專利名稱：玉米肽、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量的功能玉米短肽產(chǎn)品、利用酶法直接降解玉米蛋白粉中的玉米蛋白制備該短肽的方法及該短肽產(chǎn)品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的最基本的生命物質(zhì)之一，它的片段稱為肽。具有特定生理功能的肽稱為生物活性肽，是生命活動(dòng)中起調(diào)節(jié)作用的一類重要生命物質(zhì)。近年來(lái)，國(guó)外的研究人員發(fā)現(xiàn)，從一些食物蛋白的酶水解產(chǎn)物中分離出的多種小肽具有調(diào)節(jié)人體的各種生理活性的作用。此外，長(zhǎng)久以來(lái)人們知道，食物蛋白要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的消化過(guò)程才能被人體吸收。然而，最近在醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)，小肽可由腸道直接吸收，而且吸收速度要比相同組成的游離氨基酸還快，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)開發(fā)肽類新型功能保健食品具有重要意義。
玉米肽是玉米蛋白經(jīng)過(guò)酶降解而獲得的多種小肽的混合物。玉米蛋白含有豐富的分支氨基酸。最近的研究發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸與機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)迅速恢復(fù)疲勞作用相關(guān)。分支氨基酸具有在肌肉中合成蛋白質(zhì)和抑制體蛋白分解的功能，而且，在非常狀況下可以直接向肌肉提供能量。此外，玉米蛋白還含有大量的丙氨酸，而這種氨基酸在乙醇代謝中起到有益的作用。臨床實(shí)驗(yàn)表明，玉米肽具有迅速清除血液中乙醇的作用。這無(wú)疑對(duì)保護(hù)肝臟以及減少因酒精中毒而引起的一些嚴(yán)重疾病是十分有益的。
玉米是我國(guó)最具優(yōu)勢(shì)的糧食資源之一，玉米蛋白粉是玉米淀粉加工的副產(chǎn)品，玉米中大約含有10％的玉米蛋白，目前主要用來(lái)加工飼料。本發(fā)明的主要目的是提供原料易得、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的制備低分子量玉米功能短肽的方法和相關(guān)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種低分子量的玉米功能短肽產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種原料易得、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的制備該玉米功能短肽產(chǎn)品的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該玉米功能短肽產(chǎn)品在食品、藥品及化妝品行業(yè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明以玉米蛋白粉為原料，它主要含有不溶于水的醇溶蛋白。本發(fā)明不是先從玉米蛋白粉中用有機(jī)溶劑提取醇溶蛋白，或者利用葡萄糖淀粉酶預(yù)降解玉米蛋白粉中淀粉，而是在酶反應(yīng)條件下，用酶直接處理玉米蛋白粉，同樣可以獲得低分子量玉米肽。這樣使玉米肽的生產(chǎn)工藝大大簡(jiǎn)化，明顯降低成本。
本發(fā)明涉及玉米蛋白粉原料的前處理，即堿洗或酸洗，目的是先除去玉米蛋白粉中的少量油脂。用酸堿而不用有機(jī)溶劑除油，可以避免后續(xù)處理有機(jī)溶劑，從而使生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)表征，本發(fā)明玉米肽產(chǎn)品具有如下特征(1)玉米肽干粉是一種淡黃色的粉末，分子量分布主要在1000以下，是含2-9氨基酸殘基的短肽混合物，用TNBS法[1]測(cè)定平均鏈長(zhǎng)4-5個(gè)氨基酸；(2)玉米肽在所有pH下都能溶解于水，玉米肽溶液呈淡黃色，對(duì)熱很穩(wěn)定；(3)玉米肽水溶液的粘度大小與它的濃度和溫度關(guān)系不大，在高濃度下，它的粘度沒有大的變化。
(4)氨基酸組成玉米肽產(chǎn)品中包含的氨基酸種類有天門東氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸。
制備上述玉米肽產(chǎn)品的步驟如下制備步驟中所用水均為去離子水。
