專(zhuān)利名稱(chēng)：用于T－A克隆的pG7X－T載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及質(zhì)粒載體的構(gòu)建，具體地講，是將質(zhì)粒pG7X改造成線性化以后帶有dT末端，使之成為能克隆PCR產(chǎn)物和含有dA末端DNA片段的T載體。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)和基因工程研究中，PCR是一項(xiàng)廣泛用于體外擴(kuò)增特異DNA片段的基本技術(shù)，而將PCR產(chǎn)物成功地克隆到特定載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)，是目前研究基因或DNA片段的必經(jīng)之路。為了解決這一問(wèn)題，近年來(lái)發(fā)展了T-A克隆技術(shù)，即利用Taq DNA聚合酶非模板依賴(lài)型末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在PCR產(chǎn)物的3′端加上一個(gè)dA的特點(diǎn)，使PCR產(chǎn)物與具有一個(gè)3′dT突出末端的T載體連接，然后轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，使PCR產(chǎn)物得到高效快速克隆。這項(xiàng)技術(shù)有效地克服了傳統(tǒng)克隆技術(shù)很多固有的缺點(diǎn)，如載體容易自連，克隆效率低，篩選陽(yáng)性克隆難度大，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等。其中快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地制備T載體成為有效利用該克隆技術(shù)的關(guān)鍵之一。
目前T載體售價(jià)大多偏高，如1微克的Promega公司的pGEM-T載體和pGEM-T Easy載體的售價(jià)分別在700元和800元左右，1微克的TaKaRa公司的pMD18-T載體的售價(jià)在500元左右。國(guó)內(nèi)幾家公司開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，售價(jià)也在200元以上，而且存在連接效率低、連接不穩(wěn)定等缺陷。因此制備高質(zhì)量、穩(wěn)定、價(jià)廉的T載體是廣大分子生物學(xué)研究者關(guān)心的問(wèn)題，也是生物試劑廠商感興趣的業(yè)務(wù)之一。
目前T載體的構(gòu)建方法主要有兩種第一種方法是用產(chǎn)生平末端的限制性?xún)?nèi)切酶(如EcoRV)在質(zhì)粒DNA多克隆位點(diǎn)處切開(kāi)，利用Taq DNA聚合酶非模板擴(kuò)增特性在線性質(zhì)粒兩條鏈的3′端添加dT制成T載體(Harwood A J.Methods in Molecular Biology.Human Press，1994，3119-33；奧斯伯·布倫特等主編，顏?zhàn)臃f、王海林譯，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，科學(xué)出版社，1998，616-618)，如Promega和TaKaRa公司的產(chǎn)品，以及國(guó)內(nèi)幾家公司的產(chǎn)品。該方法存在很多缺點(diǎn)，如載體平末端加dT效率低，而且連接不穩(wěn)定，載體在克隆過(guò)程中自身環(huán)化率較高，必然增加篩選陽(yáng)性克隆的難度。此外，用該方法生產(chǎn)的T載體產(chǎn)量有限，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，還容易造成批次間質(zhì)量差異大，在普及上存在一定困難(陸哲明，柯楊.北京大學(xué)學(xué)報(bào)[醫(yī)學(xué)版]，2002，34(6)726-728)。
第二種方法是在質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)引入特殊序列，利用限制性?xún)?nèi)切酶(如XcmI、AspEI、HphI等)酶切即可直接產(chǎn)生T載體(Jooyeun C，William B，Srinivasn C.Gene，1993，136369-370；Ichihara Y，Kurosawa Y.Gene，1993，130153-154；Schutte B C，Ranade K，Pruessner J，et al.BioTechniques，1997，2240-44)。該方法雖然成本稍高(原因是所使用的限制性?xún)?nèi)切酶價(jià)格較高)，但制備更快捷(只需酶切，回收片段即是穩(wěn)定的T載體，不必額外進(jìn)行加尾反應(yīng))，更高效(通過(guò)酶切反應(yīng)在3′端產(chǎn)生單個(gè)T突出末端更徹底)，更穩(wěn)定(通過(guò)酶切加尾更容易，產(chǎn)品性能穩(wěn)定)，產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)更直觀可靠(只需要跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切是否充分)。因此，限制性?xún)?nèi)切酶法以其簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，在T載體構(gòu)建領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明在不影響質(zhì)粒編碼的β-半乳糖苷酶活力的情況下，改造Promega公司的商品質(zhì)粒pGEM7Zf(+)，通過(guò)PCR擴(kuò)增在質(zhì)粒中增加有用的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生新質(zhì)粒pG7X，該質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶XcmI消化以后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收的2989堿基對(duì)DNA片段，即是含有3′dT粘性末端、可用于PCR產(chǎn)物和其它帶有dA末端DNA片段克隆的T載體，命名為pG7X-T。這種T載體具有穩(wěn)定的3′dT粘性末端、連接效率高、制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，克服了商品化T-A克隆系統(tǒng)售價(jià)高、批次間質(zhì)量不穩(wěn)定以及無(wú)法進(jìn)行循環(huán)使用等缺點(diǎn)。
