(chǎn)物特異結(jié)合的可檢測標(biāo)記抗體存在的條件下孵育生物試樣(例如組織提取物)，其中所述的目的基因產(chǎn)物包括例如其功能保守變體或肽片段。然后可通過本領(lǐng)域已知的大量技術(shù)中的任一種檢測結(jié)合的抗體。
治療方法和藥物組合物TYRO3亞家族成員核酸和多肽、其調(diào)節(jié)劑(例如激動劑、拮抗劑、抑制劑)和其特異抗體也可用于治療方法和組合物中用作藥物，例如在治療、預(yù)防或減輕與異常(優(yōu)選為提高的)TYRO3表達水平相關(guān)的疾病和紊亂(例如OA)中用作藥物，或用于加工藥物制劑。
因此，在特定優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的治療方法包括施用包含一種或多種化合物或調(diào)節(jié)劑的藥物組合物，其中所述的化合物或調(diào)節(jié)劑為例如調(diào)節(jié)(如抑制)TYRO3亞家族成員表達或活性的化合物或調(diào)節(jié)劑，例如與本發(fā)明的TYRO3亞家族成員核酸或多肽結(jié)合的化合物、調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員基因表達的化合物和/或干擾或調(diào)節(jié)TYRO3亞家族成員核酸或多肽與結(jié)合配偶體(如TYRO3亞家族成員特異性配體，例如PROS1或GAS6)結(jié)合的化合物。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的治療方法可包括一種或多種細胞定向療法(cell targeted therapy)，其指導(dǎo)化合物(例如藥物、藥物前體、毒素或細胞毒素)到表達TYRO3亞家族成員核酸或多肽的細胞中。
抑制方法在備選的實施方案中，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)(例如增加或降低)TYRO3亞家族成員基因或其基因產(chǎn)物的表達或活性來治療與TYRO3亞家族成員基因或基因產(chǎn)物異常表達或活性相關(guān)的疾病或病癥(例如OA)的方法和組合物。此類方法可只包括施用一種或多種調(diào)節(jié)例如TYRO3、AXL或cMer基因表達、合成或活性的化合物。優(yōu)選施用這些一種或多種化合物直到病癥的一種或多種癥狀消除或至少減輕時。
可表現(xiàn)調(diào)節(jié)目的TYRO3亞家族成員核酸的活性、表達或合成能力的化合物為反義分子?？稍O(shè)計此類分子以降低或抑制野生型核酸和多肽或者另外可作用于突變核酸或多肽。反義分子也可用于抑制配體核酸的表達。
反義RNA和DNA分子通過與靶mRNA分子雜交直接阻斷mRNA的翻譯并阻止蛋白質(zhì)翻譯。反義方法包括設(shè)計與靶基因mRNA互補的寡核苷酸。反義寡核苷酸將與互補靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合并阻止翻譯。絕對互補性雖然為優(yōu)選但為不必。如在本文中使用的“反義”廣義地包括RNA-RNA相互作用、三螺旋相互作用、核酶和RNA酶H介導(dǎo)的捕獲。反義核酸分子可由重組基因編碼以在細胞中表達(見例如U.S.專利No.5,814,500和5,811,234)或者備選地其可以合成方法制備(見U.S.專利No.5,780,607)。
與核酸部分“互補”的序列指具有能與核酸雜交并形成雙鏈體的充分互補性的序列。核酸雜交的能力依賴于序列互補性的程度和反義核酸的長度。然而一般地雜交核酸越長，其越可含有更多的堿基錯配并仍可形成穩(wěn)定的雙鏈體(或在三旋方法中的三鏈體)?？扇萑痰腻e配程度可容易地確定，例如通過使用測定雜交復(fù)合體解鏈溫度的標(biāo)準方法來確定。
在一個優(yōu)選的實施方案中，與TYRO3亞家族成員基因非編碼區(qū)互補的寡核苷酸可用于反義方法中以抑制內(nèi)源TYRO3亞家族成員mRNA分子的翻譯。反義核酸優(yōu)選長度至少6個核苷酸，更優(yōu)選長度至少約6-50個核苷酸。在具體的實施方案中，寡核苷酸可為長度至少10個，至少15個，至少20個，至少25個或至少50個核苷酸。
一般優(yōu)選的為首先進行體外研究，以量化反義寡核苷酸抑制基因表達的能力。優(yōu)選這些研究使用區(qū)分反義基因抑制和寡核苷酸非特異性生物作用的對照。還優(yōu)選這些研究比較靶RNA或蛋白質(zhì)的水平與體內(nèi)對照RNA或蛋白質(zhì)的水平。此外，可以預(yù)想使用反義寡核苷酸獲得的結(jié)果與使用對照寡核苷酸獲得的結(jié)果的比較。優(yōu)選對照寡核苷酸與檢測寡核苷酸長度相同并且僅與反義序列不同的寡核苷酸的核苷酸序列為阻止與靶mRNA序列特異雜交所必需。
但是可使用與靶基因編碼區(qū)序列任何部分互補的反義核苷酸，那些與轉(zhuǎn)錄區(qū)、非反義區(qū)互補的為最優(yōu)選。
反義分子優(yōu)選遞送給體內(nèi)表達靶基因的細胞，如軟骨細胞。已經(jīng)發(fā)展許多遞送反義DNA或RNA到細胞中的方法。例如，反義分子可以直接注射到組織位點中(例如直接注射到腫瘤中)，或者可設(shè)計經(jīng)修飾的反義分子以作用于目的細胞，例如可全身性施用連接到特異結(jié)合靶細胞表面上表達的受體或抗原的肽或抗體的反義分子。
優(yōu)選的實施方案獲得足夠抑制內(nèi)源mRNA翻譯的胞內(nèi)反義核酸分子濃度。例如，一個優(yōu)選的方法使用重組DNA構(gòu)建體，其中反義寡核苷酸置于強pol III或pol II強啟動子控制之下。使用此種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染靶細胞會引起足夠數(shù)量單鏈RNA的轉(zhuǎn)錄，這些RNA會與內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄物形成互補堿基對從而阻止靶基因mRNA的翻譯。例如可引入上述載體以使其為細胞攝入并指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。此種載體可保持游離或成為與染色體整合，只要其可轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生目的反義RNA。此類載體可通過本領(lǐng)域的重組DNA技術(shù)方法標(biāo)準構(gòu)建。載體可為用于哺乳動物細胞中復(fù)制和表達的質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的其他載體?？赏ㄟ^任何本領(lǐng)域已知的啟動子在特定細胞類型(如在造血細胞)中表達編碼反義RNA的序列。例如上面所討論的與重組體TYRO3亞家族成員核酸表達相關(guān)的啟動子的任何一種也可用于表達TYRO3亞家族成員反義核酸。
除了反義技術(shù)，RNA適體(見Good等，Gene Ther.，第4卷，45-54頁(1997))、雙鏈RNA(WO 99/32619)、核酶(見Cech，Amer.Med Assn.，第260卷，3030頁(1988)；Cotton等，EMBO J.，第8卷，3861-3866頁(1989)；Grassi和Marini，Ann.Med.，第28卷，499-510頁(1996)和Gibson，CancerMetast.Rev.，第15卷，287-299頁(1996))和/或三螺旋DNA(見Gee等，《Molecular and Immunologic Approaches》，Huber和Carr編輯，F(xiàn)uturaPublishing Co.，Mt.Kisco，NY(1994))可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法用于調(diào)節(jié)靶核酸的活性、表達或合成。
另外，小干擾RNA(siRNA)分子也可用于抑制目的多肽或配體的表達。RNA干擾為施用外源短RNA雙鏈體的方法，其中一條鏈與靶mRNA的編碼區(qū)對應(yīng)。見Elbashir等，Nature，第411頁，494-498頁(2001)。一旦進入細胞，siRNA分子不僅引起外源RNA雙鏈體的降解，也導(dǎo)致具有相同序列的單鏈RNA的將解，這包括內(nèi)源信使RNA。因此，siRNA可能比常規(guī)反義RNA方法更有效，因為此技術(shù)被認為通過催化機制作用。
優(yōu)選的siRNA分子一般長度大于約19個核苷酸并包含TYRO3亞家族成員或其配體的核酸序列。遞送siRNA到靶細胞中的有效策略包括上述遞送反義核酸方法中的任何一種。例如siRNA可使用物理或化學(xué)轉(zhuǎn)染通過轉(zhuǎn)導(dǎo)引入細胞中。另外，可使用例如多種允許功能siRNA或其前體轉(zhuǎn)錄的PolIII啟動子表達盒在細胞中表達SiRNA。見例如Scherr等，Curr.Med.Chem.，第10卷，No.3，245-256頁(2003)；Turki等，Hum.Gene Ther.，第13卷，No.18，2197-2201頁(2002)和Cornell等，Nat.Struct.Biol.，第10卷，No.2，91-92頁(2003)。
藥物制劑本發(fā)明治療方法中所用的組合物可例如以治療有效劑量在體外或離體施用給細胞培養(yǎng)物，或者更優(yōu)選在體內(nèi)施用給個體，以治療與異常TYRO3亞家族基因表達和/或活性相關(guān)的疾病或病癥(如OA)。例如與本發(fā)明的TYRO3亞家族基因或基因產(chǎn)物結(jié)合的化合物(包括上述此類篩選測定法中鑒定的化合物)可被施用給細胞或個體以抑制基因或基因產(chǎn)物的表達和/或活性。本發(fā)明因此提供了藥物制劑以用作例如治療與異常TYRO3亞家族基因表達或活性相關(guān)的病癥(包括OA)的治療化合物。
術(shù)語“治療有效劑量”和“有效劑量”指足夠引起治療反應(yīng)的化合物數(shù)量。在化合物(例如藥物或毒素)以復(fù)合體(例如與特異性抗體一起)施用的實施方案中，術(shù)語“治療有效劑量”和“有效劑量”可指足夠引起治療反義的復(fù)合體數(shù)量。治療反應(yīng)可為使用者(例如臨床醫(yī)師)認為是對治療有效反應(yīng)的任何反應(yīng)。這樣治療反應(yīng)一般為疾病和病癥一種和多種癥狀的減輕。在藥物制劑用于治療OA的優(yōu)選實施方案中，治療反應(yīng)可為觀察到的軟骨降解數(shù)量的降低，例如治療中患者活檢組織中觀察到的軟骨降解數(shù)量的降低。
化合物的毒性和治療效果可通過標(biāo)準藥學(xué)方法確定，例如在細胞培養(yǎng)測定法中或使用實驗動物確定LD50和ED50。參數(shù)LD50和ED50為本領(lǐng)域所熟知并分別指對群體的50％致死的化合物劑量和群體的50％治療有效的化合物劑量。毒性和治療效應(yīng)的劑量比例稱為治療指數(shù)并可表示為比例LD50/ED50。優(yōu)選表現(xiàn)大的治療指數(shù)的化合物。
雖然可使用表現(xiàn)毒副作用的化合物，然而，在這些情況下特別優(yōu)選使用特異引導(dǎo)此類化合物到受影響組織位點的遞送系統(tǒng)，以使對其他細胞、組織或器官的潛在破壞最小化，并降低副作用。
從細胞培養(yǎng)測定法或動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于制備一系列用于人類的藥劑。用于本發(fā)明治療方法的化合物的劑量優(yōu)選在包括ED50濃度但具有較小或無毒性(例如低于LD50濃度)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。任何應(yīng)用中所用的具體劑量可在此范圍內(nèi)變化，其依賴于這些因素，如所使用的具體藥劑形式、所用的給藥途徑、個體(例如患者)的情況等等。
治療有效劑量最初可從細胞培養(yǎng)測定法中估計并在動物模型中表示，以獲得包括IC50的循環(huán)濃度范圍?；衔锏腎C50濃度為達到癥狀半最大抑制的濃度，例如細胞培養(yǎng)測定法中測定的。然后使用此信息可更精確地確定用于特定個體(如人類患者)的適當(dāng)劑量。
可常規(guī)地通過如高效液相色譜法(HPLC)或氣相層析之類的技術(shù)在個體如患者中測量質(zhì)膜中的化合物。
根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方式配制。
因此，化合物和其生理上可接受的鹽類和溶化物可為吸入和吹入(通過嘴或鼻)給藥或者口腔、含服、腸胃外或直腸給藥配制。
為口腔給藥，藥物組合物可采用例如通過常規(guī)方法利用可藥用賦形劑制備的片劑或膠囊形式，如結(jié)合劑，例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羥丙基甲基纖維素；填充劑，例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石粉或硅石；崩解劑，例如馬鈴薯淀粉或羥乙酸淀粉鈉；或者濕潤劑，例如十二烷基硫酸鈉。片劑可用本領(lǐng)域熟知的方法包被。口腔給藥的液體制劑可采用例如溶液、糖漿劑或懸浮液形式，或者可以使用前與水或其他適當(dāng)載體組合的干燥產(chǎn)物提供。此類液體制劑可通過常規(guī)方法利用可藥用賦形劑制備，如懸浮劑，例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂；乳化劑，例如卵磷脂或阿拉伯膠；非水性載體，例如杏仁油、油酯、乙醇或分級植物油；防腐劑，例如甲基或丙基對羥苯酸或山梨酸。制劑也可適當(dāng)?shù)睾芯彌_鹽、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。
口腔給藥的制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲?，以提供活性化合物的控制釋放。為口腔含服給藥，組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。為吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物一般以噴霧劑形式遞送，其中所述的噴霧劑使用適當(dāng)?shù)耐七M劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當(dāng)氣體，通過增壓包裝或噴霧器給藥。在增壓煙霧劑的情況下，單位劑量可通過提供閥門以遞送測定的數(shù)量確定。吸入器或吹入器中使用的例如凝膠膠囊或藥筒可配制含有化合物和適當(dāng)粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
化合物可配制以通過注射而腸胃外給藥，例如快速濃注或連續(xù)輸注。注射制劑可以單位劑量形式與附加防腐劑一起提供，例如在安培瓶中或多劑量容器中提供。組合物可采用油性或水性載體的懸浮液、溶液或乳液形式并可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。備選地，活性成分可為使用前與適當(dāng)載體(例數(shù)滅菌無熱原水)組合的粉末形式。
化合物也可以直腸組合物配制，如栓劑或保留灌腸劑，其含有例如常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可脂或其他甘油酯。
除了前述制劑之外，化合物也可以貯藏酮制品配制。這樣長效作用的制劑可通過植入使用，例如皮下或肌肉內(nèi)施用；或通過肌內(nèi)注射施用。這樣，例如化合物可與適當(dāng)多聚或疏水材料配制，例如可接受的油中的乳劑、離子交換樹脂或微溶衍生物(例如微溶鹽)。
如果需要，組合物可在包裝或配藥裝置中提供，其可含有包含活性成分的一種或多種單位劑形。包裝可例如包含金屬或塑料薄片，如泡包裝。包裝或配藥裝置可與施用說明書一起提供。
本發(fā)明說明書中引用和討論了大量參考文獻，包括專利、專利申請和多種出版物。提供此類參考文獻的引用和/或討論僅為闡明本發(fā)明的說明書并不認為任何此種參考文獻為在此描述的本發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。本說明中所有引用和討論的參考文獻(包括GenBank或其他公共數(shù)據(jù)庫存儲的生物序列的參考)在此以相同程度全文引入為參考，就如同每一參考單獨引用為參考一樣。
實施例本發(fā)明也以下列實施例方式說明。然而本說明書中任何地方這些或其他實施例的使用僅用作說明并絕非限制本發(fā)明或任何例舉術(shù)語的范圍。同樣本發(fā)明不限于任何在此描述的特定優(yōu)選實施方案。一旦閱讀本說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員確實可明白本發(fā)明多種修改和改變并可不偏離其實質(zhì)和范圍進行改變。
實施例1OA標(biāo)志基因使用下列材料和方法進行下述實施例
從全長cDNA克隆制備質(zhì)粒DNA在96深孔板(Qiagen，Valencia，CA)上培養(yǎng)含有pCMVSport6載體中全長TYRO3 OA cDNA的菌液，每孔含有1.0mL Terrific肉湯(Sigma，St.Louis，MO)和氨芐青霉素(40μg/mL)。培養(yǎng)物最初在37℃300轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)24小時，再接種到新板中再培養(yǎng)過夜以確保所有孔中的細菌一致生長。根據(jù)生產(chǎn)商描述的標(biāo)準方案用Biorobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)從細菌中分離質(zhì)粒DNA。
全長cDNA克隆的GATEWAYTM轉(zhuǎn)移為在RT-PCR測定法中檢測TYRO3，使用GATEWAYTM平臺(Invitrogen，Carlsbad，CA)將TYRO3 cDNA從pCMVSport6載體轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
如下進行GATEWAY BP反應(yīng)。簡要地，1.0μL(100-120ng)質(zhì)粒DNA在冰上加入到微量滴定孔中，其中含有1μL(100-120ng)pDONR 201輸入載體(entry vector)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、1μL BP反應(yīng)緩沖液(Invitrogen，Carlsbad CA)、1μL tris-EDTA和1μL BP Clonase酶混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)。微量滴定板于25C孵育3小時。
將由0.25μL 0.75M NaCl、1.0μL(100-120ng)線性化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和1.5μL LR Clonase酶混合物(Invitrogen，Carlsbad，CA)組成的GATEWAY LR反應(yīng)混合物加入到BP反應(yīng)中。此研究中使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有雜合CMV/Moloney鼠白血病病毒5’LTR、Moloney鼠白血病病毒3’LTR和逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝ψ位點，并根據(jù)常規(guī)方法構(gòu)建。相同的載體也可商業(yè)購買(Clontech)。樣品徹底混合并于25℃再孵育2小時。加入蛋白酶K溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的十分之一體積(0.8μL，2mg/mL)并于37℃孵育10分鐘。
40μL最大效力的DH5α細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)在冰上等分加入平底96孔板(Qiagen，Valencia，CA)的孔中。然后在孔中加入1μL的LR反應(yīng)混合物并于冰上孵育30分鐘。細胞于42℃熱激30秒，置于冰上1-2分鐘，并在每孔中加入65μL S.O.C.培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。96孔板于37℃振蕩孵育1小時。含有具40μg/mL zeocin的LB瓊脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的微量滴定孔中加入35μL最終轉(zhuǎn)化混合物并于37C生長過夜。
單克隆接種到96孔板中的1mL Terrific肉湯/zeocin(40μg/mL)中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器中300轉(zhuǎn)/分生長過夜。根據(jù)生產(chǎn)商描述的標(biāo)準方案用Biorobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)分離質(zhì)粒DNA。
