專利名稱：：尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(“hpt”)核酸和多肽以及它們的用途的制作方法本申請要求享有2002年3月19日申請的US60/365,202的優(yōu)先權(quán)，該申請的公開在此全部引入作為參考。本發(fā)明屬于植物遺傳學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及與生育酚生物合成路徑相關(guān)的基因和多肽，也就是那些編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性的，以及它們的用途。類異戊二烯是存在于所有活性生物體中的遍在化合物。植物合成超過22,000種的大量不同類異戊二烯(Connolly和Hill，DictionaryofTerpenoids，ChapmanandHall，NewYork，NY(1992))。在植物中，類異戊二烯在特定細(xì)胞功能如促進(jìn)真核細(xì)胞膜構(gòu)建的固醇的生成中起重要作用，以及在生成泛醌和質(zhì)體醌的側(cè)鏈上的無環(huán)聚異戊烯醇(acyclicpolyprenoids)、生長調(diào)節(jié)劑樣脫落酸、赤霉素、油菜素類固醇或光合色素葉綠素和類胡蘿卜素中。雖然其他植物類異戊二烯的生理學(xué)作用不是明顯的，如同大量次級代謝產(chǎn)物，一些類異戊二烯在調(diào)整對不同環(huán)境刺激的適應(yīng)性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。盡管結(jié)構(gòu)和功能的顯著差異，所有類異戊二烯來自單一的代謝前體，二磷酸異戊烯(IPP)(Wright，(1961)Annu.Rev.Biochem.，20525-548，和SpurgeonandPorter，InBiosynthesisofIsoprenoidCompounds，PorterandSpurgeon(eds.)JohnWiley，NY，Vol.1，pp.1-46(1981))。大量獨特的和相互關(guān)聯(lián)的生物化學(xué)路徑存在于高等植物的葉綠體中，起源于類異戊二烯路徑，這些路徑產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，包括生育酚。生育酚不僅在植物中起重要作用，而且對于哺乳動物營養(yǎng)特性也是重要的。在質(zhì)體中，生育酚達(dá)到總醌沉積的40％。生育酚是哺乳動物食物中的重要成分。流行病學(xué)證據(jù)表明添加生育酚能夠降低患心血管疾病和癌癥的危險，能夠增強免疫功能，并且與防止和延緩大量人的衰老性疾病的進(jìn)程相關(guān)。(TraberandSies，AnnuRev.Nutr.，16321-347(1996))。生育酚部分地通過穩(wěn)定生物膜的脂質(zhì)雙分子層(SkrypinandKagan，Biochim.Biophys.Acta，815209(1995)；Kagan，N.Y.Acad.Sci.，p.121(1989)；Gomez-Fernandezetal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，p.109(1989))，降低通過脂氧化產(chǎn)生的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)自由基(Fukuzawaetal.，Lipids，17511-513(1982))和清除氧自由基、脂肪過氧化基和單線態(tài)氧種類(Diplocketal.，Ann.NYAcad.Sci.，57072(1989)；Fryer，PlantCellEnviron.，15(4)381-392(1992))來起作用?；衔铴?生育酚通常稱作為維生素E，屬于一類脂溶性抗氧化劑，包括α、β、γ和δ生育酚和α、β、γ和δ三烯生育酚。雖然有時α、β、γ和δ生育酚和α、β、γ和δ三烯生育酚都稱作為“維生素E”，在化學(xué)上維生素E定義為α-生育酚是更恰當(dāng)?shù)摹＞S生素E或α-生育酚對于人的健康是十分重要的，部分地由于其容易被機體吸收和保留，因此具有比其他生育酚種類更高的生物學(xué)活性(TraberandSies，Annu.Rev.Nutr.，16321-347(1996))。但是，其他生育酚如β、γ和δ生育酚也具有極高的健康和營養(yǎng)價值。生育酚主要僅由植物和某些其他光合作用生物體合成，包括藍(lán)細(xì)菌。結(jié)果，哺乳動物食物中的生育酚幾乎毫無例外地來自這些來源。植物組織中α-生育酚的總生育酚含量和生育酚組成差異顯著，α-生育酚是存在于綠色光合作用植物組織中的主要生育酚種類。