專利名稱：Alb的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別是涉及一種IL-18基因的重組及生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
IL-18是單核因子，有兩種存在形式即前體(ProIL-18)和成熟肽，ProIL-18的1-35氨基酸殘基為先導序列。在其分泌細胞中，caspase-1酶識別35位天冬氨酸殘基，酶切該氨基酸殘基構(gòu)成的肽鍵，形成成熟IL-18并分泌出胞，發(fā)揮生物學作用。文獻報道IL-18可作為腫瘤疫苗的免疫佐劑，可能應(yīng)用于癌癥的生物治療。由于腫瘤細胞中大多缺乏caspas-1，因此，轉(zhuǎn)染IL-18的腫瘤瘤苗難以起到預(yù)期作用。
技術(shù)內(nèi)容在IL-18MAT序列前加上ALBSIN序列，IL-18MAT直接通過信號肽途徑分泌到胞外，即分泌誘導針對腫瘤免疫應(yīng)答的IL-18MAT雜交細胞因子。
本發(fā)明重組的核苷酸/氨基酸片段序列是cccgcaagctt atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt ctt ttt ctc tttMK W VT F I S L LF L F
agc tcg gct tat tcc tac ttt ggc aag ctt gaa tct aaa tta tca gtcS S A YS Y FG K L E S K L SVata aga aat ttg aat gac caa gtt ctc ttc att gac caa gga aat cggI R N LN D QV L FI D Q G N Rcct cta ttt gaa gat atg act gat tct gac tgt aga gat aat gcaP LF E D M T D S D C R D N Accc cgg acc ata ttt att ata agt atg tat aaa gat agc cag cct agaPR TI F I I S M YK D S Q P Rggt atg gct gta act atc tct gtg aag tgt gag aaa att tca act ctcGMA V T IS V K C EK I S TLtcc tgt gag aac aaa att att tcc ttt aag gaa atg aat cct cct gatS C EN KI I S F K EM N P P Daac atc aag gat aca aaa agt gac atc ata ttc ttt cag aga agt gtcN I KD T K S DI IF F Q R S Vcca gga cat gat aat aag atg caa ttt gaa tct tca tca tac gaa ggaP G HD N KM Q F ES S S Y E Gtac ttt cta gct tgt gaa aaa gag aga gac ctt ttt aaa ctc att ttgY F LA C E KE R D L F K L I Laaa aaa gag gat gaa ttg ggg gat aga tct ata atg ttc act gtt caaK K ED E L G DR S I M F T VQaac gaa gac tga gggccctatN E D stop本發(fā)明ALBSIN/IL-18MAT雜交細胞因子的制備方法是從人的基因組DNA擴增ALBSIN序列；再從人IL-18真核表達質(zhì)粒中獲得IL-18MAT序列，然后，通過非對稱PCR技術(shù)得到ALBSIN編碼區(qū)的反義鏈和IL-18MAT肽正鏈，最后，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)產(chǎn)生具有ALBSIN與IL-18MAT的雜交編碼序列，產(chǎn)物雙酶切后與質(zhì)粒pCDNA3連接構(gòu)建雜交IL-18的表達質(zhì)粒并測序。
本發(fā)明的特點和積極效果在于在IL-18MAT序列前加上ALBSIN序列，可以使細胞IL-18的分泌不受caspas-1的限制，而是通過信號肽的分泌途徑出胞，使得IL-18在發(fā)揮抗腫瘤的免疫佐劑作用時，不再拘泥與能表達caspas-1的細胞，同時也提高了IL-18的分泌量。ELISA分析證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞系，可測出高水平人IL-18表達。
具體實施例方式一、IL-18的重組1、PCR引物設(shè)計與合成共設(shè)計2對引物。
克隆引物對①5’-CCCGCAAGCTTATGAAGTGGGTAACCTT-3’(含HindIII酶切位點及起始密碼子)②5’-ATTGGGCCCCTAGTCTTCGTTTTGAACA-3’(含ApaI酶切位點及終止密碼子)雜交引物對用于兩個靶序列拼接③5’-CTTATTCCTACTTTGGCAAGCTTGAA-3’④5’-TGCCAAAGTAGGAATAAGCCGAGCTAAAGA-3’。
下劃線為兩種引物5’端互補序列。