1.原料預(yù)處理為除去原料中殘留的油脂和一些可溶性成分(如糖)，將市售玉米蛋白粉先過(guò)篩(60-80目)，粗顆粒經(jīng)粉碎再過(guò)篩；按固液比1∶8-1∶12加水，用鹽酸調(diào)pH至2.0-5.0或用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至30-60℃，攪拌20-30min，6000-9000rpm離心20-30min，去上清后，再按上述固液比加水，升溫至30-60℃，攪拌15-20min，6000-9000rpm離心20-30min，去除上清液，收集沉淀用于下步酶水解；2.酶水解按固液比1∶8-1∶12將步驟1中收集的沉淀與水混合，攪拌，用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至35℃-60℃，加酶液(40-100ml/1kg玉米蛋白粉)，開始水解反應(yīng)。在反應(yīng)的過(guò)程中，維持恒定的pH值。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解度(DH)達(dá)到10-30％，停止反應(yīng)；3.酶滅活步驟2結(jié)束后，快速升溫至95℃，保持15min使酶滅活。然后，溫度降至室溫，調(diào)pH至中性。12,000-15,000rpm，離心20-30min，上清液為玉米肽粗制液；4.精制(1)為除去粗制玉米肽液中少許殘留的油脂，使其過(guò)布氏漏斗；(2)玉米肽的精制是通過(guò)膜分離技術(shù)去掉粗制玉米肽液中的大分子片段完成的。膜上液回到酶解罐中再次水解；5.濃縮由步驟4中得到的過(guò)膜液，減壓濃縮至固型物含量35-40％；6.干燥精制的玉米肽液濃縮后，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉。
玉米肽生理活性實(shí)驗(yàn)一.玉米肽抗疲勞作用1.玉米肽抗疲勞作用的檢測(cè)方法(1)檢測(cè)動(dòng)物昆明種雄性小鼠，6-8周齡，體重18-22g。隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，以灌胃途徑給藥。實(shí)驗(yàn)組每天灌服玉米肽溶液，給藥劑量實(shí)驗(yàn)I組，250mg/kg體重；實(shí)驗(yàn)II組，500mg/kg體重；實(shí)驗(yàn)III組，1500mg/kg體重。每10g體重給藥0.2ml，對(duì)照組給同體積的蒸餾水。
(2)運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)，即負(fù)重游泳試驗(yàn)40只小鼠，隨機(jī)分成四組，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)I、II、III組。小鼠給藥25天后，將其置于游泳槽中游泳，水溫26±0.5℃，水深28cm，小鼠負(fù)重為體重的2％，記錄小鼠自由游泳從開始到死亡的時(shí)間。
(3)血乳酸濃度測(cè)定40只小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)I、II、III組。給藥25天后，讓小鼠在30±2℃水中游泳30min，泳前安靜時(shí)及泳后15min、50min各取尾血一次，用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定血乳酸含量。
(4)肝糖原含量測(cè)定40只小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)I、II、III組。實(shí)驗(yàn)第25天，處死小鼠，立即取出肝臟，用蒽酮比色法測(cè)定其糖原含量。
(5)血清尿素氮含量測(cè)定40只小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)I、II、III組。小鼠給藥25天，讓小鼠負(fù)重(體重的2％)在30±2℃水游泳30min，泳后90min，取尾血用二乙酰-硫氨尿比色法測(cè)定血尿素含量。
2.玉米肽抗疲勞作用的檢測(cè)結(jié)果(1)小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)由表3中的數(shù)據(jù)可見，玉米肽給藥組的動(dòng)物負(fù)重游泳時(shí)間與對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)，經(jīng)t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)I組游泳時(shí)間與對(duì)照組相比具有明顯差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)II、III組與對(duì)照組比較有較顯著差異(P＜0.01)。
表3玉米肽對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響(X±SD)組別 動(dòng)物數(shù)(只)游泳時(shí)間(min)對(duì)照組 10 79.64±12.24I 組 10 114.11±17.22*II 組 10 141.20±25.95**III 組 10 184.11±30.85**注與對(duì)照組比較*p＜0.05**p＜0.01(2)玉米肽對(duì)血乳酸濃度的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，實(shí)驗(yàn)第25天，小鼠運(yùn)動(dòng)后15min及50min血乳酸值明顯低于對(duì)照組，且具顯著差異。