專利名稱：無機(jī)磷的測定方法及其診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定無機(jī)磷的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)部的磷元素約有87％存在于骨骼中，血液中的磷與骨骼中的磷保持動態(tài)平衡關(guān)系。另一方面，血液中鈣和磷的濃度之間有一定關(guān)系，兩者的乘積保持在一定范圍之內(nèi)，以毫克為單位，大約每100毫升血漿中鈣和磷的含量之積為35～40。正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。當(dāng)上述乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織；大于70時，可發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化；小于35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。一般地，可以通過維生素D、甲狀旁腺激素、降鈣素等來調(diào)節(jié)血漿中鈣和磷的濃度。
目前，人體的含磷總量還不能直接測定，大多是檢測血漿或血清中磷酸根離子濃度來反映。由于H2PO4-在血液等自然條件下最能穩(wěn)定存在，是無機(jī)磷的主要存在形式，因而測定H2PO4-的濃度便能間接代表或推知無機(jī)磷的總量。常用的檢測方法有磷鉬酸還原法/非還原法、染料結(jié)合法、酶法、同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法、流動注射分析法等等。其中，決定性的方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，中等實驗室推薦使用的常規(guī)方法是磷鉬酸比色法。
磷鉬酸還原法又分“無蛋白血濾液法”和“不去蛋白法”，前者需將血液先去蛋白，后者需在試劑中加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑的種類很多，性能比較穩(wěn)定的還原劑有硫酸亞鐵、硫酸亞鐵銨、硫酸肼、米吐爾等，表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷鉬酸非還原法又稱“直接紫外法”，是在340nm或325nm波長直接測定磷鉬酸雜聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸、溶血、脂濁血清在340nm有吸收，必須做標(biāo)本空白，否則結(jié)果偏高。
相比于其它檢測方法，酶法以其選擇性好、靈敏度高、可實現(xiàn)自動化分析等優(yōu)點而備受人們青睞，用酶法測定無機(jī)磷含量既是目前人們的研究熱點，也是將來的發(fā)展趨勢。但是，采用不同的試劑和測試路線，檢測的靈敏度、檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性會有很大的差別，直接影響到該方法的使用與推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶法測定無機(jī)磷含量的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的無機(jī)磷診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀對血漿、血清等樣品中無機(jī)磷的含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測定，以便推廣使用該檢測方法和診斷試劑，使本領(lǐng)域內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗測試手段得到豐富和發(fā)展。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種測定無機(jī)磷的方法，通過以下步驟進(jìn)行首先，將血漿、血清等需要測定的樣品與含有丙酮酸、丙酮酸脫氫酶、四唑鹽化物和氧化型mPMS(吩嗪硫酸甲酯，Phenazine Methosulfate)的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
然后，將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長380～800nm的吸光度的上升幅度，進(jìn)而測算出樣品中無機(jī)磷的含量。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時間控制在2～30分鐘，檢測時設(shè)定副波長在505～900nm以上。
實現(xiàn)本發(fā)明方法測定血漿、血清等樣品中無機(jī)磷含量的診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液 40～200mmol/l，丙酮酸 1～20mmol/l，氧化型mPMS 0.1～5mmol/l，四唑鹽化物 0.1～5mmol/l，丙酮酸脫氫酶 500～50000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積10～80％。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合，配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分丙酮酸、四唑鹽化物等可以放在試劑II，試劑II中的氧化型mPMS、丙酮酸脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
為使試劑更穩(wěn)定，還可以配制成三劑，比如


與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的丙酮酸可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的四唑鹽化物可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的氧化型mPMS、丙酮酸脫氫酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