2、基因組DNA的提取按常規(guī)由人外周血單個核細胞提取基因組DNA。純度和濃度采用分光光度計法測量。DNA濃度為328.5μg/ml。
3、PCR擴增(1)對稱PCR以基因DNA為模板，加入引物①④，擴增ALBSIN序列；上述反應(yīng)體系中再加入dNTP2l、Tag聚合酶2.5U、10×Tag酶反應(yīng)緩沖液5l、Mg2+(25mM/L)9μl、加雙蒸水至50l。循環(huán)擴增程序為變性94℃45s、復(fù)性57℃15s、延伸72℃20s，共30個循環(huán)，充分延伸72℃5min。瓊脂糖凝膠，電泳鑒定PCR產(chǎn)物后用DNA純化試劑盒回收。
以人IL-18重組表達質(zhì)粒為模板，加入引物②③，擴增IL-18MAT序列，上述反應(yīng)體系中再加入dNTP3l、Tag聚合酶2.5U、10×Tag酶反應(yīng)緩沖液5l、Mg2+(25mM/L)5.5μl、加雙蒸水至50l。循環(huán)擴增程序為變性94℃45s、復(fù)性57℃15s、延伸72℃45s，共30個循環(huán)，充分延伸72℃5min。瓊脂糖凝膠，電泳鑒定PCR產(chǎn)物后用DNA純化試劑盒回收。
(2)非對稱PCR(Asymmetric PCR)模板系2μl對稱PCR產(chǎn)物，并使用單一引物①或④進行非對稱PCR。循環(huán)擴增程序為變性94℃45s、復(fù)性57℃15s、延伸72℃60s，共20個循環(huán)，充分延伸72℃5min。產(chǎn)物鑒定采用非變性連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度8％。
(3)SOE-PCRALBSIN的對稱PCR產(chǎn)物與IL-18MAT的非對稱PCR產(chǎn)物以1∶100比例混合，作為SOE-PCR的模板，加入引物①②。上述反應(yīng)體系中再加入10×PCR buffer(無Mg2+)5μl，d NTP 3μl，Mg2+(25mM/L)10μl，TaqEx酶0.5μl。首次循環(huán)的條件為變性94℃45s；退火37℃10min；延伸72℃2min以便重疊延伸。繼而變性94℃45s；退火57℃15s；延伸72℃60s的條件下作30個循環(huán)。
二、構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3-IL-18hyb1、雙酶切反應(yīng)用HindIII和ApaI分別制備有粘性末端的IL-18重組基因和線性載體pcDNA3。
2、DNA片段的連接反應(yīng)體系中IL-18重組基因和線性載體pcDNA3的體積比為1∶15。16℃，連接12-16小時。
3、雜交IL-18的鑒定(1)PCR鑒定以pcDNA3-IL-18hyb為模板，分別用引物①④、引物②③、引物①②做三組PCR。并設(shè)立兩個對照，分別以基因組DNA和人IL-18重組表達質(zhì)粒為模板，相應(yīng)引物為①④和②③。瓊脂糖電泳鑒定。
(2)重組質(zhì)粒測序，(ABI PRISMTM377XL DNA sequencer)。鑒定結(jié)果顯示pcDNA3-IL-18hyb的插入序列為548bp。含有ALBSIN與IL-18MAT序列，并且無移碼。圖譜如下cccgcaagctt atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt ctt ttt ctc tttM K WV T F I S L L FLFagc tcg gct tat tcc tac ttt ggc aag ctt gaa tct aaa tta tcagtcS S A Y S Y F G K L ESKLSVata aga aat ttg aat gac caa gtt ctc ttc att gac caa gga aat cggI R N L N D Q V LF I D Q GNRcct cta ttt gaa gat atg act gat tct gac tgt aga gat aat gcaP L F E D M T D S D C R DN A ccc cgg acc ata ttt att ata agt atg tat aaa gat agc cagcct agaP R T I F I I SMY K D SQPRggt atg gct gta act atc tct gtg aag tgt gag aaa att tca act ctcG M A V TI S V KC E K ISTLtcc tgt gag aac aaa att att tcc ttt aag gaa atg aat cct cct gatS C E N K I I S F KE M N PPDaac atc aag gat aca aaa agt gac atc ata ttc ttt cag aga agt gtcN I K D T K SD I I F F Q RSVcca gga cat gat aat aag atg caa ttt gaa tct tca tca tac gaa ggaP G H D N K M Q F E S SS YEGtac ttt cta gct tgt gaa aaa gag aga gac ctt ttt aaa ctc att ttgY F L A C E K E R D LF K LILaaa aaa gag gat gaa ttg ggg gat aga tct ata atg ttc act gtt caaK K E D E L G D R SIM F TVQ