本發(fā)明用于T-A克隆的pG7X-T載體DNA序列如下0001 GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTCTCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG0091 ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTATATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT0181 ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGGTACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC0271 CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCGGGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC0361 AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCATCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG TGTCTTAGTC CCCTATTGCG TCCTTTCTTG TACACTCGTT TTCCGGTCGT0451 AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAGTTTCCGGTCC TTGGCATTTT TCCGGCGCAA CGACCGCAAA AAGGTATCCG AGGCGGGGGG ACTGCTCGTA GTGTTTTTAG CTGCGAGTTC0541 TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCCAGTCTCCACC GCTTTGGGCT GTCCTGATAT TTCTATGGTC CGCAAAGGGG GACCTTCGAG GGAGCACGCG AGAGGACAAG GCTGGGACGG0631 GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGTCGAATGGCCT ATGGACAGGC GGAAAGAGGG AAGCCCTTCG CACCGCGAAA GAGTATCGAG TGCGACATCC ATAGAGTCAA GCCACATCCA0721 CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCCGCAAGCGAGG TTCGACCCGA CACACGTGCT TGGGGGGCAA GTCGGGCTGG CGACGCGGAA TAGGCCATTG ATAGCAGAAC TCAGGTTGGG0811 GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAACCATTCTGTG CTGAATAGCG GTGACCGTCG TCGGTGACCA TTGTCCTAAT CGTCTCGCTC CATACATCCG CCACGATGTC TCAAGAACTT0901 GTGGTGGCCT AACTACGGCT ACACTAGAAG AACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC TTCGGAAAAA GAGTTGGTAGCACCACCGGA TTGATGCCGA TGTGATCTTC TTGTCATAAA CCATAGACGC GAGACGACTT CGGTCAATGG AAGCCTTTTT CTCAACCATC0991 CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGAGAGAACTAGG CCGTTTGTTT GGTGGCGACC ATCGCCACCA AAAAAACAAA CGTTCGTCGT CTAATGCGCG TCTTTTTTTC CTAGAGTTCT1081 AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC ATGAGATTAT CAAAAAGGATTCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCCCAGACT GCGAGTCACC TTGCTTTTGA GTGCAATTCC CTAAAACCAG TACTCTAATA GTTTTTCCTA1171 CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTTGAAGTGGATC TAGGAAAATT TAATTTTTAC TTCAAAATTT AGTTAGATTT CATATATACT CATTTGAACC AGACTGTCAA TGGTTACGAA1261 AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGATTAGTCACTC CGTGGATAGA GTCGCTAGAC AGATAAAGCA AGTAGGTATC AACGGACTGA GGGGCAGCAC ATCTATTGAT GCTATGCCCT1351 GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGGCCCGAATGGT AGACCGGGGT CACGACGTTA CTATGGCGCT CTGGGTGCGA GTGGCCGAGG TCTAAATAGT CGTTATTTGG TCGGTCGGCC1441 AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCCTTCCCGGCTC GCGTCTTCAC CAGGACGTTG AAATAGGCGG AGGTAGGTCA GATAATTAAC AACGGCCCTT CGATCTCATT