上清液的產(chǎn)生在含10％FBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)的無抗生素DMEM中轉(zhuǎn)染之前16-24小時將GP2-293包裝細胞《BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)接種(5×104個細胞/孔)到96孔PDL板(BD BiosciencesClontech，Palo Alto.CA)中。通過在96孔板中總體積25μL的OPTIMEM(Invitrogen，Calsbad，CA)中混合150ng GATEWAYTM構(gòu)建體和150ng包膜質(zhì)粒，使GATEWAYTM構(gòu)建體與包膜載體pVPack-VSV-G(Stratagene，La Jolla，CA)共轉(zhuǎn)染到包裝細胞中。在單獨的板上，25μLOPTIMEMTM與1μL Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合。此第二溶液室溫孵育5分鐘，然后混合兩種溶液。加入到細胞中前允許DNA-lipofectamine復(fù)合體形成20分鐘。轉(zhuǎn)染操作后16-24小時，用含抗生素的完全培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后的24小時和48小時收集含病毒上清液的培養(yǎng)物。
轉(zhuǎn)導(dǎo)進初級軟骨細胞初級軟骨細胞(從關(guān)節(jié)置換手術(shù)獲得的軟骨組織分離，MullenbergHospital，Plainfield，NJ)轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時在兩個96孔板中以1.1×104個細胞/孔接種。轉(zhuǎn)導(dǎo)時用100μL病毒上清液和100μL補充20mM HEPES和16μg/mL聚凝胺的完全培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基。細胞于32℃在吊桶式轉(zhuǎn)頭中1000g離心1.5小時。16-24小時后用新鮮培養(yǎng)基替代此培養(yǎng)基，細胞再孵育48小時。
RNA分離和RT-PCR根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用BioRobot 8000(Qiagen，Valencia，CA)和Qiagen RNeasy 96 Biorobot試劑從合并的兩個96孔板中分離總細胞RNA。依照Qiagen(Valencia，CA)發(fā)表的標(biāo)準方案使用柱上DNase I消化，以消除污染的基因組DNA。用High-CapacIty cDNA Archive kit(PE AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City CA)使用隨機引物在100μL反應(yīng)體積中合成第一鏈cDNA。在384孔板中于ABI Prism 7900HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)上進行實時PCR(RT-PCR)。使用Biomek FX移液器(liquid hardling robot)分開cDNA模板和PCR混合物。20μL反應(yīng)含有5μL cDNA、200nM正向和反向引物和SYBR Green PCR MasterMix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。默認的循環(huán)程序(95℃ 10分鐘和95℃、15秒的40個循環(huán)60℃ 1分鐘)之后是離解階段，其中產(chǎn)生解鏈曲線以確認PCR產(chǎn)物的特異性和不含引物二聚體。
下面表I說明了本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的代表性O(shè)A“標(biāo)志基因”。具體而言，此測定法中所用的每一“標(biāo)志基因”為軟骨細胞中OA相關(guān)的基因。也提供了每一標(biāo)志基因代表性核苷酸序列的GenBank登錄號。
RT-PCR實驗使用表I說明的引物(在默認參數(shù)和反應(yīng)條件下用Primer Express軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)設(shè)計)以擴增每一所列基因。此外，選擇基因GAPDH(GenBank登錄號AJ 005371)作為標(biāo)準化所有樣品的廣泛表達的“持家基因”。
表I.檢測OA標(biāo)志基因的RT-PCR引物
ROX染料(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)用作參比熒光(passivereference)以標(biāo)準化非PCR相關(guān)的熒光信號波動?；虮磉_的改變根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，cA)使用對照Ct方法計算，其中所述的對照Ct方法使用校準樣品，即所有其他樣品都與之比較的樣品。校準樣品的值標(biāo)準化為1.0以便所有其他樣品的表達水平按所測量的校準樣品表達水平的倍數(shù)定義。為進行此實施例描述的RT-PCR實驗，不含cDNA插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用作校準樣品。簡要地，與校準mRNA的數(shù)量相關(guān)的靶mRNA的數(shù)量根據(jù)公式2-ΔΔCT計算，其中Ct＝域值循環(huán)(擴增目標(biāo)的數(shù)量達到固定域值的循環(huán)#)。
細胞處理為優(yōu)化RT-PCR條件和確認此檢測中所選的標(biāo)志，關(guān)節(jié)置換術(shù)中獲得的來源于膝關(guān)節(jié)軟骨的人關(guān)節(jié)軟骨細胞用含10％FBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM培養(yǎng)基置于96孔板中(11,000個細胞/孔)。兩天后在無血清培養(yǎng)基中用IL-1(5ng/mL；Peprotech，UK，London)和OSM(50ng/mL)或PDGF(50ng/mL)或TGF-β(50ng/mL)處理細胞過夜。OSM、PDGF和TGF-β從R&D系統(tǒng)(Minneapolis，MN)購買。從這些細胞中分離RNA并使用上述方法通過RT-PCR評價。
ELISA細胞培養(yǎng)物上清液中MMP13和IL-6蛋白質(zhì)的水平使用Amersham(Piscataway，NJ)的人MMP13ELISA系統(tǒng)和R&D Systems(Minneapolis，MN)的人IL-6ELISA系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準方案測定。
結(jié)果為鑒定可用于治療OA的藥物靶，觀察候選基因過量表達的軟骨細胞對若干種已知OA遺傳標(biāo)記的影響。下面表Ⅱ概括了代表性O(shè)A標(biāo)志基因和相關(guān)OA特征。
表II.OA標(biāo)志基因
候選基因(在這種情況下為TYRO3)轉(zhuǎn)染到軟骨細胞中和評價表達對OA標(biāo)志基因的影響之前，確認使用特定OA標(biāo)志基因的引物和RT-PCR條件。這通過測定用多種已知誘導(dǎo)OA特征的化合物處理的軟骨細胞中OA標(biāo)志基因表達的改變來完成。
具體而言，用以上材料和方法中所述的多種已知能誘導(dǎo)軟骨細胞中OA特征的細胞因子和生長因子處理人關(guān)節(jié)軟骨細胞。見Tardif等，Arthritis Rheum.，第42卷，No.6，1147-1158頁(1999)和Smith等，ArthritisRheum.，第34卷，No.6，697-706頁(1991)。然后使用在此描述的引物進行RT-PCR以確定是否有一個或多個標(biāo)志基因表達的可檢測的變化。下面表III概括了通過用(i)IL-1和OSM、(ii)TGF-β和(iii)PDGF處理軟骨細胞介導(dǎo)的每一個標(biāo)志基因mRNA水平的代表性變化。表達水平表示為未處理軟骨細胞中測量的標(biāo)準化表達水平的倍數(shù)，即mRNA水平的“成倍變化”。
表III中的數(shù)據(jù)表明預(yù)期對已知誘導(dǎo)軟骨細胞中OA特征的處理產(chǎn)生反應(yīng)多種OA標(biāo)志基因的表達水平發(fā)生了改變。因此，這些數(shù)據(jù)驗證了所用引物和方法的有用性。
表III.處理的軟骨細胞中標(biāo)志基因表達的變化
為進一步驗證RT-PCR測定法，組成性活性的基因產(chǎn)物AKT/PKB(GenBank登錄號NPL-001907)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(如實施例1中所述的方法)在軟骨細胞中過量表達。已知此基因生化途徑的活化誘導(dǎo)軟骨細胞中的可聚蛋白聚糖-1和MMP-13。轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時和72小時后使用常規(guī)方法收獲細胞RNA，通過RT-PCR檢測MMP-13和可聚蛋白聚糖-1mRNA表達的變化。AKT/PKB過量表達引起可聚蛋白聚糖-1的12倍誘導(dǎo)和MMP-13的9倍誘導(dǎo)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2TYRO3
如果存在的話，為確定TYRO3在OA中具有的作用，全長TYRO3cDNA轉(zhuǎn)染到初級人關(guān)節(jié)軟骨細胞(HAC)中并通過RT-PCR分析引起的對這些細胞中OA遺傳標(biāo)記表達產(chǎn)生的影響，并與未轉(zhuǎn)化細胞中測量的那些標(biāo)志基因表達水平比較。
結(jié)果表明TYRO3基因的轉(zhuǎn)染有效地誘導(dǎo)至少四個OA標(biāo)志基因的表達，這表明TYRO3參與了OA的疾病過程(見下面表IV)。
表IV.TYRO3誘導(dǎo)多個OA遺傳標(biāo)記
為驗證TYRO3誘導(dǎo)這些“標(biāo)志基因”編碼的多肽提高的表達，通過ELISA測量用TYRO3 cDNA轉(zhuǎn)化的軟骨細胞中MMP-13蛋白質(zhì)水平。結(jié)果表明，如通過ELISA在細胞上清液中測量的，TYRO3過量表達確實引起MMP-13蛋白質(zhì)分泌的誘導(dǎo)(數(shù)據(jù)為顯示)。
實施例3GAS6此實施例描述了研究GAS6誘導(dǎo)軟骨細胞中OA標(biāo)志基因能力的實驗，所述的GAS6為與TYRO3亞家族成員結(jié)合并活化TYRO3亞家族成員的配體。
使用下列材料和方法進行下述實施例免疫組織化學(xué)分析正?；騉A人膝軟骨的完整厚度外植體在含5％FBS的DMEM中培養(yǎng)。軟骨用4％多聚甲醛固定并用石蠟包埋，以切成5微米的切片。組織切片放于載玻片上，在甲苯中去石蠟，在連續(xù)梯度的乙醇中水化然后在PBS和0.2％的過氧化物酶中洗滌。用正常血清或BSA封閉組織切片30分鐘之后，切片用2μg/mL GAS6的初級抗體(R&D Systems，Minneapolis，MN的山羊抗人重組抗體)或人TYRO3抗體(人TYRO3胞外結(jié)構(gòu)域的山羊抗體R&D Systems，Minneapolis，，MN)室溫孵育1-2小時或4℃過夜。此TYRO3抗體不與Axl或cMer交叉反應(yīng)。
在PBS中對切片進行3次5分鐘的洗滌之后，進行再次的10分鐘封閉反應(yīng)。切片用稀釋的生物素化二級抗體孵育30分鐘。在PBS中洗載玻片3次并用vectastain ABC-AP(Vector Labs，Burlingame，CA)或基于過氧化物酶的Elite ABC系統(tǒng)(Vector Labs，Burlingame，CA)孵育30分鐘。洗載玻片并用堿性磷酸酶底物溶液(Vector Labs，Burlingame，CA)或用3，3-二氨基聯(lián)苯(DAB)底物孵育切片4-20分鐘。用水漂洗載玻片，用稀釋的蘇木精或甲基綠復(fù)染，在梯度乙醇中或三次變化的1-丁醇、hemo-de中水化并用Refrax封固劑(mounting medium)(Anatech Ltd.，Battle Creek，MI)包埋(mounted)。通過用免疫前血清或免疫球蛋白替代初級抗體進行陰性對照。
重組GAS6的產(chǎn)生為產(chǎn)生GAS6蛋白質(zhì)，內(nèi)部克隆(in-house clone)樣品的全長GAS6DNA克隆使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)根據(jù)生產(chǎn)商推薦的方案轉(zhuǎn)染到293H細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。編碼GAS6多肽的優(yōu)選的GAS6 cDNA序列和蛋白質(zhì)序列可從GenBank分別以登錄號NM_00820(SEQ ID NO28)和NP_000811(SEQ ID NO29)獲得。GAS6蛋白質(zhì)由轉(zhuǎn)化細胞分泌到上清液中并在轉(zhuǎn)染后72小時收集。
軟骨細胞處理軟骨細胞置于24孔板中并用直線或連續(xù)稀釋的含重組GAS6蛋白質(zhì)的293H細胞上清液處理過夜。分離總RNA并根據(jù)上面實施例1中所述的RT-PCR方法進行RT-PCR以檢測可聚蛋白聚糖-1、MMP-13和iNOS的表達。另外，根據(jù)上述ELISA的材料和方法對蛋白質(zhì)MMP-13或IL-6進行ELISA。
結(jié)果TYRO3和GAS6在人關(guān)節(jié)疾病中過量表達使用免疫組織化學(xué)直接在正常和OA的人軟骨組織中檢測TYRO3和GAS6水平，以確定TYRO3和其配體GAS6是否在人關(guān)節(jié)疾病中確實過量表達。結(jié)果表明TYRO3和GAS6在軟骨中存在而不在正常人軟骨組織中存在。此外，培養(yǎng)的OA患者的中間和深層軟骨細胞表現(xiàn)TYRO3和GAS6增加的免疫染色(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)支持OA軟骨細胞在體內(nèi)由于(至少是)TYRO3和GAS6增加的表達而以自分泌形式活化的結(jié)論。因此，TYRO3和GAS6為體內(nèi)重要的OA介質(zhì)并可用作例如治療此類病癥的藥物靶。
GAS6誘導(dǎo)OA標(biāo)志基因和基因產(chǎn)物為確定內(nèi)源TYRO3是否可使用重組GAS6活化和此類活化是否引起OA標(biāo)記的標(biāo)志基因(蛋白酶和炎癥介質(zhì))的誘導(dǎo)，用上述表達GAS6的293H細胞上清液處理軟骨細胞。如通過RT-PCR所測定的，結(jié)果表明此種處理引起可聚蛋白聚糖-1、MMP-13和iNOS的誘導(dǎo)。相反，用空載體轉(zhuǎn)染的293H細胞上清液不誘導(dǎo)這些基因。ELISA實驗也表明用含GAS6的上清液處理軟骨細胞也誘導(dǎo)IL-6蛋白質(zhì)的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些實驗的結(jié)果表明用GAS6處理軟骨細胞不僅誘導(dǎo)OA標(biāo)志基因的表達，像TYRO3一樣，GAS6也在OA軟骨細胞中以提高的水平表達。
實施例4TYRO3的抑制降低OA標(biāo)志基因的表達此實施例描述了使用特異抑制軟骨細胞中TYRO3基因表達的RNA干擾的實驗。
下面的實施例使用下列材料和方法初級人關(guān)節(jié)軟骨細胞(從膝關(guān)節(jié)置換術(shù)獲得的軟骨組織中分離Mullenberg hospital，Plainsfield，NJ)在轉(zhuǎn)染前24小時以30-50％匯合(大約1.5×104個細胞/孔)接種。清洗細胞一次以去除痕量的抗生素并在每孔中加入350μL OPTIMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)。加入3μL 20μMsiRNA雙鏈體(Dharmacon，Lafayette，CO)到50μL Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在單獨的管中稀釋3μL Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad CA)到12μL Opti-MEM中并孵育9分鐘?；旌蟬iRNA雙鏈體溶液和oligofectamine溶液并再孵育20分鐘。調(diào)節(jié)余下溶液的體積到100μL并加入到軟骨細胞中，以使每孔中寡核苷酸雙鏈體的終濃度為133nM并且Oligofectamine濃度為0.67％。
細胞用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基孵育16小時，此時培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為溶于含抗生素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM(Invitrogen，Carsbad，CA)的10％熱滅活血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)。細胞再孵育48小時以沉默靶基因。然后細胞在含10％鐵并添加小牛血清(Omega Scientific，Tarzana，CA)的DMEM中用IL-1或TNF(分別為5ng/mL和50ng/mL)攻擊16小時。收集培養(yǎng)基并測定MMP-13的產(chǎn)生(MMP-13 ELISA系統(tǒng)，Amersham，Piscataway，NJ)。從細胞沉淀中分離RNA(Qiagen RNeasy，Valencia，CA)通過上述RT-PCR測量所選基因的信息水平。
使用了下列siRNA寡核苷酸序列
*來源于pGL3載體(Promega，Madison，WI)。
結(jié)果RNA干擾為可選擇性抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄后表達的方法，以便評估一個和多個特定基因在細胞內(nèi)的功能。在這些實驗中，化學(xué)合成的雙鏈21聚體被遞送到細胞中。這些寡聚物活化引起特定mRNA高度特異降解的正常細胞過程。
在此實施例中，siRNA如上所述施用給OA軟骨細胞以抑制TYRO3表達。如在使用TYRO3特異siRNA之后48小時測量TYRO3 mRNA水平一樣，通過RT-PCR測量IL-6和MMP-1的mRNA水平，已知兩個基因的表達在軟骨細胞中上調(diào)(見Vincenti等，Arthritis Res.，第4卷，No.3，157-164頁(2002)；Bau等，Arthritis Rheum.，第46卷，No.10，2648-2657頁；Flannery等，Matrix Biol.，第18卷，No.3，225-237頁(1999)和Mengshol等，Arthritis Rheum.，第43卷，No.4，801-811頁(2000))。結(jié)果表明IL-6和MMP-13的基礎(chǔ)表達水平都隨著TYRO3的表達有效降低。作為陰性對照OA軟骨細胞也用特異抑制螢光素酶基因的siRNA處理，其中所述的螢光素酶基因一般不在軟骨細胞中表達。同預(yù)期一樣，如RT-PCR確定的，施用此螢光素酶特異的siRNA不抑制TYRO3、IL-6或MMP-13。
還有其他實驗表明沉默TYRO3具有的對IL-1介導(dǎo)的OA軟骨細胞作用的影響。具體而言，如上所述用TYRO3特異的siRNA處理軟骨細胞然后用IL-1或TNF處理。通過RT-PCR測量MMP-13和IL-6的mRNA水平。數(shù)據(jù)表明TYRO3的siRNA抑制有效抑制通常由TNF和/或IL-1誘導(dǎo)的MMP-13和IL-6mRNA的表達。這些發(fā)現(xiàn)通過軟骨細胞中MMP-13蛋白質(zhì)的ELISA測量得到正證實。再次，TYRO3的抑制有效抑制通常由IL-1和/或TNF誘導(dǎo)的MMP-13蛋白質(zhì)分泌，這表明TYRO3信號可能在調(diào)節(jié)軟骨細胞中分解代謝酶的IL-1和/或TNF誘導(dǎo)中有重要作用。這暗示TYRO3信號在OA發(fā)病機理中的重要作用。
實施例5AXL、cMer和OA如上所解釋的，TYRO3與兩個其他受體酪氨酸激酶Axl和cMer具有相當(dāng)?shù)男蛄泻徒Y(jié)構(gòu)同源性，并且這3個基因包含受體酪氨酸激酶亞家族。因此，除了TYRO3之外，也預(yù)期Mer和Axl可用于本發(fā)明的組合物和方法中，例如用于診斷和/或治療、預(yù)防或減輕OA或作為本身可用于診斷和/或治療OA的化合物的藥物靶。
已知至少兩個Axl基因的剪接變體，其中一個(在此稱為“Axl變體2”或“Axlv2”)缺少一個或多個其他Axl剪接變體中存在的外顯子(外顯子10)。代表性的Axlv2核酸序列可從GenBank登錄號NM_001699獲得，在本文以SEQ ID NO30提供。由SEQ ID NO30的Axlv2核酸編碼的代表性Axlv2多肽包含可從GenBank登錄號NP_001690獲得的氨基酸序列并在本文中列于SEQ ID NO31。已知另一個Axl剪接變體，本文稱為“Axl變體1”或“Axlv1”。代表性的Axlv1核酸包含本文中列于SEQ ID NO32和GenBank登錄號NM_021913中的核苷酸序列。此核酸編碼包含GenBank登錄號NP_068713(SEQ ID NO33)中所列氨基酸序列的Axlv1多肽。
使用與前述用于TYRO3的相同方法的實驗中(見上面實施例)，軟骨細胞中Axlv1核酸(內(nèi)部cDNA文庫)增加的表達增加了Agg-1和MMP-13mRNA的表達，分別為約12和15倍。類似地，軟骨細胞中Axlv2核酸(內(nèi)部cDNA文庫)增加的表達增加了這些相同OA“標(biāo)志”基因的表達，即增加Agg-1和MMP-13的表達，分別為約3倍和8倍。
