專利名稱：重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中高效表達(dá)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮抑素是哈佛大學(xué)O′Reilly MS在1997年的Cell雜志第88卷第2期277～285頁(yè)的文章中提出發(fā)現(xiàn)的一種新的血管生成抑制因子，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比較，內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制腫瘤相關(guān)的新血管的生成來(lái)阻斷腫瘤組織的血液供應(yīng)，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移作用。內(nèi)皮抑素抑制的靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞本身，所以有廣泛的抗癌譜，且反復(fù)用藥不會(huì)引起耐藥性的產(chǎn)生。目前內(nèi)皮抑素的原核表達(dá)主要采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，曲建在上海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2000年第六卷第四期338-342頁(yè)的文章中提出，利用pSQE載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行內(nèi)皮抑素的表達(dá)，重組蛋白的表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的30％。
應(yīng)用內(nèi)皮抑素治療腫瘤，療程長(zhǎng)且用量大。對(duì)于現(xiàn)在采用的內(nèi)皮抑素蛋白原核表達(dá)體系，重組蛋白的表達(dá)效率還有待提高，最多不超過(guò)菌體總蛋白的30％，難以滿足臨床應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)技術(shù)。
本發(fā)明通過(guò)建立合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件在較短的周期里表達(dá)出大量的重組蛋白質(zhì)，提高內(nèi)皮抑素的產(chǎn)量，以利于降低生產(chǎn)成本及產(chǎn)品價(jià)格，促進(jìn)內(nèi)皮抑素在臨床的普遍應(yīng)用。
本發(fā)明選擇IPTG誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)人內(nèi)皮抑素基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá)。從胚肝組織中提取肝細(xì)胞總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)獲得人內(nèi)皮抑素基因，將其插入原核表達(dá)載體pET28b中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBendo，然后轉(zhuǎn)化表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，采用新的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含60～90μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)液中，LB培養(yǎng)液的組分是1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl。在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，35～38℃，180～220rpm振蕩培養(yǎng)12～16h，然后將菌液接種于200mL、含60～90μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，36～38℃，200～250rpm振蕩培養(yǎng)2～3h，使菌液OD600nm在0.4～0.6，向菌液中加入終濃度為0.8～1.0m mol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在36～37℃下，180～200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～5h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的38％。
采用新的大腸桿菌表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的38％，高于已報(bào)道的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含90μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，38℃，220rpm振蕩培養(yǎng)14h，然后將菌液接種于200mL、含90μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，38℃，250rpm振蕩培養(yǎng)2.5h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為1.0m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。
實(shí)施例2；將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含60μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，35℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16h，然后將菌液接種于200mL、含60μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，36℃，200rpm振蕩培養(yǎng)2h，使菌液OD600nm在0.4。向菌液中加入終濃度為0.8m mol/L的IPTG，在36℃下，180rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。
實(shí)施例3將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后將菌液接種于200mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)2.5h，使菌液OD600nm在0.5。向菌液中加入終濃度為0.9m mol/L的IPTG，在36.5℃下，190rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。
實(shí)施例4將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)14h，然后將菌液接種于200mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，36℃，250rpm振蕩培養(yǎng)3h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為0.8m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。
實(shí)施例5將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含80μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，38℃，180rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后將菌液接種于200mL、含80μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)3h，使菌液OD600nm在0.6。向菌液中加入終濃度為1.0m mol/L的IPTG，在36℃下，190rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。
實(shí)施例6將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)16h，然后將菌液接種于200mL、含70μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，38℃，200rpm振蕩培養(yǎng)2.5h，使菌液OD600nm在0.5。向菌液中加入終濃度為0.9m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)技術(shù)，將重組質(zhì)粒pBendo轉(zhuǎn)化表達(dá)型宿主菌E.coli BL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21-Endo，接種于2mL、含60～90μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中，35～38℃，180～220rpm振蕩培養(yǎng)12～16h，然后將菌液接種于200mL、含60～90μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中，36～38℃，200～250rpm振蕩培養(yǎng)2～3h，使菌液OD600nm在0.4～0.6，向菌液中加入終濃度為0.8～1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在36～37℃下，180～200rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～5h誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的38％。
全文摘要
本發(fā)明屬于重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中高效表達(dá)的技術(shù)領(lǐng)域。將人內(nèi)皮抑素基因其插入原核表達(dá)載體pET28b中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBendo，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選出陽(yáng)性重組菌E.coli BL21－Endo，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，使菌液OD
文檔編號(hào)C12N1/21GK1546671SQ200310115938
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者王群, 王 群 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所