CATCAAGCGG1531 AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTCTCAATTATCA AACGCGTTGC AACAACGGTA ACGATGTCCG TAGCACCACA GTGCGAGCAG CAAACCATAC CGAAGTAAGT CGAGGCCAAG1621 CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGTTGCTAGT TCCGCTCAAT GTACTAGGGG GTACAACACG TTTTTTCGCC AATCGAGGAA GCCAGGAGGC TAGCAACAGT CTTCATTCAA1711 GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGACCGGCGTCAC AATAGTGAGT ACCAATACCG TCGTGACGTA TTAAGAGAAT GACAGTACGG TAGGCATTCT ACGAAAAGAC ACTGACCACT
1801 GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAGCATGAGTTGG TTCAGTAAGA CTCTTATCAC ATACGCCGCT GGCTCAACGA GAACGGGCCG CAGTTATGCC CTATTATGGC GCGGTGTATC1891 CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTAGTCTTGAAAT TTTCACGAGT AGTAACCTTT TGCAAGAAGC CCCGCTTTTG AGAGTTCCTA GAATGGCGAC AACTCTAGGT CAAGCTACAT1981 ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAATGGGTGAGCA CGTGGGTTGA CTAGAAGTCG TAGAAAATGA AAGTGGTCGC AAAGACCCAC TCGTTTTTGT CCTTCCGTTT TACGGCGTTT2071 AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCATTTTCCCTTAT TCCCGCTGTG CCTTTACAAC TTATGAGTAT GAGAAGGAAA AAGTTATAAT AACTTCGTAA ATAGTCCCAA TAACAGAGTA2161 GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ATGCGGTGTGCTCGCCTATG TATAAACTTA CATAAATCTT TTTATTTGTT TATCCCCAAG GCGCGTGTAA AGGGGCTTTT CACGGTGGAC TACGCCACAC2251 AAATACCGCA CAGATGCGTA AGGAGAAAAT ACCGCATCAG GAAATTGTAA GCGTTAATAT TTTGTTAAAA TTCGCGTTAA ATTTTTGTTATTTATGGCGT GTCTACGCAT TCCTCTTTTA TGGCGTAGTC CTTTAACATT CGCAATTATA AAACAATTTT AAGCGCAATT TAAAAACAAT2341 AATCAGCTCA TTTTTTAACC AATAGGCCGA AATCGGCAAA ATCCCTTATA AATCAAAAGA ATAGACCGAG ATAGGGTTGA GTGTTGTTCCTTAGTCGAGT AAAAAATTGG TTATCCGGCT TTAGCCGTTT TAGGGAATAT TTAGTTTTCT TATCTGGCTC TATCCCAACT CACAACAAGG2431 AGTTTGGAAC AAGAGTCCAC TATTAAAGAA CGTGGACTCC AACGTCAAAG GGCGAAAAAC CGTCTATCAG GGCGATGGCC CACTACGTGATCAAACCTTG TTCTCAGGTG ATAATTTCTT GCACCTGAGG TTGCAGTTTC CCGCTTTTTG GCAGATAGTC CCGCTACCGG GTGATGCACT2521 ACCATCACCC TAATCAAGTT TTTTGGGGTC GAGGTGCCGT AAAGCACTAA ATCGGAACCC TAAAGGGAGC CCCCGATTTA GAGCTTGACGTGGTAGTGGG ATTAGTTCAA AAAACCCCAG CTCCACGGCA TTTCGTGATT TAGCCTTGGG ATTTCCCTCG GGGGCTAAAT CTCGAACTGC2611 GGGAAAGCCG GCGAACGTGG CGAGAAAGGA AGGGAAGAAA GCGAAAGGAG CGGGCGCTAG GGCGCTGGCA AGTGTAGCGG TCACGCTGCGCCCTTTCGGC CGCTTGCACC GCTCTTTCCT TCCCTTCTTT CGCTTTCCTC GCCCGCGATC CCGCGACCGT TCACATCGCC AGTGCGACGC2701 CGTAACCACC ACACCCGCCG CGCTTAATGC GCCGCTACAG GGCGCGTCCA TTCGCCATTC AGGCTGCGCA ACTGTTGGGA AGGGCGATCGGCATTGGTGG TGTGGGCGGC GCGAATTACG CGGCGATGTC CCGCGCAGGT AAGCGGTAAG TCCGACGCGT TGACAACCCT TCCCGCTAGC2791 GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGG GATGTGCTGC AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCACACGCCCGGA GAAGCGATAA TGCGGTCGAC CGCTTTCCCC CTACACGACG TTCCGCTAAT TCAACCCATT GCGGTCCCAA AAGGGTCAGT2881 CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGTGAATTG TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTGGGC CCGACGTCGC ATGCTCCTCT AGACTCGAGGGCTGCAACAT