此外，Axl和cMer siRNA(Dharmacon，Lafayette，CO)(根據(jù)實施例4使用的方法遞送到軟骨細胞中)封閉了軟骨細胞中IL-1介導(dǎo)的可聚蛋白聚糖-1和MMP-13mRNA的誘導(dǎo)，這表明此受體酪氨酸激酶亞家族的全部3個成員可能在OA發(fā)病機理中具有重要作用。
像這樣，cMer和AXL(包括變體)可根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物以與TYRO3(和其變體)相同的方式用于本發(fā)明的方法和組合物中，因此認為此類用途為本發(fā)明的一部分。
序列表<110>C·S·庫馬爾<120>作用于酪氨酸激酶以診斷和治療骨關(guān)節(jié)炎的方法和組合物<130>3491/OM582USO<140>待獲得<141>Herewith<160>35<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>3949<212>DNA<213>人<400>1gcggtggcgc gggagcggcc ccggggaccc cgcgctgctg acggcggcga ccgcggccgg 60aggcgggcgc gggtctcgga ggcggtcgcc tcagcaccgc cccacgggcg gccccagccc120ctcccgcagc cctcctccct cccgctccct tcccgccgcc tcctccccgc cctcctccct180cctcgctcgc gggccgggcc cggcatggtg cggcgtcgcc gccgatggcg ctgaggcgga240gcatggggcg gccggggctc ccgccgctgc cgctgccgcc gccaccgcgg ctcgggctgc300tgctggcggc tctggcttct ctgctgctcc cggagtccgc cgccgcaggt ctgaagctca360tgggagcccc ggtgaagctg acagtgtctc aggggcagcc ggtgaagctc aactgcagtg420tggaggggat ggaggagcct gacatccagt gggtgaagga tggggctgtg gtccagaact480tggaccagtt gtacatccca gtcagcgagc agcactggat cggcttcctc agcctgaagt540cagtggagcg ctctgacgcc ggccggtact ggtgccaggt ggaggatggg ggtgaaaccg600agatctccca gccagtgtgg ctcacggtag aaggtgtgcc atttttcaca gtggagccaa660
aagatctggc agtgccaccc aatgcccctt tccaactgtc ttgtgaggct gtgggtcccc720ctgaacctgt taccattgtc tggtggagag gaactacgaa gatcggggga cccgctccct780ctccatctgt tttaaatgta acaggggtga cccagagcac catgttttcc tgtgaagctc840acaacctaaa aggcctggcc tcttctcgca cagccactgt tcaccttcaa gcactgcctg900cagccccctt caacatcacc gtgacaaagc tttccagcag caacgctagt gtggcctgga960tgccaggtgc tgatggccga gctctgctac agtcctgtac agttcaggtg acacaggccc1020caggaggctg ggaagtcctg gctgttgtgg tccctgtgcc cccctttacc tgcctgctcc1080gggacctggt gcctgccacc aactacagcc tcagggtgcg ctgtgccaat gccttggggc1140cctctcccta tgctgactgg gtgccctttc agaccaaggg tctagcccca gccagcgctc1200cccaaaacct ccatgccatc cgcacagatt caggcctcat cttggagtgg gaagaagtga1260tccccgaggc ccctttggaa ggccccctgg gaccctacaa actgtcctgg gttcaagaca1320atggaaccca ggatgagctg acagtggagg ggaccagggc caatttgaca ggctgggatc1380cccaaaagga cctgatcgta cgtgtgtgcg tctccaatgc agttggctgt ggaccctgga1440gtcagccact ggtggtctct tctcatgacc gtgcaggcca gcagggccct cctcacagcc1500gcacatcctg ggtacctgtg gtccttggtg tgctaacggc cctggtgacg gctgctgccc1560tggccctcat cctgcttcga aagagacgga aagagacgcg gtttgggcaa gcctttgaca1620gtgtcatggc ccggggagag ccagccgttc acttccgggc agcccggtcc ttcaatcgag1680aaaggcccga gcgcatcgag gccacattgg acagcttggg catcagcgat gaactaaagg1740aaaaactgga ggatgtgctc atcccagagc agcagttcac cctgggccgg atgttgggca1800aaggagagtt tggttcagtg cgggaggccc agctgaagca agaggatggc tcctttgtga1860aagtggctgt gaagatgctg aaagctgaca tcattgcctc aagcgacatt gaagagttcc1920tcagggaagc agcttgcatg aaggagtttg accatccaca cgtggccaaa cttgttgggg1980
taagcctccg gagcagggct aaaggccgtc tccccatccc catggtcatc ttgcccttca2040tgaagcatgg ggacctgcat gccttcctgc tcgcctcccg gattggggag aaccccttta2100acctacccct ccagaccctg atccggttca tggtggacat tgcctgcggc atggagtacc2160tgagctctcg gaacttcatc caccgagacc tggctgctcg gaattgcatg ctggcagagg2220acatgacagt gtgtgtggct gacttcggac tctcccggaa gatctacagt ggggactact2280atcgtcaagg ctgtgcctcc aaactgcctg tcaagtggct ggccctggag agcctggccg2340acaacctgta tactgtgcag agtgacgtgt gggcgttcgg ggtgaccatg tgggagatca2400tgacacgtgg gcagacgcca tatgctggca tcgaaaacgc tgagatttac aactacctca2460ttggcgggaa ccgcctgaaa cagcctccgg agtgtatgga ggacgtgtat gatctcatgt2520accagtgctg gagtgctgac cccaagcagc gcccgagctt tacttgtctg cgaatggaac2580tggagaacat cttgggccag ctgtctgtgc tatctgccag ccaggacccc ttatacatca2640acatcgagag agctgaggag cccactgcgg gaggcagcct ggagctacct ggcagggatc2700agccctacag tggggctggg gatggcagtg gcatgggggc agtgggtggc actcccagtg2760actgtcggta catactcacc cccggagggc tggctgagca gccagggcag gcagagcacc2820agccagagag tcccctcaat gagacacaga ggcttttgct gctgcagcaa gggctactgc2880cacacagtag ctgttagccc acaggcagag ggcatcgggg ccatttggcc ggctctggtg2940gccactgagc tggctgacta agccccgtct gaccccagcc cagacagcaa ggtgtggagg3000ctcctgtggt agtcctccca agctgtgctg ggaagcccgg actgaccaaa tcacccaatc3060ccagttcttc ctgcaaccac tctgtggcca gcctggcatc agtttaggcc ttggcttgat3120ggaagtgggc cagtcctggt tgtctgaacc caggcagctg gcaggagtgg ggtggttatg3180tttccatggt taccatgggt gtggatggca gtgtggggag ggcaggtcca gctctgtggg3240ccctaccctc ctgctgagct gcccctgctg cttaagtgca tgcattgagc tgcctccagc3300
ctggtggccc agctattacc acacttgggg tttaaatatc caggtgtgcc cctccaagtc3360acaaagagat gtccttgtaa tattcccttt taggtgaggg ttggtaaggg gttggtatct3420caggtctgaa tcttcaccat ctttctgatt ccgcaccctg cctacgccag gagaagttga3480ggggagcatg cttccctgca gctgaccggg tcacacaaag gcatgctgga gtacccagcc3540tatcaggtgc ccctcttcca aaggcagcgt gccgagccag caagaggaag gggtgctgtg3600aggcttgccc aggagcaagt gaggccggag aggagttcag gaacccttct ccatacccac3660aatctgagca cgctaccaaa tctcaaaata tcctaagact aacaaaggca gctgtgtctg3720agcccaaccc ttctaaacgg tgacctttag tgccaacttc ccctctaact ggacagcctc3780ttctgtccca agtctccaga gagaaatcag gcctgatgag ggggaattcc tggaacctgg3840accccagcct tggtggggga gcctctggaa tgcatggggc gggtcctagc tgttagggac3900atttccaagc tgttagttgc tgtttaaaat agaaataaaa ttgaagact 3949<210>2<211>890<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Gly Arg Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro1 5 10 15Leu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser20 25 30Leu Leu Leu Pro Glu Ser Ala Ala Ala Gly Leu Lys Leu Met Gly Ala35 40 45Pro Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys50 55 60
Ser Val Glu Gly Met Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly65 70 75 80Ala Val Val Gln Asn Leu Asp Gln Leu Tyr lle Pro Val Ser Glu Gln85 90 95His Trp Ile Gly Phe Leu Ser Leu Lys Ser Val Glu Arg Ser Asp Ala100 105 110Gly Arg Tyr Trp Cys Gln Val Glu Asp Gly Gly Glu Thr Glu Ile Ser115 120 125Gln Pro Val Trp Leu Thr Val Glu Gly Val Pro Phe Phe Thr Val Glu130 135 140Pro Lys Asp Leu Ala Val Pro Pro Asn Ala Pro Phe Gln Leu Ser Cys145 150 155 160Glu Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Val Thr Ile Val Trp Trp Arg Gly165 170 175Thr Thr Lys Ile Gly Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Val Leu Asn Val180 185 190Thr Gly Val Thr Gln Ser Thr Met Phe Ser Cys Glu Ala Hi s Asn Leu195 200 205Lys Gly Leu Ala Ser Ser Arg Thr Ala Thr Val Hi s Leu Gln Ala Leu210 215 220Pro Ala Ala Pro Phe Asn Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Ser Ser Asn225 230 235 240
Ala Ser Val Ala Trp Met Pro Gly Ala Asp Gly Arg Ala Leu Leu Gln245 250 255Ser Cys Thr Val Gln Val Thr Gln Ala Pro Gly Gly Trp Glu Val Leu260 265 270Ala Val Val Val Pro Val Pro Pro Phe Thr Cys Leu Leu Arg Asp Leu275 280 285Val Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Leu Arg Val Arg Cys Ala Asn Ala Leu290 295 300Gly Pro Ser Pro Tyr Ala Asp Trp Val Pro Phe Gln Thr Lys Gly Leu305 310 315 320Ala Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Leu His Ala Ile Arg Thr Asp Ser325 330 335Gly Leu Ile Leu Glu Trp Glu Glu Val Ile Pro Glu Ala Pro Leu Glu340 345 350Gly Pro Leu Gly Pro Tyr Lys Leu Ser Trp Val Gln Asp Asn Gly Thr355 360 365Gln Asp Glu Leu Thr Val Glu Gly Thr Arg Ala Asn Leu Thr Gly Trp370 375 380Asp Pro Gln Lys Asp Leu Ile Val Arg Val Cys Val Ser Asn Ala Val385 390 395 400Gly Cys Gly Pro Trp Ser Gln Pro Leu Val Val Ser Ser His Asp Arg405 410 415
Ala Gly Gln Gln Gly Pro Pro His Ser Arg Thr Ser Trp Val Pro Val420 425 430Val Leu Gly Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Ala Ala Ala Leu Ala Leu435 440 445Ile Leu Leu Arg LysArg Arg Lys Glu Thr Arg Phe Gly Gln Ala Phe450 455 460Asp Ser Val Met Ala Arg Gly Glu Pro Ala Val His Phe Arg Ala Ala465 470 475 480Arg Ser Phe Asn Arg Glu Arg Pro Glu Arg Ile Glu Ala Thr Leu Asp485 490 495Ser Leu Gly Ile Ser Asp Glu Leu Lys Glu Lys Leu Glu Asp Val Leu500 505 510Ile Pro Glu Gln Gln Phe Thr Leu Gly Arg Met Leu Gly Lys Gly Glu515 520 525Phe Gly Ser Val Arg Glu Ala Gln Leu Lys Gln Glu Asp Gly Ser Phe530 535 540Val Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ala Asp Ile Ile Ala Ser Ser545 550 555 560Asp Ile Glu Glu Phe Leu Arg Glu Ala Ala Cys Met Lys Glu Phe Asp565 570 575His Pro His Val Ala Lys Leu Val Gly Val Ser Leu Arg Ser Arg Ala580 585 590
Lys Gly Arg Leu Pro Ile Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His595 600 605Gly Asp Leu His Ala Phe Leu Leu Ala Ser Arg Ile Gly Glu Asn Pro610 615 620Phe Asn Leu Pro Leu Gln Thr Leu Ile Arg Phe Met Val Asp Ile Ala625 630 635 640Cys Gly Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Asn Phe Ile His Arg Asp Leu645 650 655Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Ala Glu Asp Met Thr Val Cys Val Ala660 665 670Asp Phe Gly Leu Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln675 680 685Gly Cys Ala Ser Lys Leu Pro Val Lys Trp Leu Ala Leu Glu Ser Leu690 695 700Ala Asp Asn Leu Tyr Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val705 710 715 720Thr Met Trp Glu Ile Met Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Ala Gly Ile725 730 735Glu Asn Ala Glu Ile Tyr Asn Tyr Leu Ile Gly Gly Asn Arg Leu Lys740 745 750Gln Pro Pro Glu Cys Met Glu Asp Val Tyr Asp Leu Met Tyr Gln Cys755 760 765
Trp Ser Ala Asp Pro Lys Gln Arg Pro Ser Phe Thr Cys Leu Arg Met770 775 780Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gly Gln Leu Ser Val Leu Ser Ala Ser Gln785 790 795 800Asp Pro Leu Tyr Ile Asn Ile Glu Arg Ala Glu Glu Pro Thr Ala Gly805 810 815Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Arg Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Gly820 825 830Asp Gly Ser Gly Met Gly Ala Val Gly Gly Thr Pro Ser Asp Cys Arg835 840 845Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gly Leu Ala Glu Gln Pro Gly Gln Ala Glu850 855 860His Gln Pro Glu Ser Pro Leu Asn Glu Thr Gln Arg Leu Leu Leu Leu365 870 875 880Gln Gln Gly Leu Leu Pro His Ser Ser Cys885 890<210>3<211>678<212>PRT<213>人<400>3Met Ala Pro Ser Leu Ser Pro Gly Pro Ala Ala Leu Arg Arg Ala Pro1 5 10 15
Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Glu Cys Ala Leu Ala Ala Leu20 25 30Leu Pro Ala Arg Glu Ala Thr Gln Phe Leu Arg Pro Arg Gln Arg Arg35 40 45Ala Phe Gln Val Phe Glu Glu Ala Lys Gln Gly His Leu Glu Arg Glu50 55 60Cys Val Glu Glu Leu Cys Ser Arg Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu65 70 75 80Asn Asp Pro Glu Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Arg Tyr Leu Asp Cys Ile85 90 95Asn Lys Tyr Gly Ser Pro Tyr Thr Lys Asn Ser Gly Phe Ala Thr Cys100 105 110Val Gln Asn Leu Pro Asp Gln Cys Thr Pro Asn Pro Cys Asp Arg Lys115 120 125Gly Thr Gln Ala Cys Gln Asp Leu Met Gly Asn Phe Phe Cys Leu Cys130 135 140Lys Ala Gly Trp Gly Gly Arg Leu Cys Asp Lys Asp Val Asn Glu Cys145 150 155 160Ser Gln Glu Asn Gly Gly Cys Leu Gln Ile Cys His Asn Lys Pro Gly165 170 175Ser Phe His Cys Ser Cys Hi s Ser Gly Phe Glu Leu Ser Ser Asp Gly180 185 190Arg Thr Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Ala Asp Ser Glu Ala Cys Gly195 200 205Glu Ala Arg Cys Lys Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Leu Cys Asp210 215 220Glu Gly Phe Ala Tyr Ser Ser Gln Glu Lys Ala Cys Arg Asp Val Asp225 230 235 240Glu Cys Leu Gln Gly Arg Cys Glu Gln Val Cys Val Asn Ser Pro Gly245 250 255Ser Tyr Thr Cys His Cys Asp Gly Arg Gly Gly Leu Lys Leu Ser Gln260 265 270Asp Met Asp Thr Cys Glu Asp Ile Leu Pro Cys Val Pro Phe Ser Val275 280 285Ala Lys Ser Val Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Arg Met Phe Ser Gly Thr290 295 300Pro Val Ile Arg Leu Arg Phe Lys Arg Leu Gln Pro Thr Arg Leu Val305 310 315 320Ala Glu Phe Asp Phe Arg Thr Phe Asp Pro Glu Gly Ile Leu Leu Phe325 330 335Ala Gly Gly His Gln Asp Ser Thr Trp Ile Val Leu Ala Leu Arg Ala340 345 350Gly Arg Leu Glu Leu Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Val Gly Arg Val Thr355 360 365
Ser Ser Gly Pro Val Ile Asn His Gly Met Trp Gln Thr Ile Ser Val370 375 380Glu Glu Leu Ala Arg Asn Leu Val Ile Lys Val Asn Arg Asp Ala Val385 390 395 400Met Lys Ile Ala Val Ala Gly Asp Leu Phe Gln Pro Glu Arg Gly Leu405 410 415Tyr His Leu Asn Leu Thr Val Gly Gly Ile Pro Phe His Glu Lys Asp420 425 430Leu Val Gln Pro Ile Asn Pro Arg Leu Asp Gly Cys Met Arg Ser Trp435 440 445Asn Trp Leu Asn Gly Glu Asp Thr Thr Ile Gln Glu Thr Val Lys Val450 455 460Asn Thr Arg Met Gln Cys Phe Ser Val Thr Glu Arg Gly Ser Phe Tyr465 470 475 480Pro Gly Ser Gly Phe Ala Phe Tyr Ser Leu Asp Tyr Met Arg Thr Pro485 490 495Leu Asp Val Gly Thr Glu Ser Thr Trp Glu Val Glu Val Val Ala His500 505 510Ile Arg Pro Ala Ala Asp Thr Gly Val Leu Phe Ala Leu Trp Ala Pro515 520 525Asp Leu Arg Ala Val Pro Leu Ser Val Ala Leu Val Asp Tyr His Ser530 535 540
Thr Lys Lys Leu Lys Lys Gln Leu Val Val Leu Ala Val Glu His Thr545 550 555 560Ala Leu Ala Leu Met Glu Ile Lys Val Cys Asp Gly Gln Glu His Val565 570 575Val Thr Val Ser Leu Arg Asp Gly Glu Ala Thr Leu Glu Val Asp Gly580 585 590Thr Arg Gly Gln Ser Glu Val Ser Ala Ala Gln Leu Gln Glu Arg Leu595 600 605Ala Val Leu Glu Arg His Leu Arg Ser Pro Val Leu Thr Phe Ala Gly610 615 620Gly Leu Pro Asp Val Pro Val Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Tyr625 630 635 640Arg Gly Cys Met Thr Leu Glu Val Asn Arg Arg Leu Leu Asp Leu Asp645 650 655Glu Ala Ala Tyr Lys His Ser Asp Ile Thr Ala His Ser Cys Pro Pro660 665 670Val Glu Pro Ala Ala Ala675<210>4<211>2461<212>DNA<213>人<400>4ccgcagccgc cgccgccgcc gccgccgcga tgtgaccttc agggccgcca ggacgggatg60
accggagcct ccgccccgcg gcgcccgctc gcctcggcct cccgggcgct ctgaccgcgc 120gtccccggcc cgccatggcc ccttcgctct cgcccgggcc cgccgccctg cgccgcgcgc 180cgcagctgct gctgctgctg ctggccgcgg agtgcgcgct tgccgcgctg ttgccggcgc 240gcgaggccac gcagttcctg cggcccaggc agcgccgcgc ctttcaggtc ttcgaggagg 300ccaagcaggg ccacctggag agggagtgcg tggaggagct gtgcagccgc gaggaggcgc 360gggaggtgtt cgagaacgac cccgagacgg attattttta cccaagatac ttagactgca 420tcaacaagta tgggtctccg tacaccaaaa actcaggctt cgccacctgc gtgcaaaacc 480tgcctgacca gtgcacgccc aacccctgcg ataggaaggg gacccaagcc tgccaggacc 540tcatgggcaa cttcttctgc ctgtgtaaag ctggctgggg gggccggctc tgcgacaaag 600atgtcaacga atgcagccag gagaacgggg gctgcctcca gatctgccac aacaagccgg 660gtagcttcca ctgttcctgc cacagcggct tcgagctctc ctctgatggc aggacctgcc 720aagacataga cgagtgcgca gactcggagg cctgcgggga ggcgcgctgc aagaacctgc 780ccggctccta ctcctgcctc tgtgacgagg gctttgcgta cagctcccag gagaaggctt 840gccgagatgt ggacgagtgt ctgcagggcc gctgtgagca ggtctgcgtg aactccccag 900ggagctacac ctgccactgt gacgggcgtg ggggcctcaa gctgtcccag gacatggaca 960cctgtgagga catcttgccg tgcgtgccct tcagcgtggc caagagtgtg aagtccttgt1020acctgggccg gatgttcagt gggacccccg tgatccgact gcgcttcaag aggctgcagc1080ccaccaggct ggtagctgag tttgacttcc ggacctttga ccccgagggc atcctcctct1140ttgccggagg ccaccaggac agcacctgga tcgtgctggc cctgagagcc ggccggctgg1200agctgcagct gcgctacaac ggtgtcggcc gtgtcaccag cagcggcccg gtcatcaacc1260atggcatgtg gcagacaatc tctgttgagg agctggcgcg gaatctggtc atcaaggtca1320acagggatgc tgtcatgaaa atcgcggtgg ccggggactt gttccaaccg gagcgaggac1380
tgtatcatct gaacctgacc gtgggaggta ttcccttcca tgagaaggac ctcgtgcagc1440ctataaaccc tcgtctggat ggctgcatga ggagctggaa ctggctgaac ggagaagaca1500ccaccatcca ggaaacggtg aaagtgaaca cgaggatgca gtgcttctcg gtgacggaga1560gaggctcttt ctaccccggg agcggcttcg ccttctacag cctggactac atgcggaccc1620ctctggacgt cgggactgaa tcaacctggg aagtagaagt cgtggctcac atccgcccag1680ccgcagacac aggcgtgctg tttgcgctct gggcccccga cctccgtgcc gtgcctctct1740ctgtggcact ggtagactat cactccacga agaaactcaa gaagcagctg gtggtcctgg1800ccgtggagca tacggccttg gccctaatgg agatcaaggt ctgcgacggc caagagcacg1860tggtcaccgt ctcgctgagg gacggtgagg ccaccctgga ggtggacggc accaggggcc1920agagcgaggt gagcgccgcg cagctgcagg agaggctggc cgtgctcgag aggcacctgc1980ggagccccgt gctcaccttt gctggcggcc tgccagatgt gccggtgact tcagcgccag2040tcaccgcgtt ctaccgcggc tgcatgacac tggaggtcaa ccggaggctg ctggacctgg2100acgaggcggc gtacaagcac agcgacatca cggcccactc ctgccccccc gtggagcccg2160ccgcagccta ggcccccacg ggacgcggca ggcttctcag tctctgtccg agacagccgg2220gaggagcctg ggggctcctc accacgtggg gccatgctga gagctgggct ttcctctgtg2280accatcccgg cctgtaacat atctgtaaat agtgagatgg acttggggcc tctgacgccg2340cgcactcagc cgtgggcccg ggcgcgggga ggccggcgca gcgcagagcg ggctcgaaga2400aaataattct ctattatttt tattaccaag cgcttctttc tgactctaaa atatggaaaa2460t2461<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>5tttccctggc aaggactatg a 21<210>6<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>6aatggcgtga gtcgggc17<210>7<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>7tgatctcttt tggaattaag gagcat 26<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>8atgggcatct cctccataat ttg23
<210>9<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>9aaattgctgg cagggttgc 19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>10tttctgtact gcgggtggaa c 21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>11gcaaaccttc aaggcagcc 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>12tgctgtttgc ctcggacat 19<210>13<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>13acgctgctcg tcgccg 16<210>14<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>14gccagcctcc tggacatcct 20<210>15<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>15acccaacacc aagacacagt tct 23<210>16<211>33<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>PCR引物<400>16tcttactgct atacctttac tctttatggt gta 33<210>17<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>17cagccgcttc acctacagc 19<210>18<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>18ttttgtattc aatcactgtc ttgcc 25<210>19<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>19gccagcctcc tggacatcc t20
<210>20<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>20agtcctttca ggctagctgc atc 23<210>21<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>21tcgaggacag cgaggcc17<210>22<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>22tcgagggtgt agcgtgtaga ga 22<210>23<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>23atggggaagg tgaaggtcg 19<210>24<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>24taaaagcagc cctggtgacc 20<210>25<211>21<212>RNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>25aaccaagugc cacaaaggaa c21<210>26<211>21<212>RNA<213>人工的<220>
<223>siRNA<400>26aaacaucgag agagcugagg a21<210>27<211>21<212>RNA<213>人工的
<220>
<223>siRNA<400>27aagugcgcug cuggugccaa c21<210>28<211>3309<212>DNA<213>人<400>28ctgcaggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggcg cagcacggct cagaccgagg 60cgcacaggct cgcagctccg ggcgcctagc gcccggtccc cgccgcgacg cgccaccgtc120cctgccggcg cctccgcgcc ttcgaaatga gggtcctggg tgggcgctgc ggggcgccgc180tggcgtgtct cctcctagtg cttcccgtct cagaggcaaa ccttctgtca aagcaacagg240cttcacaagt cctggttagg aagcgtcgtg caaattcttt acttgaagaa accaaacagg300gtaatcttga aagagaatgc atcgaagaac tgtgcaataa agaagaagcc agggaggtct360ttgaaaatga cccggaaacg gattattttt atccaaaata cttagtttgt cttcgctctt420ttcaaactgg gttattcact gctgcacgtc agtcaactaa tgcttatcct gacctaagaa480gctgtgtcaa tgccattcca gaccagtgta gtcctctgcc atgcaatgaa gatggatata540tgagctgcaa agatggaaaa gcttctttta cttgcacttg taaaccaggt tggcaaggag600aaaagtgtga atttgacata aatgaatgca aagatccctc aaatataaat ggaggttgca660gtcaaatttg tgataataca cctggaagtt accactgttc ctgtaaaaat ggttttgtta720tgctttcaaa taagaaagat tgtaaagatg tggatgaatg ctctttgaag ccaagcattt780gtggcacagc tgtgtgcaag aacatcccag gagattttga atgtgaatgc cccgaaggct840acagatataa tctcaaatca aagtcttgtg aagatataga tgaatgctct gagaacatgt900