上述診斷試劑盒的成分當(dāng)中，四唑鹽化物可以是以下11種物質(zhì)之一①MTT，噻唑蘭，Thiazolyl blue，3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide②INT，碘硝基氯化四氮唑，Iodonitrotetrazolium chloride，2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride③NTC，NEO四氮唑，Neotetrazolium chloride，2，2′，5，5′Tetraphenyl-3，3′-[p-diphenylene]ditetrazolium chloride④NBT，氯化硝基四氮唑蘭，Nitro Blue tetrazolium chloride⑤TNBT，四硝基四氮唑，Tetranitro tetrazolium blue chloride，2，2′，5，5′-Tetra(4-nitrophenyl)-3，3′dimethoxy-4，4′-biphenylene⑥BT，四氮唑蘭，Tetrazolium Blue chloride，2，2′，5，5′-Tetraphenyl-3，3′-(3，3′dimethoxy-4，4′-biphenylene)-2H，2H′-ditetrazolium chloride⑦TTC，三苯基四氮唑，Triphenyltetrazolium chloride2，3，5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride⑧WST 1，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-苯二磺酸)-2H-四唑單鈉鹽，2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium.Na-salt⑨WST 3，2-(4-碘苯基)-3-(2，4-雙硝基苯基)-5-(2，4-苯二磺酸)-2H-四唑單鈉鹽，2-(4-Iodophenyl)-3-(2，4-dinitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium-Na-salt⑩WST 4，2-苯并噻唑-3-(4-羧基-2-甲氧基苯)-5-[4-(2-磺酸基乙氨基甲酰)苯基]-2H-四氮唑，2-Benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazoliolium salt(11)XTT，鈉3，3′-{-[(苯氨基)羰基]-3，4-四唑}-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸，Sodium3，3′-{-[(Phenylamino)carbonyl]-3，4-Tetrazolium}-Bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid hydrate上述診斷試劑盒的成分當(dāng)中，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內(nèi)，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(ImidazoIe-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”或者“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”中的至少一種，但選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內(nèi))。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的無機(jī)磷診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液(80～120mmol/l，丙酮酸3～10mmol/l，氧化型mPMS0.5～2mmol/l，四唑鹽化物0.5～4mmol/l，丙酮酸脫氫酶 5000～15000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 20～50％。
本發(fā)明利用丙酮酸脫氫酶在血漿、血清等樣品中的無機(jī)磷的激活下與丙酮酸作用，將氧化型mPMS反應(yīng)成還原型mPMS，還原型mPMS再將無色的四唑鹽化物變成有顏色的甲臢染料，由于不同染料在380～800nm之間的吸收波長不同，因此，測量甲臢染料含量的高低便可以直接反映出被測樣品中無機(jī)磷含量的多小。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點，通過將無色的四唑鹽化物變成有顏色的甲臢染料，定量反映出被測樣品中無機(jī)磷的含量，測試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上便可檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，主要用于測定人體和其它動物體內(nèi)血磷的含量，也可以結(jié)合稀釋、濃縮等輔助手段來測定其它樣品中無機(jī)磷的含量；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)無機(jī)磷診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，存在于其中的酶的三維空間結(jié)構(gòu)保持完整，很好地保證了應(yīng)用測試效果。做成雙劑或者三劑以后，能夠進(jìn)一步減少各種成分之間的交叉影響，提高試劑的穩(wěn)定性，便于長期儲存。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制血清中無機(jī)磷診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液80mmol/l，丙酮酸3mmol/l，氧化型mPMS0.5mmol/l，INT(四唑鹽化物) 0.5mmol/l，丙酮酸脫氫酶 5000U/l，乙二醇50％(占試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時間10分鐘、測試主波長490～500nm、測試副波長600nm以上，被測樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(吸光度上升，下同)。
加入血清樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄490～500nm吸光度的上升情況。一共檢測讀點31次，大約每隔20秒記錄一次數(shù)據(jù)，根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出血清樣品中無機(jī)磷的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配制血清中無機(jī)磷診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，丙酮酸 7mmol/l，NBT(四唑鹽化物)2mmol/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，氧化型mPMS 1mmol/l，丙酮酸脫氫酶 10000U/l，乙二醇 50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度30℃、反應(yīng)時間15分鐘、測試主波長546nm、測試副波長660nm以上，被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄546nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出血清樣品中無機(jī)磷的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實施例三(三劑)按以下成分和用量配制血清中無機(jī)磷診斷試劑盒試劑I——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，丙酮酸10mmol/l，丙二醇20mmol/l；試劑II——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，WST1(四唑鹽化物) 