TTTGCTGCCG GTCACTTAAC ATTATGCTGA GTGATATCCC GCTTAACCCG GGCTGCAGCG TACGAGGAGA TCTGAGCTCC2971 AATTCGGTAC CCCAGGTCTTTAAGCCATG GGGTCCAG本發(fā)明根據(jù)Promega公司的質(zhì)粒pGEM7Zf(+)的序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物--pG7X-F2和pG7X-R2，其序列如下pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt本發(fā)明還包括兩條引物的5′-端分別插入限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和XcmI識(shí)別位點(diǎn)，其位點(diǎn)分別用單線和波線標(biāo)示如下pG7X-F2gaataagcttgttccccaggtcaagatggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagcaagacctggggtaccgaattcctcgagt以pGEM7Zf(+)DNA為模板、pG7X-F2和pG7X-R2為引物構(gòu)建的新質(zhì)粒，命名為pG7X，其步驟和方法如下1.質(zhì)粒pGEM7Zf(+)的PCR擴(kuò)增及HindIII酶切根據(jù)pGEM7Zf(+)序列(圖1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物pG7X-F2和pG7X-R2，引物的5′端分別插入HindIII(單線處)和XcmI(波線處)識(shí)別位點(diǎn)。引物序列為pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt以質(zhì)粒pGEM7Zf(+)DNA為模板，pG7X-F2和pG7X-R2為引物，在大連寶生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。20微升擴(kuò)增體系中，含6皮摩爾的pG7X-F2，6皮摩爾的pG7X-R2，5納克的pGEM7Zf(+)，0.5單位的Ex TaqDNA聚合酶，2.0微升的Ex-緩沖液，1.6微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)；反應(yīng)循環(huán)為94℃下預(yù)熱5分鐘后，經(jīng)35個(gè)反應(yīng)循環(huán)(94℃40秒，60℃32秒，72℃200秒)，然后在72℃下保溫7分鐘，最后保存在4℃。大約3千堿基對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，置于37℃進(jìn)行HindIII酶切。酶切體系為2.8微克的PCR產(chǎn)物，23微升的緩沖液，120單位的HindIII，補(bǔ)水至230微升。酶切產(chǎn)物通過(guò)0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段DNA。
2.HindIII酶切產(chǎn)物的環(huán)化回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA連接酶的溶液中，12℃保溫過(guò)夜，進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化。10微升連接體系為240納克的DNA片段，1微升的緩沖液，350單位的T4DNA連接酶。
3.連接DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣處理法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，然后涂于含50微克/毫升氨芐青霉素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，選取藍(lán)色菌落。
4.菌落的PCR篩選隨機(jī)挑選一定數(shù)目的藍(lán)色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2為引物進(jìn)行菌落PCR。15微升擴(kuò)增體系中，含4.5皮摩爾的pG7X-F2，4.5皮摩爾的pG7X-R2，0.5單位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-緩沖液、1.2微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)。反應(yīng)循環(huán)為94℃預(yù)熱10分鐘后，經(jīng)35個(gè)反應(yīng)循環(huán)(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保溫7分鐘，最后保存在4℃，通過(guò)瓊脂糖電泳篩選含有3千堿基對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性菌落。
5.陽(yáng)性菌的進(jìn)一步篩選和鑒定將上一步篩選得到的陽(yáng)性菌分別劃線挑選單菌落，接種于10毫升含50微克/毫升氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，方法同步驟4。
6.用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和XcmI酶切鑒定上一步提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)產(chǎn)生3千堿基對(duì)DNA片段，見(jiàn)圖3M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物λ-EcoT14I digest，1、2、3及4為不同的克隆。酶切體系(1)5單位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的緩沖液T，200納克的DNA，補(bǔ)水至10微升，30℃酶切過(guò)夜；(2)2.5單位的XcmI酶、1微升的緩沖液N，200納克的DNA，補(bǔ)水至10微升，37℃酶切過(guò)夜。SmaI購(gòu)自大連寶生物公司，XcmI購(gòu)自NEB公司。通過(guò)上述方法鑒定的質(zhì)粒命名為pG7X。
