專利名稱：誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法及胰島樣細(xì)胞的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞定向分化的方法及胰島樣細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病。臨床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰島素來治療。細(xì)胞治療是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治療策略，對于已經(jīng)喪失胰島細(xì)胞功能的糖尿病患者來說，植入能分泌胰島素的β細(xì)胞或其替代物是最理想的治療方法。近幾年，胰島細(xì)胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細(xì)胞來源不足、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)等困難卻極大的限制了這種療法的應(yīng)用。
干細(xì)胞具有極強(qiáng)自我更新能力及多向分化潛能，是基因治療的理想靶細(xì)胞。干細(xì)胞分為全能干細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞，可以分化為機(jī)體所有組織細(xì)胞)、多能干細(xì)胞(具有多向分化潛能，可以分化為多種組織細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞等)和專能干細(xì)胞(維持某一特定組織細(xì)胞的單一方向自我更新，如腸上皮干細(xì)胞等)。干細(xì)胞技術(shù)的不斷突破及干細(xì)胞本身所具有的特性使人類有可能在體外培養(yǎng)某些干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)其分化為我們所需要的各種組織細(xì)胞，或作為種子細(xì)胞用于組織工程以供臨床所需，以此為目的的干細(xì)胞工程涉及人體幾乎所有重要組織器官及人類面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題，如心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、骨及軟骨缺損、老年性癡呆、帕金森病、燒傷、脊髓損傷和遺傳性缺陷等的治療。由于人臍帶血、外周血和骨髓中的多能干細(xì)胞，具有增殖能力強(qiáng)、來源豐富、采集方便等優(yōu)點(diǎn)，此類干細(xì)胞移植在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的治療中發(fā)揮了重要的作用。
胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種腸促胰島素激素，它是一種由小腸L細(xì)胞分泌的多肽激素，具有促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰升糖素釋放，抑制胃排空，增加β細(xì)胞增殖等作用。它還具有對葡萄糖依賴的降血糖作用，不會產(chǎn)生低血糖。能使2型糖尿病病人的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后β細(xì)胞功能恢復(fù)到非糖尿病水平，改善血脂水平。GLP-1受體是一個與G蛋白偶聯(lián)的7個跨膜結(jié)構(gòu)，主要第二信使為cAMP，當(dāng)細(xì)胞外液葡萄糖濃度增加時(shí)，葡萄糖進(jìn)入β細(xì)胞被氧化使細(xì)胞內(nèi)ATP含量增加，ATP與ATP敏感K+通道結(jié)合，導(dǎo)致K+通道關(guān)閉，細(xì)胞膜去極化，于是Ca2+通道開放，Ca2+內(nèi)流，刺激胰島素從β細(xì)胞排出，從而促進(jìn)了胰島素的分泌。GLP-1與β細(xì)胞膜上的GLP-1受體結(jié)合，通過增加細(xì)胞內(nèi)cAMP，使K+ATP酶磷酸化進(jìn)而促進(jìn)胰島素的分泌，同時(shí)競爭胰高血糖素受體，降低胰高血糖素濃度。
對干細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蛐揎?，使之成為能分泌胰島素的細(xì)胞，是治療I型糖尿病的理想策略之一，而引入胰高血糖素樣肽-1受體基因(glp-1r基因)，有可能使我們獲得能分泌胰島素的細(xì)胞。因此，分離不同組織來源的成體干細(xì)胞，將其在體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑等的制備，同時(shí)誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞可作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。此方法的建立將在以基因工程、細(xì)胞工程乃至組織工程等為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)中具有極佳的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一種體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是利用干細(xì)胞具有多向分化的潛能，誘導(dǎo)其向胰島樣細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可分泌胰島素，為胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑的制備提供種子細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。
本發(fā)明中所用的誘導(dǎo)方法，其特征在于利用含有GLP-1受體基因的載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，并同時(shí)添加細(xì)胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
本發(fā)明中的干細(xì)胞包括人和哺乳動物胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、造血干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。
本發(fā)明中所用的載體包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過這些載體介導(dǎo)GLP-1R基因在干細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明所用的體外誘導(dǎo)方法是將GLP-1直接加入轉(zhuǎn)染了GLP-1R基因的干細(xì)胞的培養(yǎng)液中，在GLP-1的作用下誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
本發(fā)明用于基因轉(zhuǎn)染的載體中腺病毒載體是轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的首選病毒載體。
本發(fā)明選用的培養(yǎng)液為無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其中添加了營養(yǎng)素或細(xì)胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
本發(fā)明中所獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)能表達(dá)胰島相關(guān)基因及蛋白，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。
本發(fā)明中體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化后的胰島樣細(xì)胞能分泌胰島素，可作為種子細(xì)胞用于胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑的制備及作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。
