專利名稱：用scar技術(shù)鑒定水稻繁殖不育系純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻育種技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用SCAR技術(shù)鑒定水稻繁殖不育系純度的方法。
背景技術(shù)：
種子純度一直是影響雜交水稻種子生產(chǎn)的重要因素，不育系繁殖的親本純度直接關(guān)系到雜交水稻種子的生產(chǎn)。在制種時，保持系如果混入不育系中，將嚴重影響種子的質(zhì)量。因此，建立一種快速、有效、簡便的種子純度鑒定方法是育種者一直關(guān)注的焦點問題之一。在生產(chǎn)上，種子純度實際上包含兩個方面雜交種子純度和繁殖種子純度，雜交種子純度指生產(chǎn)上所用的雜交稻種子純度，而繁殖種子純度一般是指用于制種的不育系的純度。常規(guī)的不育系純度檢驗方法是于冬天在海南大田種植，第二年春天于穗期顯微鏡檢測花粉育性或套袋自交檢測其結(jié)實率來確定不育系的純度，不僅費工、費時，而且受環(huán)境和人為因素的影響，難以及時提供準確、可靠的數(shù)據(jù)報告。分子標記技術(shù)因直接作用于DNA，不僅快速、準確，而且不受環(huán)境和人為因素的影響，廣泛應(yīng)用于品種純度的鑒定。近年來，在雜交稻種子的分子生物學(xué)純度鑒定上已開展了許多研究，并已有用分子標記技術(shù)鑒定雜交稻種純度的報道，它們一般是基于核DNA的差異進行的。到目前為止，尚未見有關(guān)不育系種子純度鑒定的方法報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用SCAR技術(shù)鑒定水稻繁殖不育系純度的方法。
對于繁殖種子的純度鑒定，其難度要大于雜交種子。由于水稻不育系和保持系的同核性，使二者除育性差異外，形態(tài)上很難分辯。因此，它們的分子鑒定必須建立在線粒體DNA或葉綠體DNA上，目前已有一些報道在不育系與保持系的線粒體DNA上找到多處能區(qū)分不育系和保持系的位點，但大多未進行實際的驗證。由于葉綠體DNA具有高度的保守性，其間存在的差異可能更具有普遍性，因而更適于純度的鑒定。本發(fā)明申請人曾采用AFLP技術(shù)在多對水稻細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系之間找到了一個共同的差異位點，并提出了利用不育系與保持系葉綠體DNA的差異性對繁殖不育系種子純度進行分子鑒定的思路。
本發(fā)明依次通過下列步驟實現(xiàn)
(1)利用不育系與保持系二者的葉綠體堿基序列差異，設(shè)計序列如下的三個專一PCR引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′(2)提取鑒定材料的DNA；(3)用上述設(shè)計的引物P1、P2、P3對DNA進行PCR擴增；(4)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)用快速銀染法進行染色；(6)根據(jù)電泳和染色結(jié)果即可區(qū)分不育系和保持系，達到純度鑒定的目的。
上述方法中引物設(shè)計、DNA的提取、PCR擴增、凝膠電泳、快速銀染法進行染色等均為公知技術(shù)。
本發(fā)明的優(yōu)點是基于DNA水平的鑒定，不受環(huán)境和材料部位的影響，速度快，不必經(jīng)過一個生長季節(jié)；利用不育系與保持系在葉綠體上的差異而進行，結(jié)果更可靠。
具體實施例方式實施例1取生產(chǎn)上大面積使用的不育系II-32A 300株，分別提取其DNA，利用所設(shè)計的三個專一引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′對DNA進行PCR擴增，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法進行染色，根據(jù)電泳和染色結(jié)果區(qū)分出不育系和保持系，鑒定出純度。同時，采用單株花粉育性鏡檢和套袋自交為對照檢測，結(jié)果PCR分子檢測結(jié)果與兩種對照完全一致，說明該方法是可靠的。
實施例2取本發(fā)明申請人選育的新型不育系縉2A 300株，分別提取其DNA，利用所設(shè)計的三個專一引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′
P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′對DNA進行PCR擴增，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法進行染色，根據(jù)電泳和染色結(jié)果區(qū)分出不育系和保持系，鑒定出純度。同時，采用單株花粉育性鏡檢和套袋自交為對照檢測，結(jié)果PCR分子檢測結(jié)果與兩種對照完全一致，說明該方法是可靠的。
權(quán)利要求
1.一種用SCAR技術(shù)鑒定水稻繁殖不育系純度的方法，其特征在于依次通過下列步驟實現(xiàn)(1)利用不育系與保持系二者的葉綠體堿基序列差異，設(shè)計序列如下的三個專一PCR引物P15′-aggaacgcggtaggtggggg-3′P25′-agaaaaagaaaatggggatatggcg-3′P35′-ggtgcagagactcaatggaa-3′(2)提取鑒定材料的DNA；(3)用上述設(shè)計的引物P1、P2、P3對DNA進行PCR擴增；(4)用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳；(5)用快速銀染法進行染色；(6)根據(jù)電泳和染色結(jié)果即可區(qū)分不育系和保持系，達到純度鑒定的目的。
全文摘要
一種用SCAR技術(shù)鑒定水稻繁殖不育系純度的方法，通過對供檢材料進行DNA的提取、引物設(shè)計、PCR擴增、凝膠電泳、快速銀染法進行染色等步驟，區(qū)分不育系和保持系，達到從而鑒定不育系純度的目的。該方法是基于DNA水平的鑒定，不受環(huán)境和材料部位的影響，速度快，不必經(jīng)過一個生長季節(jié)；利用不育系與保持系在葉綠體上的差異而進行，結(jié)果更可靠。
文檔編號C12Q1/68GK1546687SQ20031011557
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者何光華, 桑賢春, 侯磊, 裴炎, 楊正林, 張毅, 李云峰 申請人:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)