gtgctcagct ttgtgtcaat taccctggag gttacacttg ctattgtgat gggaagaaag 960gattcaaact tgcccaagat cagaagagtt gtgaggttgt ttcagtgtgc cttcccttga1020accttgacac aaagtatgaa ttactttact tggcggagca gtttgcaggg gttgttttat1080atttaaaatt tcgtttgcca gaaatcagca gattttcagc agaatttgat ttccggacat1140atgattcaga aggcgtgata ctgtacgcag aatctatcga tcactcagcg tggctcctga1200ttgcacttcg tggtggaaag attgaagttc agcttaagaa tgaacataca tccaaaatca1260caactggagg tgatgttatt aataatggtc tatggaatat ggtgtctgtg gaagaattag1320aacatagtat tagcattaaa atagctaaag aagctgtgat ggatataaat aaacctggac1380ccctttttaa gccggaaaat ggattgctgg aaaccaaagt atactttgca ggattccctc1440ggaaagtgga aagtgaactc attaaaccga ttaaccctcg tctagatgga tgtatacgaa1500gctggaattt gatgaagcaa ggagcttctg gaataaagga aattattcaa gaaaaacaaa1560ataagcattg cctggttact gtggagaagg gctcctacta tcctggttct ggaattgctc1620aatttcacat agattataat aatgtatcca gtgctgaggg ttggcatgta aatgtgacct1680tgaatattcg tccatccacg ggcactggtg ttatgcttgc cttggtttct ggtaacaaca1740cagtgccctt tgctgtgtcc ttggtggact ccacctctga aaaatcacag gatattctgt1800tatctgttga aaatactgta atatatcgga tacaggccct aagtctatgt tccgatcaac1860aatctcatct ggaatttaga gtcaacagaa acaatctgga gttgtcgaca ccacttaaaa1920tagaaaccat ctcccatgaa gaccttcaaa gacaacttgc cgtcttggac aaagcaatga1980aagcaaaagt ggccacatac ctgggtggcc ttccagatgt tccattcagt gccacaccag2040tgaatgcctt ttataatggc tgcatggaag tgaatattaa tggtgtacag ttggatctgg2100atgaagccat ttctaaacat aatgatatta gagctcactc atgtccatca gtttggaaaa2160agacaaagaa ttcttaaggc atcttttctc tgcttataat accttttcct tgtgtgtaat2220
tatacttatg tttcaataac agctgaaggg ttttatttac aatgtgcagt ctttgattat2280tttgtggtcc tttcctggga tttttaaaag gtcctttgtc aaggaaaaaa attctgttgt2340gatataaatc acagtaaaga aattcttact tctcttgcta tctaagaata gtgaaaaata2400acaattttaa atttgaattt ttttcctaca aatgacagtt tcaatttttg tttgtaaaac2460taaattttaa ttttatcatc atgaactagt gtctaaatac ctatgttttt ttcagaaagc2520aaggaagtaa actcaaacaa aagtgcgtgt aattaaatac tattaatcat aggcagatac2580tattttgttt atgtttttgt ttttttcctg atgaaggcag aagagatggt ggtctattaa2640atatgaattg aatggagggt cctaatgcct tatttcaaaa caattcctca gggggaccag2700ctttggcttc atctttctct tgtgtggctt cacatttaaa ccagtatctt tattgaatta2760gaaaacaagt gggacatatt ttcctgagag cagcacagga atcttcttct tggcagctgc2820agtctgtcag gatgagatat cagattaggt tggataggtg gggaaatctg aagtgggtac2880attttttaaa ttttgctgtg tgggtcacac aaggtctaca ttacaaaaga cagaattcag2940ggatggaaag gagaatgaac aaatgtggga gttcatagtt ttccttgaat ccaactttta3000attaccagag taagttgcca aaatgtgatt gttgaagtac aaaaggaact atgaaaacca3060gaacaaattt taacaaaagg acaaccacag agggatatag tgaatatcgt atcattgtaa3120tcaaagaagt aaggaggtaa gattgccacg tgcctgctgg tactgtgatg catttcaagt3180ggcagtttta tcacgtttga atctaccatt catagccaga tgtgtatcag atgtttcact3240gacagttttt aacaataaat tcttttcact gtattttata tcacttataa taaatcggtg3300tataatttt3309<210>29<211>676<212>PRT<213>人
<400>29Met Arg Val Leu G1y Gly Arg Cys Gly Ala Pro Leu Ala Cys Leu Leu1 5 10 15Leu Val Leu Pro Val Ser Glu Ala Asn Leu Leu Ser Lys Gln Gln Ala20 25 30Ser Gln Val Leu Val Arg Lys Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu35 40 45Thr Lys Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Leu Cys Asn50 55 60Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Asp Pro Glu Thr Asp Tyr65 70 75 80Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val Cys Leu Arg Ser Phe Gln Thr Gly Leu85 90 95Phe Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn Ala Tyr Pro Asp Leu Arg Ser100 105 110Cys Val Asn Ala Ile Pro Asp Gln Cys Ser Pro Leu Pro Cys Asn Glu115 120 125Asp Gly Tyr Met Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ala Ser Phe Thr Cys Thr130 135 140Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly Glu Lys Cys Glu Phe Asp Ile Asn Glu145 150 155 160Cys Lys Asp Pro Ser Asn Ile Asn Gly Gly Cys Ser Gln Ile Cys Asp165 170 175
Asn Thr Pro Gly Ser Tyr His Cys Ser Cys Lys Asn Gly Phe Val Met180 185 190Leu Ser Asn Lys Lys Asp Cys Lys Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Lys195 200 205Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe210 215 220Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser225 230 235 240Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys245 250 255Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly260 265 270Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser Cys Glu Val Val Ser Val Cys275 280 285Leu Pro Leu Asn Leu Asp Thr Lys Tyr Glu Leu Leu Tyr Leu Ala Glu290 295 300Gln Phe Ala Gly Val Val Leu Tyr Leu Lys Phe Arg Leu Pro Glu Ile305 310 315 320Ser Arg Phe Ser Ala Glu Phe Asp Phe Arg Thr Tyr Asp Ser Glu Gly325 330 335Val Ile Leu Tyr Ala Glu Ser Ile Asp His Ser Ala Trp Leu Leu Ile340 345 350
Ala Leu Arg Gly Gly Lys Ile Glu Val Gln Leu Lys Asn Glu His Thr355 360 365Ser Lys Ile Thr Thr Gly Gly Asp Val Ile Asn Asn Gly Leu Trp Asn370 375 380Met Val Ser Val Glu Glu Leu Glu His Ser Ile Ser Ile Lys Ile Ala385 390 395 400Lys Glu Ala Val Met Asp Ile Asn Lys Pro Gly Pro Leu Phe Lys Pro405 410 415Glu Asn Gly Leu Leu Glu Thr Lys Val Tyr Phe Ala Gly Phe Pro Arg420 425 430Lys Val Glu Ser Glu Leu Ile Lys Pro Ile Asn Pro Arg Leu Asp Gly435 440 445Cys Ile Arg Ser Trp Asn Leu Met Lys Gln Gly Ala Ser Gly Ile Lys450 455 460Glu Ile Ile Gln Glu Lys Gln Asn Lys His Cys Leu Val Thr Val Glu465 470 475 480Lys Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Ser Gly Ile Ala Gln Phe His Ile Asp485 490 495Tyr Asn Asn Val Ser Ser Ala Glu Gly Trp His Val Asn Val Thr Leu500 505 5l0Asn Ile Arg Pro Ser Thr Gly Thr Gly Val Met Leu Ala Leu Val Ser515 520 525
Gly Asn Asn Thr Val Pro Phe Ala Val Ser Leu Val Asp Ser Thr Ser530 535 540Glu Lys Ser Gln Asp Ile Leu Leu Ser Val Glu Asn Thr Val Ile Tyr545 550 555 560Arg Ile Gln Ala Leu Ser Leu Cys Ser Asp Gln Gln Ser His Leu Glu565 570 575Phe Arg Val Asn Arg Asn Asn Leu Glu Leu Ser Thr Pro Leu Lys Ile580 585 590Glu Thr Ile Ser His Glu Asp Leu Gln Arg Gln Leu Ala Val Leu Asp595 600 605Lys Ala Met Lys Ala Lys Val Ala Thr Tyr Leu Gly Gly Leu Pro Asp610 615 620Val Pro Phe Ser Ala Thr Pro Val Asn Ala Phe Tyr Asn Gly Cys Met625 630 635 640Glu Val Asn Ile Asn Gly Val Gln Leu Asp Leu Asp Glu Ala Ile Ser645 650 655Lys His Asn Asp Ile Arg Ala His Ser Cys Pro Ser Val Trp Lys Lys660 665 670Thr Lys Asn Ser675<210>30<211>4987
<212>DNA<213>人<400>30gagtggagtt ctggaggaat gtttaccaga cacagagccc agagggacag cgcccagagc 60ccagatagag agacacggcc tcactggctc agcaccaggg tccccttccc cctcctcagc 120tccctccctg gcccctttaa gaaagagctg atcctctcct ctcttgagtt aacccctgat 180tgtccaggtg gcccctggct ctggcctggt gggcggaggc aaagggggag ccaggggcgg 240agaaagggtt gcccaagtct gggagtgagg gaaggaggca ggggtgctga gaaggcggct 300gctgggcaga gccggtggca agggcctccc ctgccgctgt gccaggcagg cagtgccaaa 360tccggggagc ctggagctgg ggggagggcc ggggacagcc cggccctgcc ccctcccccg 420ctgggagccc agcaacttct gaggaaagtt tggcacccat ggcgtggcgg tgccccagga 480tgggcagggt cccgctggcc tggtgcttgg cgctgtgcgg ctgggcgtgc atggccccca 540ggggcacgca ggctgaagaa agtcccttcg tgggcaaccc agggaatatc acaggtgccc 600ggggactcac gggcaccctt cggtgtcagc tccaggttca gggagagccc cccgaggtac 660attggcttcg ggatggacag atcctggagc tcgcggacag cacccagacc caggtgcccc 720tgggtgagga tgaacaggat gactggatag tggtcagcca gctcagaatc acctccctgc 780agctttccga cacgggacag taccagtgtt tggtgtttct gggacatcag accttcgtgt 840cccagcctgg ctatgttggg ctggagggct tgccttactt cctggaggag cccgaagaca 900ggactgtggc cgccaacacc cccttcaacc tgagctgcca agctcaggga cccccagagc 960ccgtggacct actctggctc caggatgctg tccccctggc cacggctcca ggtcacggcc1020cccagcgcag cctgcatgtt ccagggctga acaagacatc ctctttctcc tgcgaagccc1080ataacgccaa gggggtcacc acatcccgca cagccaccat cacagtgctc ccccagcagc1140cccgtaacct ccacctggtc tcccgccaac ccacggagct ggaggtggct tggactccag1200
gcctgagcgg catctacccc ctgacccact gcaccctgca ggctgtgctg tcagacgatg1260ggatgggcat ccaggcggga gaaccagacc ccccagagga gcccctcacc tcgcaagcat1320ccgtgccccc ccatcagctt cggctaggca gcctccatcc tcacacccct tatcacatcc1380gcgtggcatg caccagcagc cagggcccct catcctggac ccactggctt cctgtggaga1440cgccggaggg agtgcccctg ggcccccctg agaacattag tgctacgcgg aatgggagcc1500aggccttcgt gcattggcaa gagccccggg cgcccctgca gggtaccctg ttagggtacc1560ggctggcgta tcaaggccag gacaccccag aggtgctaat ggacataggg ctaaggcaag1620aggtgaccct ggagctgcag ggggacgggt ctgtgtccaa tctgacagtg tgtgtggcag1680cctacactgc tgctggggat ggaccctgga gcctcccagt acccctggag gcctggcgcc1740cagtgaagga accttcaact cctgccttct cgtggccctg gtggtatgta ctgctaggag1800cagtcgtggc cgctgcctgt gtcctcatct tggctctctt ccttgtccac cggcgaaaga1860aggagacccg ttatggagaa gtgtttgaac caacagtgga aagaggtgaa ctggtagtca1920ggtaccgcgt gcgcaagtcc tacagtcgtc ggaccactga agctaccttg aacagcctgg1980gcatcagtga agagctgaag gagaagctgc gggatgtgat ggtggaccgg cacaaggtgg2040ccctggggaa gactctggga gagggagagt ttggagctgt gatggaaggc cagctcaacc2100aggacgactc catcctcaag gtggctgtga agacgatgaa gattgccatc tgcacgaggt2160cagagctgga ggatttcctg agtgaagcgg tctgcatgaa ggaatttgac catcccaacg2220tcatgaggct catcggtgtc tgtttccagg gttctgaacg agagagcttc ccagcacctg2280tggtcatctt acctttcatg aaacatggag acctacacag cttcctcctc tattcccggc2340tcggggacca gccagtgtac ctgcccactc agatgctagt gaagttcatg gcagacatcg2400ccagtggcat ggagtatctg agtaccaaga gattcataca ccgggacctg gcggccagga2460actgcatgct gaatgagaac atgtccgtgt gtgtggcgga cttcgggctc tccaagaaga2520
tctacaatgg ggactactac cgccagggac gtatcgccaa gatgccagtc aagtggattg2580ccattgagag tctagctgac cgtgtctaca ccagcaagag cgatgtgtgg tccttcgggg2640tgacaatgtg ggagattgcc acaagaggcc aaaccccata tccgggcgtg gagaacagcg2700agatttatga ctatctgcgc cagggaaatc gcctgaagca gcctgcggac tgtctggatg2760gactgtatgc cttgatgtcg cggtgctggg agctaaatcc ccaggaccgg ccaagtttta2820cagagctgcg ggaagatttg gagaacacac tgaaggcctt gcctcctgcc caggagcctg2880acgaaatcct ctatgtcaac atggatgagg gtggaggtta tcctgaaccc cctggagctg2940caggaggagc tgacccccca acccagccag accctaagga ttcctgtagc tgcctcactg3000cggctgaggt ccatcctgct ggacgctatg tcctctgccc ttccacaacc cctagccccg3060ctcagcctgc tgataggggc tccccagcag ccccagggca ggaggatggt gcctgagaca3120accctccacc tggtactccc tctcaggatc caagctaagc actgccactg gggaaaactc3180caccttccca ctttcccacc ccacgcctta tccccacttg cagccctgtc ttcctaccta3240tcccacctcc atcccagaca ggtccctccc cttctctgtg cagtagcatc accttgaaag3300cagtagcatc accatctgta aaaggaaggg gttggattgc aatatctgaa gccctcccag3360gtgttaacat tccaagactc tagagtccaa ggtttaaaga gtctagattc aaaggttcta3420ggtttcaaag atgctgtgag tctttggttc taaggacctg aaattccaaa gtctctaatt3480ctattaaagt gctaaggttc taaggcctac tttttttttt tttttttttt tttttttttt3540ttttgcgata gagtctcact gtgtcaccca ggctggagtg cagtggtgca atctcgcctc3600actgcaacct tcacctaccg agttcaagtg attttcctgc cttggcctcc caagtagctg3660ggattacagg tgtgtgccac cacacccggc taatttttat atttttagta gagacagggt3720ttcaccatgt tggccaggct ggtctaaaac tcctgacctc aagtgatctg cccacctcag3780cctcccaaag tgctgagatt acaggcatga gccactgcac tcaaccttaa gacctactgt3840