具體實(shí)施方案如下1.分離不同組織來源的成體干細(xì)胞，制備方法是(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離無菌條件下，經(jīng)雙側(cè)髂后上棘穿刺，采集骨髓，經(jīng)Percoll(美國，Sigma公司產(chǎn)品，相對密度1.073g/ml)密度梯度離心后收集人骨髓單個核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)72h，去除懸浮細(xì)胞后貼壁生長的即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
(2)大鼠肝干細(xì)胞分離無菌條件下，沿正中線切開大鼠腹腔并暴露門靜脈，輸注無鈣鎂Hanks液至肝臟變成肉色后，保留門靜脈，離斷肝臟并將肝臟移入無菌平皿中，再輸注含IV型膠原酶的Hanks液，回收平皿內(nèi)的膠原酶液，去除肝包膜及血管，鈍性撕裂肝組織，以培養(yǎng)基溶解，多層紗布過濾，反復(fù)離心洗滌，再以培養(yǎng)基制備成單個肝細(xì)胞懸液。
(3)臍帶血單個核細(xì)胞的分離無菌及ACD抗凝液抗凝條件下經(jīng)臍靜脈穿刺取血，采集健康足月順產(chǎn)新生兒臍帶血，依次經(jīng)過0.5％甲基纖維素(美國，Sigma公司產(chǎn)品)沉降及Ficoll(美國，Sigma公司產(chǎn)品，相對密度1.077g/ml)密度梯度離心后收集人臍帶血單個核細(xì)胞，洗滌后重懸于PBS中。
2.構(gòu)建了含glp-1r基因的腺病毒載體，步驟如下用電穿孔法使穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-glp-1r與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝并擴(kuò)增腺病毒。
3.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMSCV-GLP-1R，步驟如下設(shè)計(jì)含有Sal I、Ecor V位點(diǎn)的GLP-1R基因上、下游引物，從攜帶GLP-1R基因的質(zhì)粒中獲得目的基因GLP-1R，將反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T eassy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質(zhì)粒T-GLP-1R，用限制性內(nèi)切酶SalI和Ecor V雙酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo載體，獲得攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GLP-1R。
4.用攜帶目的基因的載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞。
5.在轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞培養(yǎng)液中直接添加GLP-1細(xì)胞因子，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。
6.利用RT-PCR鑒定體外誘導(dǎo)分化的細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果是1.按照本發(fā)明提供的技術(shù)方法，可以將人和哺乳動物胚胎、骨髓、外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺于細(xì)胞、肝干細(xì)胞、造血干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞等在體外定向誘導(dǎo)分化為能分泌胰島素的胰島樣細(xì)胞；2.按照本發(fā)明技術(shù)方法得到的體外誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于胰島細(xì)胞移植及微囊化干細(xì)胞制劑的制備；3.按照本發(fā)明技術(shù)方法得到的體外誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞，可作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。
4.本發(fā)明中誘導(dǎo)分化方法的建立將在以基因工程、細(xì)胞工程乃至組織工程等為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)中具有極佳的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖MDL2000 -陰性對照 1非特異性條帶 21300bp左右的目的基因GLP-1R。
圖2 T載體連接產(chǎn)物酶切、PCR鑒定圖MDL15000Marker1、目的基因與Teasy載體連接產(chǎn)物2、PCR鑒定圖3、酶切鑒定圖(I3.0kb；II1.3kb)圖3帶目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒酶切鑒定圖MDL15000Marker
1酶切鑒定圖(I9.7kb；II1392bp)圖4重組質(zhì)粒的鑒定4aMDL15000Marker1未重組的質(zhì)粒大小9kb左右2重組成功的質(zhì)粒大小40kb左右4bMDL15000Marker1PacI性酶切鑒定圖(I38.6kb II4.5kb)圖5lGLP-1R基因的表達(dá)1.未轉(zhuǎn)染的MSC；2.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 3天；3.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 7天；4.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 14天；+.陽性對照IIPDX-1基因的表達(dá)1.未轉(zhuǎn)染的MSC；2.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 3天；3.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 7天；4.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 14天III胰島素基因的表達(dá)1 未轉(zhuǎn)染的MSC；2 轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC3天；3.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 7天；4.轉(zhuǎn)染glp-1r于MSC 14天圖6免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、GLP-1R基因的獲得攜帶GLP-1R基因的質(zhì)粒由德國Lankette教授饋贈。設(shè)計(jì)含有Sal I、Ecor V位點(diǎn)的GLP-1R基因全長上、下游引物，引物序列及其多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的條件如下上游引物5′-gtc gac tcc tga act ccc cgc catg-3′下游引物5′-gat atc gct gga gtc tca gct gca cgga-3′
20μl反應(yīng)體系包括1μl cDNA(100ng/μl)，primer1和2各0.5μl(20μM)，1.5μl dNTP(2.5mM)，0.25μl La Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，2μl 5×GC Buffer I，14.75μl滅菌水。反應(yīng)條件為94℃變性3min；94℃45s，56℃45s，72℃2min，28個循環(huán)；72℃7min。電泳后1300bp左右為目的基因GLP-1R(見圖1)。反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T eassy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質(zhì)粒T-GLP-1R(見圖2)。