在本實(shí)驗(yàn)中，玉米肽實(shí)驗(yàn)組小鼠在運(yùn)動(dòng)后15分鐘血乳酸值明顯低于對(duì)照組，證明在這個(gè)期間，有氧代謝在供能中所占比例很高，所以產(chǎn)生的乳酸少，則酵解過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸不容易在肌肉中積累，從而可延緩疲勞的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中，玉米肽實(shí)驗(yàn)組小鼠在運(yùn)動(dòng)停止后50分鐘的血乳酸值明顯低于對(duì)照組，則表明在運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期，肌肉中過(guò)多的乳酸能夠迅速被清除，這意味著能夠較快清除疲勞。
表4 米肽對(duì)小鼠血乳酸的影響 (X±SD，mg/100ml)組別 運(yùn)動(dòng)前 運(yùn)動(dòng)停止后運(yùn)動(dòng)停止后(15min) (50min)對(duì)照組28.97±2.95 57.48±2.98 49.04±1.77I 組28.56±2.05 46.03±2.39**39.59±2.32**II 組27.29±1.94 37.47±2.18**29.84±2.10**III 組27.78±2.33 32.06±1.41**22.29±1.68**注與對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.01(3)玉米肽對(duì)小鼠肝糖原的影響表5中的數(shù)據(jù)表明，玉米肽給藥25天，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)I組小鼠肝糖原含量增加了24.46％(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)II組小鼠肝糖原含量增加了44.96％(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)III組小鼠肝糖原含量增加了71.94％(P＜0.01)。
表5玉米肽對(duì)小鼠肝糖原含量的影響(X±SD，g/100g組織)組 別 肝糖原含量對(duì)照組 2.78±0.30I 組 3.46±0.24*II 組 4.03±0.21**III 組 4.78±0.23**注與對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.01如果在運(yùn)動(dòng)中肝糖原及肌糖原耗竭，則糖異生作用受阻，血糖濃度降低，則會(huì)干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)而出現(xiàn)疲勞。本實(shí)驗(yàn)玉米肽實(shí)驗(yàn)組肝糖原比對(duì)照組明顯提高，說(shuō)明該藥能夠通過(guò)增加肝糖原儲(chǔ)備，維持運(yùn)動(dòng)時(shí)血糖水平，從而為機(jī)體提供更多的能量來(lái)達(dá)到抗疲勞的目的。
(4)玉米肽對(duì)血清尿素氮的影響由表6中的數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)第25天，玉米肽給藥組小鼠運(yùn)動(dòng)停止后90min，血尿素氮含量低于對(duì)照組，經(jīng)t檢驗(yàn)有明顯差異。
本實(shí)驗(yàn)中玉米肽組用小鼠游泳停止后90分時(shí)血尿素值與對(duì)照組比較，明顯低于對(duì)照組，這正是玉米肽使機(jī)體耐力增加，對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷適應(yīng)能力提高的一種表現(xiàn)，也是抗疲勞機(jī)理的又一個(gè)方面。
表6玉米肽對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)停止后90min血尿素含量的影響(X±SD，mol/L)組 別 小鼠運(yùn)動(dòng)停止后90min血尿素含量對(duì)照組 19.94±1.97I 組 17.15±1.22*II 組 16.20±1.23**III 組 14.86±1.46**注與對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.01上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所制備的玉米短肽具有明顯的緩解體力疲勞功能，可應(yīng)用于食品、藥品、保健品行業(yè)，生產(chǎn)具有抗疲勞作用的相關(guān)功能食品、保健品或藥品。該類產(chǎn)品適合長(zhǎng)時(shí)間學(xué)習(xí)或工作的人，長(zhǎng)時(shí)間開車或乘車的人以及從事體育運(yùn)動(dòng)或從事體力勞動(dòng)的人食用。特點(diǎn)是可以迅速消除疲勞，提高耐力以及補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。該產(chǎn)品覆蓋的人群面大。