tctaaagctc tgacattatg tggttttaga ttttctggtt ctaacatttt tgataaagcc3900tcaaggtttt aggttctaaa gttctaagat tctgatttta ggagctaagg ctctatgagt3960ctagatgttt attcttctag agttcagagt ccttaaaatg taagattata gattctaaag4020attctatagt tctagacatg gaggttctaa ggcctaggat tctaaaatgt gatgttctaa4080ggctctgaga gtctagattc tctggctgta aggctctaga tcataaggct tcaaaatgtt4140atcttctcaa gttctaagat tctaatgatg atcaattata gtttctgagg ctttatgata4200atagattctc ttgtataaga tcctagatcc taagggtcga aagctctaga atctgcaatt4260caaaagttcc aagagtctaa agatggagtt tctaaggtcc ggtgttctaa gatgtgatat4320tctaagactt actctaagat cttagattct ctgtgtctaa gattctagat cagatgctcc4380aagattctag atgattaaat aagattctaa cggtctgttc tgtttcaagg cactctagat4440tccattggtc caagattccg gatcctaagc atctaagtta taagactctc acactcagtt4500gtgactaact agacaccaaa gttctaataa tttctaatgt tggacacctt taggttcttt4560gctgcattct gcctctctag gaccatggtt aagagtccaa gaatccacat ttctaaaatc4620ttatagttct aggcactgta gttctaagac tcaaatgttc taagtttcta agattctaaa4680ggtccacagg tctagactat taggtgcaat ttcaaggttc taaccctata ctgtagtatt4740ctttggggtg cccctctcct tcttagctat cattgcttcc tcctccccaa ctgtgggggt4800gtgccccctt caagcctgtg caatgcatta gggatgcctc ctttcccgca ggggatggac4860gatctcccac ctttcgggcc atgttgcccc cgtgagccaa tccctcacct tctgagtaca4920gagtgtggac tctggtgcct ccagaggggc tcaggtcaca taaaactttg tatatcaacg4980aaaaaaa 4987<210>31<211>885<212>PRT
<213>人<400>31Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys1 5 10 15Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala20 25 30Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg35 40 45Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro50 55 60Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp65 70 75 80Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp85 90 95Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr100 105 110Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser115 120 125Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu130 135 140Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp165 170 175Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu180 185 190His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His195 200 205Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu210 215 220Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu225 230 235 240Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr245 250 255His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln260 265 270Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser275 280 285Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro290 295 300Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp305 310 315 320Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro325 330 335
Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His340 345 350Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg355 360 365Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly370 375 380Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser385 390 395 400Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro405 410 415Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Val Lys Glu Pro420 425 430Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala435 440 445Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His450 455 460Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val465 470 475 480Glu Arg Gly Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser485 490 495Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu500 505 510
Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala515 520 525Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly530 535 540Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met545 550 555 560Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu565 570 575Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile580 585 590Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val595 600 605Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu610 615 620Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu625 630 635 640Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr645 650 655Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn660 665 670Glu Asn Met Ser VaI Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile675 680 685
Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val690 695 700Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys705 710 715 720Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg725 730 735Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr740 745 750Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly755 760 765Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg770 775 780Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala785 790 795 800Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp805 810 815Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp820 825 830Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala835 840 845Ala Glu Val His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr850 855 860
Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly865 870 875 880Gln Glu Asp Gly Ala885<210>32<211>5014<212>DNA<213>人<400>32gagtggagtt ctggaggaat gtttaccaga cacagagccc agagggacag cgcccagagc 60ccagatagag agacacggcc tcactggctc agcaccaggg tccccttccc cctcctcagc120tccctccctg gcccctttaa gaaagagctg atcctctcct ctcttgagtt aacccctgat180tgtccaggtg gcccctggct ctggcctggt gggcggaggc aaagggggag ccaggggcgg240agaaagggtt gcccaagtct gggagtgagg gaaggaggca ggggtgctga gaaggcggct300gctgggcaga gccggtggca agggcctccc ctgccgctgt gccaggcagg cagtgccaaa360tccggggagc ctggagctgg ggggagggcc ggggacagcc cggccctgcc ccctcccccg420ctgggagccc agcaacttct gaggaaagtt tggcacccat ggcgtggcgg tgccccagga480tgggcagggt cccgctggcc tggtgcttgg cgctgtgcgg ctgggcgtgc atggccccca540ggggcacgca ggctgaagaa agtcccttcg tgggcaaccc agggaatatc acaggtgccc600ggggactcac gggcaccctt cggtgtcagc tccaggttca gggagagccc cccgaggtac660attggcttcg ggatggacag atcctggagc tcgcggacag cacccagacc caggtgcccc720tgggtgagga tgaacaggat gactggatag tggtcagcca gctcagaatc acctccctgc780agctttccga cacgggacag taccagtgtt tggtgtttct gggacatcag accttcgtgt840cccagcctgg ctatgttggg ctggagggct tgccttactt cctggaggag cccgaagaca900
ggactgtggc cgccaacacc cccttcaacc tgagctgcca agctcaggga cccccagagc 960ccgtggacct actctggctc caggatgctg tccccctggc cacggctcca ggtcacggcc1020cccagcgcag cctgcatgtt ccagggctga acaagacatc ctctttctcc tgcgaagccc1080ataacgccaa gggggtcacc acatcccgca cagccaccat cacagtgctc ccccagcagc1140cccgtaacct ccacctggtc tcccgccaac ccacggagct ggaggtggct tggactccag1200gcctgagcgg catctacccc ctgacccact gcaccctgca ggctgtgctg tcagacgatg1260ggatgggcat ccaggcggga gaaccagacc ccccagagga gcccctcacc tcgcaagcat1320ccgtgccccc ccatcagctt cggctaggca gcctccatcc tcacacccct tatcacatcc1380gcgtggcatg caccagcagc cagggcccct catcctggac ccactggctt cctgtggaga1440cgccggaggg agtgcccctg ggcccccctg agaacattag tgctacgcgg aatgggagcc1500aggccttcgt gcattggcaa gagccccggg cgcccctgca gggtaccctg ttagggtacc1560ggctggcgta tcaaggccag gacaccccag aggtgctaat ggacataggg ctaaggcaag1620aggtgaccct ggagctgcag ggggacgggt ctgtgtccaa tctgacagtg tgtgtggcag1680cctacactgc tgctggggat ggaccctgga gcctcccagt acccctggag gcctggcgcc1740cagggcaagc acagccagtc caccagctgg tgaaggaacc ttcaactcct gccttctcgt1800ggccctggtg gtatgtactg ctaggagcag tcgtggccgc tgcctgtgtc ctcatcttgg1860ctctcttcct tgtccaccgg cgaaagaagg agacccgtta tggagaagtg tttgaaccaa1920cagtggaaag aggtgaactg gtagtcaggt accgcgtgcg caagtcctac agtcgtcgga1980ccactgaagc taccttgaac agcctgggca tcagtgaaga gctgaaggag aagctgcggg2040atgtgatggt ggaccggcac aaggtggccc tggggaagac tctgggagag ggagagtttg2100gagctgtgat ggaaggccag ctcaaccagg acgactccat cctcaaggtg gctgtgaaga2160cgatgaagat tgccatctgc acgaggtcag agctggagga tttcctgagt gaagcggtct2220
gcatgaagga atttgaccat cccaacgtca tgaggctcat cggtgtctgt ttccagggtt2280ctgaacgaga gagcttccca gcacctgtgg tcatcttacc tttcatgaaa catggagacc2340tacacagctt cctcctctat tcccggctcg gggaccagcc agtgtacctg cccactcaga2400tgctagtgaa gttcatggca gacatcgcca gtggcatgga gtatctgagt accaagagat2460tcatacaccg ggacctggcg gccaggaact gcatgctgaa tgagaacatg tccgtgtgtg2520tggcggactt cgggctctcc aagaagatct acaatgggga ctactaccgc cagggacgta2580tcgccaagat gccagtcaag tggattgcca ttgagagtct agctgaccgt gtctacacca2640gcaagagcga tgtgtggtcc ttcggggtga caatgtggga gattgccaca agaggccaaa2700ccccatatcc gggcgtggag aacagcgaga tttatgacta tctgcgccag ggaaatcgcc2760tgaagcagcc tgcggactgt ctggatggac tgtatgcctt gatgtcgcgg tgctgggagc2820taaatcccca ggaccggcca agttttacag agctgcggga agatttggag aacacactga2880aggccttgcc tcctgcccag gagcctgacg aaatcctcta tgtcaacatg gatgagggtg2940gaggttatcc tgaaccccct ggagctgcag gaggagctga ccccccaacc cagccagacc3000ctaaggattc ctgtagctgc ctcactgcgg ctgaggtcca tcctgctgga cgctatgtcc3060tctgcccttc cacaacccct agccccgctc agcctgctga taggggctcc ccagcagccc3120cagggcagga ggatggtgcc tgagacaacc ctccacctgg tactccctct caggatccaa3180gctaagcact gccactgggg aaaactccac cttcccactt tcccacccca cgccttatcc3240ccacttgcag ccctgtcttc ctacctatcc cacctccatc ccagacaggt ccctcccctt3300ctctgtgcag tagcatcacc ttgaaagcag tagcatcacc atctgtaaaa ggaaggggtt3360ggattgcaat atctgaagcc ctcccaggtg ttaacattcc aagactctag agtccaaggt3420ttaaagagtc tagattcaaa ggttctaggt ttcaaagatg ctgtgagtct ttggttctaa3480ggacctgaaa ttccaaagtc tctaattcta ttaaagtgct aaggttctaa ggcctacttt3540