7.質(zhì)粒pG7X序列測(cè)定3018堿基對(duì)的質(zhì)粒pG7X的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4，其多克隆位點(diǎn)的序列見(jiàn)圖5。
本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒pG7X具有如下特點(diǎn)1)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的氨芐青霉素抗性基因，便于用氨芐青霉素對(duì)重組體進(jìn)行篩選(見(jiàn)圖1)。
2)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的高拷貝特性(見(jiàn)圖1)，有利于從大腸桿菌中提取大量質(zhì)粒DNA。
3)pG7X大小僅為3018堿基對(duì)(見(jiàn)圖4)，比較小，便于進(jìn)行DNA操作。
4)pG7X的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T7、SP6、M13通用序列(見(jiàn)圖4)，因此，對(duì)在多克隆位點(diǎn)插入的外源DNA進(jìn)行序列測(cè)定有廣泛的通用引物供選擇。
5)pG7X的lacZ基因長(zhǎng)度雖增加到384堿基對(duì)，但讀碼框架沒(méi)有改變(見(jiàn)圖4)，不改變應(yīng)用5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷對(duì)重組體進(jìn)行藍(lán)白斑篩選的特性。
6)pG7X保留了pGEM7Zf(+)多克隆位點(diǎn)的大部分酶切識(shí)別序列，便于與多種限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段實(shí)現(xiàn)連接。與pGEM7Zf(+)相比，少了SmaI位點(diǎn)，多了2個(gè)XcmI位點(diǎn)(見(jiàn)圖5)。
7)pG7X保留了pGEM7Zf(+)的T7、SP6啟動(dòng)子元件，且這些元件位于多克隆位點(diǎn)兩側(cè)(見(jiàn)圖1)，因此可正反兩方向體外轉(zhuǎn)錄目的基因。
8)XcmI是一稀有限制性?xún)?nèi)切酶，其識(shí)別序列為CCANNNNN*NNNNTGGG，中間9個(gè)核苷酸對(duì)XcmI的酶切特異性及酶切效率沒(méi)有影響。pG7X在pGEM7Zf(+)多克隆位點(diǎn)里插入了2個(gè)XcmI識(shí)別序列，因此可方便地用XcmI酶切以獲取兩端都是3′dT粘性末端的DNA片段(見(jiàn)圖6)，所以，可方便地獲得穩(wěn)定的T載體。
用XcmI酶切質(zhì)粒pG7X制備的T載體，命名為pG7X-T，其制備方法如下用XcmI酶切pG7X質(zhì)粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為T(mén)載體，命名為pG7X-T(圖6)。酶切體系參照步驟6，但體積增大到50微升。
T載體pG7X-T的使用方法如下將制備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的DNA片段按摩爾比1∶3混合，加入T4 DNA連接酶，于12℃連接；用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣處理法將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨芐青霉素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，白色菌落含有由pG7X-T與插入DNA形成的重組質(zhì)粒。
載體pG7X-T可以在分子生物學(xué)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、生物工程和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明制備T載體的成本在60元/微克以下，僅為市場(chǎng)價(jià)格的十分之一，而且操作簡(jiǎn)便、性能穩(wěn)定、重組率高，既適合研究室內(nèi)自制，也可應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)。
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖1質(zhì)粒pGEM7Zf(+)圖譜圖2 pGEM7Zf(+)的PCR擴(kuò)增圖3左圖為質(zhì)粒pG7X的SmaI酶切結(jié)果，右圖為pG7X的XcmI酶切結(jié)果。
圖4質(zhì)粒pG7X的全長(zhǎng)序列圖5質(zhì)粒pG7X多克隆位點(diǎn)的DNA序列圖6利用pG7X產(chǎn)生T載體示意圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一T載體pG7X-T的制備1.質(zhì)粒pGEM7Zf(+)的PCR擴(kuò)增及HindIII酶切根據(jù)pGEM7Zf(+)序列(圖1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物pG7X-F2和pG7X-R2，引物的5′端分別插入HindIII(單線處)和XcmI(波線處)識(shí)別位點(diǎn)。引物序列為pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt以質(zhì)粒pGEM7Zf(+)DNA為模板，pG7X-F2和pG7X-R2為引物，在大連寶生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。20微升擴(kuò)增體系中，含6皮摩爾的pG7X-F2，6皮摩爾的pG7X-R2，5納克的pGEM7Zf(+)，0.5單位的Ex TaqDNA聚合酶，2.0微升的Ex-緩沖液，1.6微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)；反應(yīng)循環(huán)為94℃下預(yù)熱5分鐘后，經(jīng)35個(gè)反應(yīng)循環(huán)(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保溫7分鐘，最后保存在4℃。大約3千堿基對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，置于37℃進(jìn)行HindIII酶切。酶切體系為2.8微克的PCR產(chǎn)物，23微升的緩沖液，120單位的HindIII，補(bǔ)水至230微升。酶切產(chǎn)物通過(guò)0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段DNA。