二.玉米肽對(duì)大鼠血液中乙醇代謝及血漿中氨基酸含量的影響1.檢驗(yàn)方法Wistar雄性大鼠40只，每天喂動(dòng)物飼料及正常飲水兩周后，體重約190-220g，隨機(jī)分成五組，對(duì)照組、玉米肽(CP)組、丙氨酸(Ala)組、脯氨酸(Pro)組及谷氨酸(Glu)組，每組八只。以1ml/100g體重劑量灌胃給藥，對(duì)照組給15％(V/V)乙醇，CP組(EtOH/CP)、Ala組(EtOH/Ala)、Pro組(EtOH/Pro)、Glu組(EtOH/Glu)分別以1.0g/Kg體重的劑量溶于15％(V/V)乙醇中，以此劑量灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后30min、1h、6h于大鼠尾靜脈取血，用于乙醇代謝和血漿中氨基酸含量的分析。
(1)大鼠血漿中氨基酸分析在各組給藥前、給藥后30min、1h、6h分別取大鼠尾靜脈血0.2ml加入試管(含抗凝劑)中，再加入20％(W/W)磺基水楊酸使蛋白變性，離心(3000rpm，4℃，10min)，取上清，用Hitachi 835型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸濃度。
(2)給藥后大鼠血液中乙醇的含量測(cè)定在各組大鼠給藥后30min、1h、6h分別取大鼠尾靜脈血0.5ml與4ml0.33mol/L預(yù)冷的高氯酸混合，離心(3000rpm，4℃，10min)，取上清，分別用試劑盒測(cè)血液中的乙醇含量。
2.檢驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明是采用乙醇試劑盒來(lái)測(cè)定玉米肽對(duì)大鼠血液中乙醇代謝的影響，并與游離氨基酸Ala、Pro、Glu等進(jìn)行了比較。玉米肽對(duì)大鼠血液中乙醇代謝影響的檢測(cè)結(jié)果列于表7中。
表7 玉米肽(CP)及Ala、Pro、Glu對(duì)大鼠乙醇代謝的影響(X±SD)組別 乙醇含量(mg/L)30分鐘 1小時(shí) 6小時(shí)對(duì)照組 827.0±77.3 716.6±29.0 46.3±8.6CP 組 527.3±47.0***284.3±23.9***5.6±1.2***Ala 組 491.2±39.0***472.4±88.3***5.2±2.8***Pro 組 747.2±50.8*535.5±76.4***58.4±12.8*Glu 組 678.8±111.3**520.6±117.8***1.33±0.8***與對(duì)照組比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001由表7可以看出，各組在給藥后30分鐘血液中乙醇濃度均達(dá)到最大值，6小時(shí)以后基本代謝完畢。對(duì)照組給15％的乙醇30分鐘以后血液中乙醇濃度達(dá)到827.0±29.8mg/L。而CP組與對(duì)照組相比，給藥后30分鐘的血液中乙醇含量明顯低于對(duì)照組(p＜0.001)為527.25±47.0mg/L，比對(duì)照組降低了36.25％；以后乙醇濃度快速下降，到一小時(shí)后為284.3±23.9mg/L。與對(duì)照組同一時(shí)間比較血液中乙醇濃度降低了60.33％(p＜0.001)，說(shuō)明CP組在乙醇代謝中起了很好的清除作用。CP組與陽(yáng)性對(duì)照組Ala組、Pro組、Glu組比較，在給藥后30分鐘，除Ala組略低于CP組，Pro與Glu組的乙醇含量均高于CP組(Pro組p＜0.001，Glu組p＜0.01)，而在給藥后一小時(shí)，則Ala組、Pro組、Glu組的清除乙醇效果明顯不如CP組。乙醇濃度分別為472.4±88.3mg/L，535.5±76.4mg/L，520.6±117.8mg/L明顯高于CP組(p＜0.001)。給藥后6小時(shí)血液乙醇中基本代謝完全。因此，可以得出結(jié)論CP組具有加速血液中乙醇代謝速率的功效。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所制備的玉米短肽具有迅速調(diào)節(jié)機(jī)體乙醇代謝的功能，適合生產(chǎn)對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健食品和醫(yī)藥品。該類產(chǎn)品適合有長(zhǎng)期飲酒習(xí)慣的人群食用，起到保護(hù)肝臟以及減少因酒精中毒而引起的一些嚴(yán)重疾病等作用。
三.玉米肽的抗氧化活性1.檢驗(yàn)方法(1)玉米肽對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響鄰苯三酚(PR)在堿性條件下能迅速自氧化，釋放出O2-，生成有色的中間產(chǎn)物，可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。PR自氧化過(guò)程的初始階段，中間產(chǎn)物的累積在30-40S后與時(shí)間成線性關(guān)系，且在320nm有強(qiáng)烈吸收，當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，可清除O2-，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，據(jù)此可求出抗氧化劑的類SOD活性。