實(shí)施例2、pAdv-GLP-1R腺病毒載體的構(gòu)建用Sal I、Ecor V雙酶切連入pGEM-T easy載體的GLP-1R基因后，回收目的片斷插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv的Sal I、Ecor V位點(diǎn)，獲得帶有GLP-1R基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒，經(jīng)Sal I及Ecor V雙酶切鑒定，切出了1392bp的小片段及9.7kb的大片段(見圖3)。
選用PmeI酶切1μg穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-GLP-1R，70％乙醇沉淀質(zhì)粒，加5μl H2O。線性化的穿梭質(zhì)粒與100ng超螺旋質(zhì)粒pAdEasy-1電穿孔共轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板篩選。選擇20個小克隆，分別接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，37℃搖菌過夜。提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒均大于40kb，所以經(jīng)0.7％瓊脂糖電泳可初步鑒定。根據(jù)電泳結(jié)果，選取質(zhì)粒作PacI限制性酶切鑒定。重組質(zhì)?？杀幻盖谐?.5kb的小片段及38.6kb的大片段(見圖4)。
取鑒定好的重組病毒質(zhì)粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000包裹線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h后去掉轉(zhuǎn)染液，加含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10天，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收集細(xì)胞，-70℃和37℃反復(fù)凍融三次，離心取上清。用病毒上清再次感染293細(xì)胞，收集上清。用TCID50法測定病毒滴度(參考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度為2.0×108PFU/mL。
實(shí)施例3、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMSCV-GLP-1R的構(gòu)建。
克隆質(zhì)粒T-GLP-1R用限制性內(nèi)切酶Sal I和Ecor V雙酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo載體的Sal I和Ecor V位點(diǎn)上，獲得攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GLP-1R，重組質(zhì)粒分別經(jīng)Sal I.Ecor V雙酶切后，TAE瓊脂糖凝膠電泳分別得到5.15KB、1300bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合；對其進(jìn)行正、反向測序及分析表明，其開放閱讀框正確，沒有發(fā)生移碼改變。表明我們克隆的目的基因序列正確，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GLP-1R構(gòu)建成功。
實(shí)施例4、逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生細(xì)胞株的建立和篩選。
PT67細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)培養(yǎng)至95％匯合。將pMSCV-GLP-1R 5μg加入250μl無血清培養(yǎng)液，取LF2000 10μl加入250μl上述培養(yǎng)液，兩者混勻室溫放置20min。將PT67細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次，緩慢滴入用1ml培養(yǎng)液稀釋的DNA-LF2000混合液。培養(yǎng)6h后，加入1ml含20％胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換完全培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后按1∶15傳代，加入含600μg/ml G418篩選14d，直至抗性細(xì)胞集落形成。挑選大的健康的細(xì)胞集落，用完全培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，以制備含病毒的包裝細(xì)胞上清、測定病毒滴度并凍存細(xì)胞。
實(shí)施例5、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-GLP-1R病毒滴度的測定和PT-GLP-1R細(xì)胞株的建立。
生長狀態(tài)良好的NIH3T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h至60％匯合，將制備的病毒液相應(yīng)作10-2、10-4、10-6倍稀釋，加入polybrene至終濃度為8μg/ml。倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別吸取1ml稀釋的病毒液加入培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)5h，補(bǔ)加2ml含胎牛血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24h，更換新鮮含500μg/mlG418的培養(yǎng)基，每3d換液一次，培養(yǎng)14d待長出肉眼可見的集落后，傾去培養(yǎng)液，以純甲醛固定后用姬母薩染色，用克隆計(jì)數(shù)儀自動計(jì)數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)后得病毒滴度(CFU)。我們共挑選出病毒滴度＞106CFU的包裝細(xì)胞6個，篩選出具有最高滴度(1.5×108PFU/mL)的包裝細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后建立高滴度表達(dá)GLP-1R的包裝細(xì)胞株P(guān)T-GLP-1R。
實(shí)施例6、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液中野生型病毒的檢測。
將以上病毒滴度測定所得NIH3T3多克隆用完全培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)48h，收集所得細(xì)胞上清再次感染NIH3T3細(xì)胞，加500μg/ml G418篩選，5d后細(xì)胞全部死亡。提示PT67細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測出的輔助病毒，用它制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以感染人和其他哺乳動物細(xì)胞可以廣泛使用而且較為安全。
實(shí)施例7、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增由非血液系統(tǒng)疾病胸外科手術(shù)后獲得肋骨，無菌條件下擠出肋骨中的骨髓；或由非血液系統(tǒng)疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibco公司)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5ml完全培養(yǎng)液混勻后輕輕疊加到密度為1.073的Percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細(xì)胞膜層以上的部分，加入完全培養(yǎng)液洗兩遍。按1×106/ml密度接種于完全培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后更換培養(yǎng)液，以后每4d換液一次。細(xì)胞達(dá)80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