2.HindIII酶切產(chǎn)物的環(huán)化回收的DNA酶切片段加入到含T4 DNA連接酶的溶液中，12℃保溫過(guò)夜，進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化。10微升連接體系為240納克的DNA片段，1微升的緩沖液，350單位的T4DNA連接酶。
3.連接DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣處理法制備E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，然后涂于含50微克/毫升氨芐青霉素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，選取藍(lán)色菌落。
4.菌落的PCR篩選隨機(jī)挑選一定數(shù)目的藍(lán)色菌落，以pG7X-F2/pG7X-R2為引物進(jìn)行菌落PCR。15微升擴(kuò)增體系中，含4.5皮摩爾的pG7X-F2，4.5皮摩爾的pG7X-R2，0.5單位的rTaq DNA聚合酶，1.5微升的rTaq-緩沖液、1.2微升的dNTPs(每種dNTP的濃度為2.5毫摩爾/升)。反應(yīng)循環(huán)為94℃預(yù)熱10分鐘后，經(jīng)35個(gè)反應(yīng)循環(huán)(94℃ 40秒，60℃ 32秒，72℃ 200秒)，然后在72℃下保溫7分鐘，最后保存在4℃，通過(guò)瓊脂糖電泳篩選含有3千堿基對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性菌落。
5.陽(yáng)性菌的進(jìn)一步篩選和鑒定將上一步篩選得到的陽(yáng)性菌分別劃線挑選單菌落，接種于10毫升含50微克/毫升氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，方法同步驟4。
6.用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和XcmI酶切鑒定上一步提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)產(chǎn)生3千堿基對(duì)DNA片段，見(jiàn)圖3M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物λ-EcoT14I digest，1、2、3及4為不同的克隆。酶切體系(1)5單位的SmaI酶，1微升的牛血清白蛋白，1微升的緩沖液T，200納克的DNA，補(bǔ)水至10微升，30℃酶切過(guò)夜；(2)2.5單位的XcmI酶、1微升的緩沖液N，200納克的DNA，補(bǔ)水至10微升，37℃酶切過(guò)夜。SmaI購(gòu)自大連寶生物公司，XcmI購(gòu)自NEB公司。通過(guò)上述方法鑒定的質(zhì)粒命名為pG7X。
7.質(zhì)粒pG7X序列測(cè)定3018堿基對(duì)的質(zhì)粒pG7X的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4，其多克隆位點(diǎn)的序列見(jiàn)圖5。
8.XcmI酶切制備T載體用XcmI酶切pG7X質(zhì)粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為T(mén)載體，命名為pG7X-T。見(jiàn)圖6。酶切體系參照步驟6，但體積增大到50微升。
實(shí)施例二T載體pG7X-T的性能檢驗(yàn)將制備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的插入DNA(Control Insert DNA，購(gòu)自大連寶生物公司)按1∶3的摩爾比混合，加入T4 DNA連接酶，于12℃連接。用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣處理法將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨芐青霉素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，白色菌落含有由pG7X與插入DNA形成的重組質(zhì)粒，藍(lán)色菌落中的質(zhì)粒不含有插入DNA。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算白斑率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白斑率平均為94.4％。
實(shí)施例三T載體pG7X-T的應(yīng)用用實(shí)施例二中篩選到的、白斑率最高的陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶XcmI酶切，通過(guò)0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段，即為所需T載體pG7X-T。T載體pG7X-T與PCR擴(kuò)增的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Zeta類(lèi)基因——AtGSTZ基因DNA(Chen D F，Kawarasaki Y，Nakano H，et al.JBiosci Bioeng，2003，95594-600)，按1∶3的摩爾比混合，加入T4 DNA連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算白斑率，白斑率平均為88.8％。對(duì)白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，檢查是否插入了AtGSTZ基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性重組率為95.6％。