4mmol/l，丙二醇50％(占試劑II總體積)；試劑III——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，氧化型mPMS2mmol/l，丙酮酸脫氫酶 15000U/l，乙二醇50％(占試劑III總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度25℃、反應(yīng)時間20分鐘、測試主波長470nm、測試副波長546nm以上，被測樣品與試劑I、試劑II和試劑III的總體積之比為1∶25，試劑I、試劑II和試劑III的用量為8∶1∶1，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I、試劑II，5分鐘之后加入試劑III，它們在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄470nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出血清樣品中無機(jī)磷的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實施例四(雙劑優(yōu)選例)
按以下成分和用量配制血磷診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩沖液 100mmol/l，丙酮酸5mmol/l，XTT(四唑鹽化物) 2mmol/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——Tris-HCl緩沖液 100mmol/l，氧化型mPMS1mmol/l，丙酮酸脫氫酶 12000U/l，甘油 50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時間10分鐘、測試主波長450～480nm、測試副波長550nm以上，被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向為正反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動混勻，發(fā)生以下原理性反應(yīng)
檢測、記錄450～480nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算出血清樣品中無機(jī)磷的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器，測定出血漿、血清等樣品中無機(jī)磷的含量，測試靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。而且，本發(fā)明提供的無機(jī)磷診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，長時間存放之后仍然能夠準(zhǔn)確檢測各種類型樣品中的無機(jī)磷含量。
權(quán)利要求
1.一種測定無機(jī)磷的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有丙酮酸、丙酮酸脫氫酶、四唑鹽化物和氧化型吩嗪硫酸甲酯mPMS的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長380～800nm的吸光度的上升幅度，測算出樣品中無機(jī)磷的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定無機(jī)磷的方法，其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定無機(jī)磷的方法，其特征在于反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時間控制在2～30分鐘，檢測時設(shè)定副波長在505～900nm以上。
4.一種無機(jī)磷診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液 40～200mmol/l，丙酮酸 1～20mmol/l，氧化型mPMS 0.1～5mmol/l，四唑鹽化物 0.1～5mmol/l，丙酮酸脫氫酶 500～50000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無機(jī)磷診斷試劑盒，其特征在于所述四唑鹽化物為以下11種物質(zhì)之一，噻唑蘭、碘硝基氯化四氮唑、NEO四氮唑、氯化硝基四氮唑蘭、四硝基四氮唑、四氮唑蘭、三苯基四氮唑、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-苯二磺酸)-2H-四唑單鈉鹽、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-雙硝基苯基)-5-(2，4-苯二磺酸)-2H-四唑單鈉鹽、2-苯并噻唑-3-(4-羧基-2-甲氧基苯)-5-[4-(2-磺酸基乙氨基甲酰)苯基]-2H-四氮唑以及鈉3，3′-{-[(苯氨基)羰基]-3，4-四唑}-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的無機(jī)磷診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無機(jī)磷診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”或者“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的無機(jī)磷診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
9.權(quán)利要求4～8中任意一項無機(jī)磷診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定無機(jī)磷的方法及其診斷試劑盒。利用丙酮酸脫氫酶在血漿、血清等樣品中的無機(jī)磷的激活下與丙酮酸作用，將氧化型mPMS反應(yīng)成還原型mPMS，還原型mPMS再將無色的四唑鹽化物變成有顏色的甲臢染料，檢測反應(yīng)前后主波長380～800nm吸光度的上升幅度，便可測算出樣品中無機(jī)磷的含量。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。將診斷試劑盒制成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性，便于長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/32GK1778952SQ20041006557
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司