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tgcgatagag tctcactgtg tcacccaggc3600tggagtgcag tggtgcaatc tcgcctcact gcaaccttca cctaccgagt tcaagtgatt3660ttcctgcctt ggcctcccaa gtagctggga ttacaggtgt gtgccaccac acccggctaa3720tttttatatt tttagtagag acagggtttc accatgttgg ccaggctggt ctaaaactcc3780tgacctcaag tgatctgccc acctcagcct cccaaagtgc tgagattaca ggcatgagcc3840actgcactca accttaagac ctactgttct aaagctctga cattatgtgg ttttagattt3900tctggttcta acatttttga taaagcctca aggttttagg ttctaaagtt ctaagattct3960gattttagga gctaaggctc tatgagtcta gatgtttatt cttctagagt tcagagtcct4020taaaatgtaa gattatagat tctaaagatt ctatagttct agacatggag gttctaaggc4080ctaggattct aaaatgtgat gttctaaggc tctgagagtc tagattctct ggctgtaagg4140ctctagatca taaggcttca aaatgttatc ttctcaagtt ctaagattct aatgatgatc4200aattatagtt tctgaggctt tatgataata gattctcttg tataagatcc tagatcctaa4260gggtcgaaag ctctagaatc tgcaattcaa aagttccaag agtctaaaga tggagtttct4320aaggtccggt gttctaagat gtgatattct aagacttact ctaagatctt agattctctg4380tgtctaagat tctagatcag atgctccaag attctagatg attaaataag attctaacgg4440tctgttctgt ttcaaggcac tctagattcc attggtccaa gattccggat cctaagcatc4500taagttataa gactctcaca ctcagttgtg actaactaga caccaaagtt ctaataattt4560ctaatgttgg acacctttag gttctttgct gcattctgcc tctctaggac catggttaag4620agtccaagaa tccacatttc taaaatctta tagttctagg cactgtagtt ctaagactca4680aatgttctaa gtttctaaga ttctaaaggt ccacaggtct agactattag gtgcaatttc4740aaggttctaa ccctatactg tagtattctt tggggtgccc ctctccttct tagctatcat4800tgcttcctcc tccccaactg tgggggtgtg cccccttcaa gcctgtgcaa tgcattaggg4860
atgcctcctt tcccgcaggg gatggacgat ctcccacctt tcgggccatg ttgcccccgt4920gagccaatcc ctcaccttct gagtacagag tgtggactct ggtgcctcca gaggggctca4980ggtcacataa aactttgtat atcaacgaaa aaaa5014<210>33<211>894<212>PRT<213>人<400>33Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys1 5 10 15Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala20 25 30Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg35 40 45Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro50 55 60Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp65 70 75 80Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp85 90 95Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr100 105 110Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu130 135 140Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys145 150 155 160Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp165 170 175Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu180 185 190His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His195 200 205Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu210 215 220Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu225 230 235 240Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr245 250 255His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln260 265 270Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser275 280 285Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro290 295 300Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp305 310 315 320Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro325 330 335Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His340 345 350Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg355 360 365Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly370 375 380Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser385 390 395 400Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro405 410 415Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln420 425 430Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp435 440 445Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val450 455 460Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg465 470 475 480
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val485 490 495Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr500 505 510Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp515 520 525Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu530 535 540Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser545 550 555 560Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg565 570 575Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe580 585 590Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser595 600 605Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys610 615 620His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln625 630 635 640Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile645 650 655
Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp660 665 670Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val675 680 685Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg690 695 700Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser705 710 715 720Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly725 730 735Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly740 745 750Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu755 760 765Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg770 775 780Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg785 790 795 800Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro805 810 815Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu820 825 830
Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro835 840 845Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly850 855 860Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala865 870 875 880Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala885 890<210>34<211>3608<212>DNA<213>人<400>34gaattcgtgt ctcggcactc actcccggcc gcccggacag ggagctttcg ctggcgcgct 60tggccggcga caggacaggt tcgggacgtc catctgtcca tccgtccgga gagaaattac120agatccgcag ccccgggatg gggccggccc cgctgccgct gctgctgggc ctcttcctcc180ccgcgctctg gcgtagagct atcactgagg caagggaaga agccaagcct tacccgctat240tcccgggacc ttttccaggg agcctgcaaa ctgaccacac accgctgtta tcccttcctc300acgccagtgg gtaccagcct gccttgatgt tttcaccaac ccagcctgga agaccacata360caggaaacgt agccattccc caggtgacct ctgtcgaatc aaagccccta ccgcctcttg420ccttcaaaca cacagttgga cacataatac tttctgaaca taaaggtgtc aaatttaatt480gctcaatcaa tgtacctaat atataccagg acaccacaat ttcttggtgg aaagatggga540aggaattgct tgggggacat catcgaatta cacagtttta tccagatgat gaagttacag600
caataatcgc ttccttcagc ataaccagtg tgcagcgttc agacaatggg tcgtatatct 660gtaagatgaa aataaacaat gaagagatcg tgtctgatcc catctacatc gaagtacaag 720gacttcctca ctttactaag cagcctgaga gcatgaatgt caccagaaac acagccttca 780acctcacctg tcaggctgtg ggcccgcctg agcccgtcaa cattttctgg gttcaaaaca 840gtagccgtgt taacgaacag cctgaaaaat cccccggcgt gctaactgtt ccaggcctga 900cggagatggc ggtcttcagt tgtgaggccc acaatgacaa agggctgacc gtgtcccagg 960gagtgcagat caacatcaaa gcaattccct ccccaccaac tgaagtcagc atccgtaaca1020gcactgcaca cagcattctg atctcctggg ttcctggttt tgatggatac tccccgttca1080ggaattgcag cattcaggtc aaggaagctg atccgctggg taatggctca gtcatgattt1140ttaacacctc tgccttacca catctgtacc aaatcaagca gctgcaagcc ctggctaatt1200acagcattgg tgtttcctgc atgaatgaaa taggctggtc tgcagtgagc ccttggattc1260tagcaagcac gactgaagga gccccatcag tagcaccttt aaatgtcact gtgtttctga1320atgaatctag tgataatgtg gacatcagat ggatgaagcc tccgactaag cagcaggatg1380gagaactggt gggctaccgg atatcccacg tgtggcagag tgcagggatt tccaaagagc1440tcttggagga agttggccag aatggcagcc gagctcggat ctctgttcaa gtccacaatg1500ctacgtgcac agtgaggatt gcagccgtca ccagaggggg agttgggccc ttcagtgatc1560cagtgaaaat atttatccct gcacacggtt gggtagatta tgccccctct tcaactccgg1620cgcctggcaa cgcagatcct gtgctcatca tctttggctg cttttgtgga tttattttga1680ttgggttgat tttatacatc tccttggcca tcagaaaaag agtccaggag acaaagtttg1740ggaatgcatt cacagaggag gattctgaat tagtggtgaa ttatatagca aagaaatcct1800tctgtcggcg agccattgaa cttaccttac atagcttggg agtcagtgag gaactacaaa1860ataaactaga agatgttgtg attgacagga atcttctaat tcttggaaaa attctgggtg1920
aaggagagtt tgggtctgta atggaaggaa atcttaagca ggaagatggg acctctctga1980aagtggcagt gaagaccatg aagttggaca actcttcaca tcgggagatc gaggagtttc2040tcagtgaggc agcgtgcatg aaagacttca gccacccaaa tgtcattcga cttctaggtg2100tgtgtataga aatgagctct caaggcatcc caaagcccat ggtaatttta cccttcatga2160aatacgggga cctgcatact tacttacttt attcccgatt ggagacagga ccaaagcata2220ttcctctgca gacactattg aagttcatgg tggatattgc cctgggaatg gagtatctga2280gcaacaggaa ttttcttcat cgagatttag ctgctcgaaa ctgcatgttg cgagatgaca2340tgactgtctg tgttgcggac ttcggcctct ctaagaagat ttacagtggc gattattacc2400gccaaggccg cattgctaag atgcctgtta aatggatcgc catagaaagt cttgcagacc2460gagtctacac aagtaaaagt gatgtgtggg catttggcgt gaccatgtgg gaaatacgta2520cgcggggaat gactccctat cctggggtcc agaaccatga gatgtatgac tatcttctcc2580atggccacag gttgaagcag cccgaagact gcctggatga actgtatgaa ataatgtact2640cttgctggag aaccgatccc ttagaccgcc ccaccttttc agtattgagg ctgcagctag2700aaaaactctt agaaagtttg cctgacgttc ggaaccaagc agacgttatt tacgtcaata2760cacagttgct ggagagctct gagggcctgg cccagggccc cacccttgct ccactggact2820tgaacatcga ccctgactct ataattgcct cctgcactcc ccgcgctgcc atcagtgtgg2880tcacagcaga agttcatgac agcaaacctc atgaaggacg gtacatcctg aatgggggca2940gtgaggaatg ggaagatctg acttctgccc cctctgctgc agtcacagct gaaaagaaca3000gtgttttacc gggggagaga cttgttagga atggggtctc ctggtcccat tcgagcatgc3060tgcccttggg aagctcattg cccgatgaac ttttgtttgc tgacgactcc tcagaaggct3120cagaagtcct gatgtgagga gaggtgcggg gagacattcc aaaaatcaag ccaattcttc3180tgctgtagga gaatccaatt gtacctgatg tttttggtat ttgtcttcct taccaagtga3240
actccatggc cccaaagcac cagatgaatg ttgttaagga agctgtcatt aaaaatacat3300aatatatatt tatttaaaga gaaaaaatat gtgtatatca tgaaaaagac aaggatattt3360taataaaaca ttacttattt catttcactt atcttgcata tcttaaaatt aagcttcagc3420tgctccttga tattaacctt tgtacagagt tgaagttgtt ttttcaactt cttttctttt3480tcattactat taaatgtaaa aatatttgta aaatgaaatg ccatatttga cttggcttct3540ggtcttgatg tatttgataa gaatgattaa ttttctgata tggcttccat aataaaattg3600aaatagga 3608<210>35<211>999<212>PRT<213>人<400>35Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro Ala1 5 10 15Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr20 25 30Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp His Thr35 40 45Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met50 55 60Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro His Thr Gly Asn Val Ala Ile65 70 75 80Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys Pro Leu Pro Pro Leu Ala Phe85 90 95
Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu Ser Glu His Lys Gly Val Lys100 105 110Phe Asn Cys Ser Ile Asn Val Pro Asn Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile115 120 125Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly His His Arg Ile130 135 140Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala Ser Phe145 150 155 160Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile Cys Lys165 170 175Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr Ile Glu180 185 190Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met Asn Val195 200 205Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro210 215 220G1u Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu225 230 235 240Gln Pro Glu Lys Ser Pro Gly Val Leu Thr Val Pro Gly Leu Thr Glu245 250 255Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu Thr Val260 265 270
Ser Gln Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser Pro Pro Thr275 280 285Glu Val Ser Ile Arg Asn Ser Thr Ala His Ser Ile Leu Ile Ser Trp290 295 300Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro Phe Arg Asn Cys Ser Ile Gln305 310 315 320Val Lys Glu Ala Asp Pro Leu Gly Asn Gly Ser Val Met Ile Phe Asn325 330 335Thr Ser Ala Leu Pro His Leu Tyr Gln Ile Lys Gln Leu Gln Ala Leu340 345 350Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser Cys Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser355 360 365Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser370 375 380Val Ala Pro Leu Asn Val Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn385 390 395 400Val Asp Ile Arg Trp Met Lys Pro Pro Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu405 410 415Leu Val Gly Tyr Arg Ile Ser Hi s Val Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser420 425 430Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile435 440 445
Ser Val Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Val450 455 460Thr Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile465 470 475 480Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala Pro485 490 495Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys Gly Phe500 505 510Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Ile Arg Lys Arg515 520 525Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu Glu Asp Ser Glu530 535 540Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe Cys Arg Arg Ala Ile545 550 555 560Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser Glu Glu Leu Gln Asn Lys565 570 575Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu Ile Leu Gly Lys Ile580 585 590Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu Gly Asn Leu Lys Gln595 600 605Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Leu Asp610 615 620
Asn Ser Ser His Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Cys625 630 635 640Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys645 650 655Ile Glu Met Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile Leu Pro660 665 670Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser Arg Leu675 680 685Glu Thr Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys Phe Met690 695 700Val Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn Phe Leu705 710 715 720His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp Met Thr725 730 735Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser Gly Asp740 745 750Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala755 760 765Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp770 775 780Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Arg Thr Arg Gly Met Thr Pro785 790 795 800
Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr Asp Tyr Leu Leu His Gly805 810 815His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile820 825 830Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser835 840 845Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Asp Val850 855 860Arg Asn Gln Ala Asp Val Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser865 870 875 880Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Pro Thr Leu Ala Pro Leu Asp Leu Asn885 890 895Ile Asp Pro Asp Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala Ala Ile900 905 910Ser Val Val Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu Gly Arg915 920 925Tyr Ile Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala930 935 940Pro Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu945 950 955 960Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu Pro965 970 975
Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp Ser Ser980 985 990Glu Gly Ser Glu Val Leu Met99權(quán)利要求
1.鑒定用于治療OA的化合物的方法，其包括a)使測試化合物與反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包含(i)受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族的多肽成員，和(ii)該多肽的配體，其中反應(yīng)混合物的條件允許多肽與配體結(jié)合形成結(jié)合復(fù)合體；b)檢測在測試化合物存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平；c)比較在測試化合物存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平和該測試化合物不存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平，其中測試化合物存在下形成結(jié)合復(fù)合體水平的下降表明測試化合物可用于治療OA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員選自TYRO3、Axl和cMer。
3.鑒定用于治療骨關(guān)節(jié)炎的化合物的方法，其包括a)使測試化合物與反應(yīng)混合物接觸，其中所述的反應(yīng)混合物包含(i)TYRO3多肽；和(ii)TYRO3配體，其中反應(yīng)混合物的條件允許TYRO3多肽與TYRO3配體結(jié)合形成結(jié)合復(fù)合體；b)檢測在測試化合物存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平；c)比較在測試化合物存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平與該測試化合物不存在下反應(yīng)混合物中形成結(jié)合復(fù)合體的水平，其中測試化合物存在下形成結(jié)合復(fù)合體的水平降低表明測試化合物可用于治療OA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中TYRO3多肽包含SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中TYRO3配體選自PROS1和GAS6多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中GAS6多肽包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
7.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣的編碼受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員的核酸；并且b)比較個體中所述核酸的水平與未患骨關(guān)節(jié)炎的個體中該核酸的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中該核酸水平的提高表明個體患有OA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員選自TYRO3、Axl和cMer。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
10.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中的TYRO3核酸；并且b)比較個體中TYRO3核酸的水平與未患OA的個體中TYRO3核酸的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中TYRO3核酸水平的提高表明個體患有OA。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中TYRO3核酸編碼具有SEQ ID NO2中所列氨基酸序列的多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中TYRO3核酸包含SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
14.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)在來源于個體的生物試樣中檢測TYRO3受體酪氨酸激酶亞家族多肽的水平；并且b)比較個體中所述多肽的水平與未患OA的個體中該多肽的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中該多肽水平的提高表明個體患有OA。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽選自TYRO3、Axl和cMer。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
17.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中的TYRO3多肽；并且b)比較個體中TYRO3多肽的水平與未患OA個體中TYRO3多肽的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中TYRO3多肽水平的提高表明個體患有OA。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中TYRO3多肽包含SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
20.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中編碼受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員配體的核酸；并且b)比較個體中所述核酸的水平與未患OA的個體中該核酸的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中該核酸水平的提高表明個體患有OA。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族多肽成員選自TYRO3、Axl和cMer。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
23.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中編碼TYRO3配體的核酸；并且b)比較個體中所述核酸的水平與未患骨關(guān)節(jié)炎個體中該核酸的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中該核酸水平的提高表明個體患有OA。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中TYRO3配體選自PROS1和GAS6。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中TYRO3配體包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中該編碼TYRO3配體的核酸包含SEQ ID NO4中所列的核苷酸序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
28.鑒定患有OA的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員配體的水平；并且b)比較個體中所述配體的水平與未患有OA的個體中該配體的水平，其中來源于個體的所述生物試樣中該配體水平的提高表明個體患有OA。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述受體酪氨酸激酶TYRO3亞家族成員選自TYRO3、Axl和cMer。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
31.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述配體選自PROS1和GAS6。
32.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述配體包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中編碼該配體的核酸包含SEQ IDNO4中所列的核苷酸序列。
34.鑒定患有骨關(guān)節(jié)炎的個體的方法，其包括a)檢測來源于個體的生物試樣中TYRO3配體的水平；b)比較個體中所述TYRO3配體的水平與未患骨關(guān)節(jié)炎的個體中該TYRO3配體的水平，其中來源于個體所述生物試樣中該TYRO3配體水平的提高表明個體患有OA。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中TYRO3配體選自PROS1和GAS6。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中TYRO3配體包含SEQ ID NO3中所列的氨基酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中編碼該TYRO3配體的核酸包含SEQ ID NO4中所列的核苷酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述生物試樣包括選自軟骨細胞、軟骨、滑膜液和血清的生物材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了包括TYRO3、Axl、cMer的受體酪氨酸激酶亞家族成員和其配體(如GAS6)為發(fā)展治療、預(yù)防或減輕OA的新療法的適當(dāng)靶點。本發(fā)明還涉及治療和/或減輕OA的方法和因此包含調(diào)節(jié)劑的藥物組合物，其中所述的調(diào)節(jié)劑對受體酪氨酸此亞家族成員和相關(guān)配體的表達和活性有抑制作用。本發(fā)明還涉及鑒定對OA具有治療效用的化合物的方法，這包括鑒定例如能抑制這些多肽活性和/或表達的化合物。
文檔編號C12Q1/48GK1774634SQ200480010247
公開日2006年5月17日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月18日
發(fā)明者S·達烏蒂, C·S·庫馬爾, B·J·拉塔里奧 申請人:諾瓦提斯公司