SEQUENCE LISTING<110>南開(kāi)大學(xué)<120>用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法<130>041025<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2989<212>DNA<213>人工序列<220>
<221> misc_feature<222>(1)..(2989)<223>
<400>1agactgggga tccggagagc tcccaacgcg ttggatgcat agcttgagta ttctatagtg 60tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 120gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 180atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 240cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 300tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 360agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 420aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 480gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 540tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 600cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 660ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 720cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 780atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 840agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 900gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 960gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg1020
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<223>
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<221>primer_bind<222>(1)..(48)<223>
<400>3gaacaagctt attcccagtc aagacctggg gtaccgaatt cctcgagt 48
權(quán)利要求
1.用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，該載體DNA序列如下0001 GACTGGGGA TCCGGAGAGC TCCCAACGCG TTGGATGCAT AGCTTGAGTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT AGCTTGGCGT AATCATGGTCTCTGACCCCT AGGCCTCTCG AGGGTTGCGC AACCTACGTA TCGAACTCAT AAGATATCAC AGTGGATTTA TCGAACCGCA TTAGTACCAG0091 ATAGCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTATATCGACAAA GGACACACTT TAACAATAGG CGAGTGTTAA GGTGTGTTGT ATGCTCGGCC TTCGTATTTC ACATTTCGGA CCCCACGGAT0181 ATGAGTGAGC TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC CAGCTGCATT AATGAATCGGTACTCACTCG ATTGAGTGTA ATTAACGCAA CGCGAGTGAC GGGCGAAAGG TCAGCCCTTT GGACAGCACG GTCGACGTAA TTACTTAGCC0271 CCAACGCGCG GGGAGAGGCG GTTTGCGTAT TGGGCGCTCT TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCGGGTTGCGCGC CCCTCTCCGC CAAACGCATA ACCCGCGAGA AGGCGAAGGA GCGAGTGACT GAGCGACGCG AGCCAGCAAG CCGACGCCGC0361 AGCGGTATCA GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCAA AAGGCCAGCATCGCCATAGT CGAGTGAGTT TCCGCCATTA TGCCAATAGG TGTCTTAGTC CCCTATTGCG TCCTTTCTTG TACACTCGTT TTCCGGTCGT0451 AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAGTTTCCGGTCC TTGGCATTTT TCCGGCGCAA CGACCGCAAA AAGGTATCCG AGGCGGGGGG ACTGCTCGTA GTGTTTTTAG CTGCGAGTTC0541 TCAGAGGTGG CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC TCTCCTGTTC CGACCCTGCCAGTCTCCACC GCTTTGGGCT GTCCTGATAT TTCTATGGTC CGCAAAGGGG GACCTTCGAG