取3ml體系，空白管0.1ml重蒸水，加入2.8ml，Tris-HCl buffer(pH8.2，0.1mol/l)，25℃保溫10min，然后加入預(yù)熱的3mmol/l的PR100μl混勻，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)30S后，于320nm處作時(shí)間掃描，反應(yīng)時(shí)間4min。空白最佳的自氧化速率控制為0.06；取玉米肽10mg溶于1ml重蒸水中，取0.1ml加入到2.8mlTris-HCl緩沖液(pH8.2，0.1mol/L)中，同樣25℃保溫10min，加入100ul鄰苯三酚。30S后，于320nm處掃描。最后計(jì)算抑制率，用來(lái)評(píng)價(jià)樣品的清除超氧陰離子自由基的活性。
(2)玉米肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響①紅細(xì)胞懸液的制備Wistar大鼠斷頭取血，以4％的檸檬酸鈉作抗凝劑，加入2-3倍的生理鹽水懸浮，離心(4℃，1500rpm，5min)，去上清及黃色薄層，重復(fù)洗滌三次，懸浮于pH7.4的磷酸緩沖生理鹽水中，配成1％的紅細(xì)胞懸液，冷藏待用。
②紅細(xì)胞自溶血系統(tǒng)紅細(xì)胞自溶血系統(tǒng)的建立如表8所示。其中終濃度表示加入玉米肽之后，玉米肽在整個(gè)體系中的濃度。
表8 紅細(xì)胞自溶血系統(tǒng)配制方法 各抗氧化劑的終濃度系統(tǒng)I10ml紅細(xì)胞懸液系統(tǒng)II 玉米肽+10ml紅細(xì)胞懸 0.1mmol/L液系統(tǒng)III GSH+10m紅細(xì)胞懸液 0.1mmol/L系統(tǒng)IV Vc+10ml紅細(xì)胞懸液 0.1mmol/L系統(tǒng)I-IV均在37℃溫浴24h。
③過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血系統(tǒng)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血系統(tǒng)的建立如表9所示。其中終濃度表示加入玉米肽之后，玉米肽在整個(gè)體系中的濃度。
表9 H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血系統(tǒng)配制方法 各抗氧化劑的終濃度系統(tǒng)AH2O2+10ml紅細(xì)胞懸 100mmol/L液系統(tǒng)B玉米肽+系統(tǒng)A 0.1mmol/L系統(tǒng)CVc+系統(tǒng)A 0.1mmol/L系統(tǒng)DGSH+系統(tǒng)A0.1mmol/L以上四個(gè)系統(tǒng)于37℃溫浴1h。
④紅細(xì)胞自氧化溶血度的測(cè)定血紅蛋白的測(cè)定從表7中系統(tǒng)I-IV 1500rpm離心5min后，取上清測(cè)OD540，測(cè)定血紅蛋白的含量。
氧化產(chǎn)物的測(cè)定從表8中系統(tǒng)I-IV離心后的上清中取1.5ml，加入1ml的TBA(硫代巴比妥酸)，沸水浴30min，冷卻后1500rpm離心5min，取上清液測(cè)定OD532。測(cè)定TBA反應(yīng)物的含量。
⑤過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的紅細(xì)胞過(guò)氧化溶血度的測(cè)定血紅蛋白的測(cè)定從表8中系統(tǒng)A-D 1500rpm離心5min后，取上清測(cè)OD540，測(cè)定血紅蛋白的含量。
氧化產(chǎn)物的測(cè)定從系統(tǒng)A-D離心后的上清中取1.5ml，加入1ml的TBA溶液，沸水浴30min，冷卻后1500rpm離心5min，取上清液測(cè)定OD532。測(cè)定TBA反應(yīng)物的含量。
2.檢驗(yàn)結(jié)果自由基是正常組織中的代謝產(chǎn)物，生成與被清除處于動(dòng)態(tài)平衡，有的自由基對(duì)機(jī)體無(wú)明顯毒性，而大多數(shù)自由基對(duì)機(jī)體損害嚴(yán)重。只是在生理情況下這些自由基不斷產(chǎn)生，但也不斷被抗氧化劑清除，因而顯不出自由基對(duì)機(jī)體的損傷。而在某些病理情況下，機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力下降，自由基的產(chǎn)生與清除失去了平衡，不論其原因是自由基的產(chǎn)生增加，還是機(jī)體清除自由基的能力減弱，或者兼而有之，其后果是造成了對(duì)機(jī)體的損害。我們通過(guò)以上幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明了玉米功肽對(duì)自由基有一定的清除作用。
(1)玉米肽對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響鄰苯三酚自氧化速率為0.06A/min，玉米肽對(duì)鄰三酚自氧化的抑制率按下式計(jì)算I＝(ΔA-ΔA。)/ΔA?！?00％I表示抑制率；ΔA。，ΔA分別表示加入和未加入抑制物后鄰苯三酚的速率，即每分鐘其光吸收的平均變化率。測(cè)定結(jié)果表明玉米肽對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制率為48.48％。