實(shí)施例8、大鼠肝干細(xì)胞的分離雄性Wister大鼠，體重300～350g，3％苯巴比妥鈉麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，沿正中線切開腹腔并暴露門靜脈，將硅膠管針頭端插入門靜脈繼以細(xì)線固定，硅膠管輸液端與一次性輸血器連接，后者連接輸液瓶，先輸注無鈣鎂Hanks液(含EDTA 1mmol/L)200ml，速度為30ml/min，肝臟變成肉色后，除保留門靜脈外離斷肝臟血管、韌帶及系膜，將肝臟移入無菌平皿中，再輸注含0.05％IV型膠原酶Hanks液100ml，輸注速度為15ml/min，可回收平皿內(nèi)的膠原酶液，視消化程度決定是否繼續(xù)輸注。液體溫度為39℃。去除肝包膜及血管，鈍性撕裂肝組織，以培養(yǎng)基溶解，多層紗布過濾，以50g×3min反復(fù)離心洗滌3次，再以培養(yǎng)基制備成單個肝細(xì)胞懸液。
實(shí)施例9、GLP-1誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為例，選擇病毒感染MSC合適的MOI(Multiplicity of Infection)值(MOI＝300Virus/Cell)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)計(jì)算所需病毒量，運(yùn)用收集的病毒上清液感染MSC，孵育2h后，補(bǔ)加含有10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，同時(shí)在培養(yǎng)液中直接添加GLP-1細(xì)胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)1周，誘導(dǎo)MSC在體外分化為胰島樣細(xì)胞。
實(shí)施例10、胰島樣細(xì)胞團(tuán)的鑒定1)利用RT-PCR鑒定不同時(shí)間PDX-1、胰島素，胰高血糖素基因的表達(dá)。利用primer 3軟件設(shè)計(jì)基因引物，序列如下

結(jié)果表明轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的細(xì)胞(1周)高表達(dá)GLP-1R、PDX-1、胰島素基因。(見圖5)2)將轉(zhuǎn)染3天后的MSC接種在96孔板中(5×103/孔)，進(jìn)行胰島素的免疫細(xì)胞染色，結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)胰島素蛋白陽性，同時(shí)我們可以觀察到細(xì)胞逐漸變圓并聚集成胰島樣細(xì)胞團(tuán)(見圖6)。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法，其特征在于利用干細(xì)胞具有多向分化的潛能，誘導(dǎo)其向胰島樣細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可分泌胰島素，為胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑的制備提供種子細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞可作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。
2.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于利用含有GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)受體基因的載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，并同時(shí)添加細(xì)胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
3.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的干細(xì)胞具有多向分化潛能，包括人和哺乳動物胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、造血干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的載體包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過這些載體介導(dǎo)GLP-1R基因在干細(xì)胞中表達(dá)。
5.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，將GLP-1直接加入轉(zhuǎn)染了GLP-1R基因的干細(xì)胞的培養(yǎng)液中，在GLP-1的作用下誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
6.按照權(quán)利要求1或4所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的載體中腺病毒載體是轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的首選病毒載體。
7.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，選用的培養(yǎng)液為無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其中添加了營養(yǎng)素或細(xì)胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染GLP-1R基因的干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化。
8.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)能表達(dá)胰島相關(guān)基因及蛋白，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。
9.體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化后的胰島樣細(xì)胞的用途，其特征在于誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞可分泌胰島素，可作為種子細(xì)胞用于胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑的制備。
10.按照權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞可作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞定向分化的方法及胰島樣細(xì)胞的用途。本發(fā)明的目的是提供一種體外獲得大量胰島樣細(xì)胞的方法，并將誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于胰島細(xì)胞移植、微囊化干細(xì)胞制劑的制備以及作為體外的藥代動力學(xué)模型用于細(xì)胞藥物篩選。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1)獲得GLP－1R基因；2)構(gòu)建含有GLP－1R基因的病毒載體；3)分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增干細(xì)胞；4)向培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子GLP－1，誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化；5)獲得的胰島樣細(xì)胞鑒定。此方法的建立將在以基因工程、細(xì)胞工程乃至組織工程等為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)中具有極佳的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N15/85GK1772885SQ20041009078
公開日2006年5月17日 申請日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者裴雪濤, 張銳, 李艷華, 王韞芳, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所