GGAGCACGCG AGAGGACAAG GCTGGGACGG0631 GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC GTGGCGCTTT CTCATAGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGTCGAATGGCCT ATGGACAGGC GGAAAGAGGG AAGCCCTTCG CACCGCGAAA GAGTATCGAG TGCGACATCC ATAGAGTCAA GCCACATCCA0721 CGTTCGCTCC AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC TATCGTCTTG AGTCCAACCCGCAAGCGAGG TTCGACCCGA CACACGTGCT TGGGGGGCAA GTCGGGCTGG CGACGCGGAA TAGGCCATTG ATAGCAGAAC TCAGGTTGGG0811 GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAACCATTCTGTG CTGAATAGCG GTGACCGTCG 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2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，根據(jù)質(zhì)粒pGEM7Zf(+)的序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物——pG7X-F2和pG7X-R2，其序列如下pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，兩條引物的5′-端分別插入限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和XcmI識(shí)別位點(diǎn)，其位點(diǎn)分別用單線和波線標(biāo)示如下pG7X-F2gaataagcttgttcccaggtcaagactggggatccggagagctcccapG7X-R2gaacaagcttattcccagtcaagacctggggtaccgaattcctcgagt
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，以pGEM7Zf(+)DNA為模板、pG7X-F2和pG7X-R2為引物構(gòu)建的新質(zhì)粒，命名為pG7X，其步驟和方法如下1)質(zhì)粒pGEM7Zf(+)的PCR擴(kuò)增及HindIII酶切2)HindIII酶切產(chǎn)物的環(huán)化3)連接DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌4)菌落的PCR篩選5)陽(yáng)性菌的進(jìn)一步篩選和鑒定6)用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和XcmI酶切鑒定7)質(zhì)粒pG7X序列測(cè)定
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，用XcmI酶切質(zhì)粒pG7X制備的T載體，命名為pG7X-T，其制備方法如下12.5單位的XcmI酶、5微升的緩沖液N，1微克的pG7X DNA，補(bǔ)水至50微升，37℃酶切過(guò)夜后0.7％瓊脂糖凝膠電泳回收大片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，T載體pG7X-T的使用方法如下將制備的T載體pG7X-T與帶有dA尾的DNA片段按摩爾比1∶3混合，加入T4DNA連接酶，于12℃連接；用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣處理法將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，然后涂于含50微克/毫升氨芐青霉素，表面均勻地附加50微升的20毫克/毫升的5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和5微升的100毫摩爾/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，白色菌落含有由pG7X-T與插入DNA形成的重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于T-A克隆的pG7X-T載體及其制備方法，其特征在于，T載體pG7X-T在分子生物學(xué)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于T－A克隆的pG7X－T載體及其制備方法，屬于重組DNA技術(shù)的載體構(gòu)建領(lǐng)域，其技術(shù)方案是利用自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)質(zhì)粒pGEM7Zf(+)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HindIII消化、自連、轉(zhuǎn)化、篩選等過(guò)程，獲得新質(zhì)粒pG7X。相比pGEM7Zf(+)而言，pG7X增加了2個(gè)XcmI識(shí)別位點(diǎn)，可用于制備T－A克隆載體。用XcmI酶切后得到的兩端帶有3′dT粘性末端的DNA即為T(mén)載體，命名為pG7X－T。該T載體與帶有dA末端DNA片段或PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，陽(yáng)性重組率達(dá)95％以上。利用本發(fā)明制備T載體的成本在60元/微克以下，僅為市場(chǎng)價(jià)格的十分之一，而且操作簡(jiǎn)便、性能穩(wěn)定、重組率高。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1614018SQ20041007238
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月26日
發(fā)明者陳德富, 楊鵬, 陳喜文 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)