(2)玉米肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響以不加抗氧化劑的血紅蛋白的溶血為100％，計(jì)算加抗氧化劑的血紅蛋白的溶血度。由表10中可以看出，在有玉米肽存在時(shí)紅細(xì)胞溶血度下降了38.6％，說(shuō)明玉米肽(CP)對(duì)紅細(xì)胞的自氧化損傷有保護(hù)作用，強(qiáng)于谷胱甘肽(GSH)和Vc。
表10玉米肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞自氧化溶血的影響自溶血 CP GSH VcOD540 0.4740.2910.3890.384溶血度100％61.4％ 82.1％ 81.0％抑制率-38.6％ 17.9％ 19％此外，在加入了外源活性氧(H2O2，O2-及·OH)作用于紅細(xì)胞之后，含有玉米肽的體系溶血度明顯下降(見表11)，由此可以推測(cè)玉米肽可能使紅細(xì)胞產(chǎn)生的超氧自由基減少。
表11玉米肽對(duì)大鼠H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的影響H2O2誘導(dǎo)的溶血CP GSH VcOD5400.786±0.05 0.517+0.06 0.311±0.05 0.625±0.07溶血度100％ 65.7％ 39.6％79.5％抑制度----- 34.3％ 60.4％20.5％
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所制備的玉米短肽具有抗氧化活性，可應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和化妝品行業(yè)，適合于預(yù)防和治療由于自由基損傷所引起的疾病如癌癥，器官組織細(xì)胞的破壞和減少，免疫功能低下等。玉米肽可用于生產(chǎn)化妝品，如發(fā)乳劑，具有護(hù)發(fā)和保濕作用；又如面霜，有類似SOD的抗氧化作用，可以養(yǎng)顏(抗衰老)。
由以上可以看出，本發(fā)明的玉米肽的具有制備工藝簡(jiǎn)單，良好的物理性狀(低分子量，穩(wěn)定性高等)和多種生理功能(抗疲勞作用，調(diào)節(jié)乙醇代謝作用和較強(qiáng)的抗氧化作用等)等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面舉例說(shuō)明本發(fā)明玉米肽的制備實(shí)施例1取20g玉米蛋白粉(蛋白含量為58.2％)，加200ml水，攪拌，用濃NaOH溶液調(diào)pH至9.0，于40℃水浴中震蕩30min。離心(9000rpm，15min)。離心后，去掉上清，加200ml水，攪拌，離心(9000rpm，15min)，棄去上清。加200ml水，攪拌，調(diào)pH9.5，升溫至35℃，加0.9ml酶液(2709地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶(無(wú)錫酶制劑廠)，開始水解反應(yīng)。在反應(yīng)的過(guò)程中，保持溫度50℃，反應(yīng)過(guò)程中維持pH9.5。當(dāng)DH達(dá)到26％時(shí)，停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，快速升溫至95℃，保持15min使酶滅活。然后，降至室溫。12,000rpm，離心30min，上清液為粗制玉米肽液。粗制玉米肽液過(guò)布氏漏斗后，將濾液過(guò)截止分子量5000超濾膜。過(guò)膜液，濃縮，干燥，得到精制的玉米肽干粉。用TNBS法測(cè)得的肽的平均鏈長(zhǎng)為4.5。
產(chǎn)率0.38g/g蛋白實(shí)施例2取20g玉米蛋白粉(蛋白含量為58.2％)，加200ml水，攪拌，用濃HCl調(diào)pH至4.5，于50℃水浴中震蕩30min。離心(6000rpm，25min)后，去掉上清，加200ml水，攪拌，洗沉淀。離心(6000rpm，25min)，去上清，加200ml水，調(diào)pH8.5，升溫至55℃，加1.5ml酶液(卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶[1])，開始水解反應(yīng)。使pH維持在8.5。當(dāng)水解度達(dá)到30％時(shí)，停止反應(yīng)?？焖偕郎刂?5℃，保持15min使酶滅活。然后，降溫至室溫。調(diào)pH至中性。12,000rpm，離心30min，上清液為粗制玉米肽液。玉米肽液過(guò)截止分子量10,000超濾膜。過(guò)膜液，濃縮，干燥，得到精制的玉米肽干粉。用TNBS法測(cè)得的肽的平均鏈長(zhǎng)為5.2。
產(chǎn)率0.45g/g蛋白參考文獻(xiàn)1Shui-Tein Chen，Shiah-Yun Chen，and Kung-Tsung Wang，KineticallyControlled Peptide Bond Formation in Anhydrous Alcohol Catalyzed by theIndustrial Protease Alcalase，The Joumal of Organic Chemistry，1992，57(25)6960-6965.