aac gaa gac tga gggccctatN E D stop三、真核表達質(zhì)粒的活性鑒定1、真核表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染(1)5×105的293、Vero或7721細胞分別接種于35cm培養(yǎng)皿，37℃，5％CO2的條件下24小時，使細胞貼壁生長。次日轉(zhuǎn)染前重懸在2ml無血清1640。
(2)10μg重組質(zhì)粒DNA加于2μl lipofectamine中，加無血清1640 200μl，室溫45分，加19％血清1640800μl后注入細胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24hrs。
2、人IL-18檢測100μl培養(yǎng)上清加于IL-18 ELISA試劑盒，常規(guī)操作，OD490表示培養(yǎng)上清的IL-18含量，此雜交IL-18克隆的轉(zhuǎn)染細胞目的基因表達和分泌量明顯高于野生型IL-18克隆。
本發(fā)明的意義在于(1)IL-18在誘導特異性T細胞免疫應(yīng)答的過程中起重要的免疫佐劑作用；腫瘤瘤苗轉(zhuǎn)染雜交IL-18克隆，通過產(chǎn)生高水平IL-18而激活針對腫瘤的殺傷性T細胞。(2)構(gòu)建腫瘤抗原特異性的基因疫苗，插入本發(fā)明建立的雜交IL-18序列做共表達，可能促進抗原特異性輔助T細胞增殖，從而促進腫瘤排斥。
權(quán)利要求
1.一種ALBSIN/IL-18MAT雜交細胞因子，其重組的核苷酸/氨基酸片段序列是cccgcaagctt atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt ctt ttt ctc tttM K W V T FI S L LF L Fagc tcg gct tat tcc tac ttt ggc aag ctt gaa tct aaa tta tca gtcSS A Y S Y FG K L E S K L S Vata aga aat ttg aat gac caa gtt ctc ttc att gac caa gga aat cggI R N LN D Q V L F I DQ G N Rcct cta ttt gaa gat atg act gat tct gac tgt aga gat aat gcaPL F E D M T D S D C R D N Accc cgg acc ata ttt att ata agt atg tat aaa gat agc cag cct agaPR TI F I I S M Y KD S Q PRggt atg gct gta act atc tct gtg aag tgt gag aaa att tca act ctcGM AV T IS V K C E KI S TLtcc tgt gag aac aaa att att tcc ttt aag gaa atg aat cct cct gatS C EN K I I SF K EM N P P Daac atc aag gat aca aaa agt gac atc ata ttc ttt cag aga agt gtcN I K DT K S DI I F FQ R S Vcca gga cat gat aat aag atg caa ttt gaa tct tca tca tac gaa ggaP GH D N K MQ F E S S S Y EGtac ttt cta gct tgt gaa aaa gag aga gac ctt ttt aaa ctc att ttgY F L A C E KER D L F K L I Laaa aaa gag gat gaa ttg ggg gat aga tct ata atg ttc act gtt caaK K E D E L GDR S I M F TVQaac gaa gac tga gggccctatN E D stop
2.一種ALBSIN/IL-18MAT雜交細胞因子的制備方法，其特征在于從人的基因組DNA擴增ALBSIN序列；再從人IL-18真核表達質(zhì)粒中獲得IL-18MAT序列，然后，通過非對稱PCR技術(shù)得到ALBSIN編碼區(qū)的反義鏈和IL-18MAT肽正鏈，最后，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)產(chǎn)生具有ALBSIN與IL-18MAT的雜交編碼序列，產(chǎn)物雙酶切后與質(zhì)粒pCDNA3連接構(gòu)建雜交IL-18的表達質(zhì)粒。
全文摘要
ALB
文檔編號C12N15/85GK1635120SQ20031011598
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月26日
發(fā)明者譚巖, 劉力華, 方艷秋, 段秀梅, 許淑芬, 姜艷芳, 宋艷, 劉玲麗, 時陽 申請人:吉林大學第一醫(yī)院