權(quán)利要求
1.一種玉米肽產(chǎn)品，其具有如下特征(1)玉米肽干粉是一種淡黃色的粉末，分子量分布主要在1000以下，是含2-9氨基酸殘基的短肽混合物，用TNBS法測(cè)定平均鏈長(zhǎng)為4-5個(gè)氨基酸；(2)玉米肽在所有pH下都能溶解于水，玉米肽溶液呈淡黃色，對(duì)熱很穩(wěn)定；(3)玉米肽水溶液的粘度與它的濃度和溫度關(guān)系不大，在高濃度下，它的粘度沒有大的變化；(4)氨基酸組成玉米肽氨基酸種類有天門東氨酸；蘇氨酸；絲氨酸；谷氨酸；甘氨酸；丙氨酸；半胱氨酸；纈氨酸；蛋氨酸；異亮氨酸；亮氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸；賴氨酸；組氨酸；精氨酸；脯氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的玉米肽產(chǎn)品在制備具有提高機(jī)體乙醇代謝功能的食品、藥品中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的玉米肽產(chǎn)品在制備具有抗疲勞功能的食品、藥品中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的玉米肽產(chǎn)品在用于制備具有提高機(jī)體抗氧化活性能力的食品、藥品、化妝品中的應(yīng)用。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的玉米肽產(chǎn)品的方法，其步驟如下(1)原材料預(yù)處理玉米蛋白粉過(guò)60-80目篩，按固液比1∶8-1∶12加水，用鹽酸調(diào)pH至2.0-5.0或用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至30-60℃，攪拌20-30min，6000-9000rpm離心20-30min，去上清；再按上述固液比加水，升溫至30-60℃，攪拌15-20min，6000-9000rpm離心20-30min，去除上清液后收集沉淀；(2)酶水解按固液比1∶8-1∶12將步驟1中收集的沉淀與水混合，攪拌，用NaOH溶液調(diào)pH至8.0-10.0，升溫至35℃-60℃，加2709地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶或卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶液40-100ml/1kg玉米蛋白粉，開始水解反應(yīng)，在反應(yīng)的過(guò)程中，維持體系pH值恒定，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解度達(dá)到10-30％時(shí)，停止反應(yīng)；(3)酶滅活步驟2結(jié)束后，快速升溫至95℃，保持15min使酶滅活，然后，溫度降至室溫，調(diào)pH至中性，12,000-15,000rpm，離心20-30min，得上清液，為玉米肽粗制液；(4)精制玉米肽粗制液先經(jīng)過(guò)一個(gè)布氏漏斗處理，除去粗制玉米肽液中少許殘留的油脂，再通過(guò)膜分離技術(shù)去掉粗制玉米肽液中的大分子片段，膜上液回到酶解罐中再次水解；(5)濃縮由步驟4中得到的過(guò)膜液，減壓濃縮至固型物含量35-40％。(6)干燥精制的玉米肽液濃縮后，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥制成干粉。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量的功能玉米短肽產(chǎn)品、利用酶法直接降解玉米蛋白粉中的玉米蛋白制備該短肽的方法及該短肽產(chǎn)品的應(yīng)用。該玉米肽產(chǎn)品干粉是一種淡黃色的粉末，分子量分布主要在1000以下，是含2－9氨基酸殘基的短肽混合物，用TNBS法測(cè)定平均鏈長(zhǎng)4－5個(gè)氨基酸。制備方法涉及原料預(yù)處理、酶水解、酶滅活、精制和干燥制粉等步驟。本發(fā)明的玉米肽具有制備工藝簡(jiǎn)單，良好的物理性狀(低分子量，穩(wěn)定性高等)和多種生理功能(抗疲勞作用，調(diào)節(jié)乙醇代謝作用和較強(qiáng)的抗氧化作用等)等優(yōu)點(diǎn)，作為基料可以用于保健食品、醫(yī)藥品和化妝品的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23J3/00GK1552894SQ200310115958
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者張學(xué)忠, 徐力, 吳曉霞, 侯瑞珍, 王 華, 黃宜兵 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)