每克鮮新的葉片組織中含有10-50μg總生育酚，但是全世界主要種植的農(nóng)作物(如稻、玉米、小麥、馬鈴薯)生成少量到極低水平的總生育酚，其中僅極小比例為α-生育酚(Hess，VitaminE，α-tocopherol，InAntioxidantsinHigherPlants，R.AlscherandJ.Hess，(eds.)，CRCPress，BocaRaton.，pp.111-134(1993))。油料種子作物通常含有更高含量的總生育酚，但是在油料種子中，α-生育酚僅作為小成分存在(TaylorandBarmes，ChemyInd.，Oct722-726(1981))。從普通的美國人的食物中實現(xiàn)推薦的每日食物攝取15-30mg維生素E是相當(dāng)困難的。例如，將食用750克以上α-生育酚占總生育酚的60％的菠菜葉，或者200-400克大豆油來滿足這種推薦的每日維生素E的攝取。但是，可能在食物中增加添加劑，這些添加劑中大部分主要含有合成的維生素E，具有8種立體異構(gòu)體，而天然的維生素E主要由一種單一的異構(gòu)體組成。而且，添加劑趨向于相對昂貴，并且普通人不愿意經(jīng)常性地食用維生素添加劑。因此，本領(lǐng)域需要提高總生育酚產(chǎn)量或提高植物生成的α-生育酚的相對比例的組合物和方法。除了生育酚的健康價值，提高作物中的α-生育酚水平與增強穩(wěn)定性和延長植物產(chǎn)品的存放時間相關(guān)(Peterson，Cereal-Chem.，72(1)21-24(1995)；Ball，F(xiàn)at-solublevitaminassaysinfoodanalysis.Acomprehensivereview，London，ElsevierSciencePublishersLtd.(1988))。此外，已經(jīng)證明在豬、牛、和家禽飼料中添加生育酚，顯著提高肉品質(zhì)和通過延遲加工后的脂肪氧化來延長肉產(chǎn)品加工后的存放時間，脂肪氧化會產(chǎn)生令人不快的氣味成分(SanteandLacourt，J.Sci.FoodAgric.，65(4)503-507(1994)；Buckleyetal.，J.ofAnimalScience，733122-3130(1995))。生育酚的生物合成高等植物的質(zhì)體具有相互連接的生物化學(xué)路徑，其產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，包括生育酚。高等植物中的生育酚生物合成路徑包括縮合尿黑酸和葉綠基焦磷酸(phytylpyrophosphate)來形成2-甲基葉綠基質(zhì)體醌醇(Fiedleretal.，Planta，155511-515(1982)；Solletal.，Arch.Biochem.Biophys.，204544-550(1980)；Marshalletal.，Phytochem.，241705-1711(1985))。這種植物生育酚路徑可被分成四個部分1)尿黑酸合成(HGA)，其構(gòu)成生育酚的芳香環(huán)；2)葉綠基焦磷酸合成，其構(gòu)成生育酚的側(cè)鏈；3)通過尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶連接HGA和葉綠基焦磷酸，隨后進(jìn)行環(huán)化；和4)芳香環(huán)的S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基化，其影響各種生育酚種類的相對豐度。參見附圖1。參與生育酚生物合成的各種基因及其編碼的蛋白質(zhì)包括列舉在下表中的那些。上表中給出的“基因ID”確定與所列酶相關(guān)的基因。本發(fā)明公開中任何列舉在此表中的基因ID是指編碼在表中與基因ID相關(guān)的酶的基因。如本文所用，HPT、HPT2、PPT、slr1736和ATPT2分別是指蛋白質(zhì)或編碼具有相同活性的蛋白質(zhì)的基因。尿黑酸的合成尿黑酸是生育酚和質(zhì)體醌的常見前體。至少在一些細(xì)菌中，尿黑酸的合成被報道是通過轉(zhuǎn)化分支酸為預(yù)苯酸，然后通過雙功能預(yù)苯酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為p-羥基苯基丙酮酸發(fā)生。雙功能細(xì)菌預(yù)苯酸脫氫酶的例子包括由草生歐文氏桿菌(Erwiniaherbicola)和大腸桿菌tyrA基因編碼的蛋白質(zhì)。tyrA基因產(chǎn)物催化由分支酸生成預(yù)苯酸，隨后預(yù)苯酸脫氫形成尿黑酸的直接前體p-羥基苯基丙酮酸(p-HPP)。然后p-HPP通過羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)轉(zhuǎn)化為尿黑酸。相反，一般認(rèn)為植物缺乏預(yù)苯酸脫氫酶活性，并且一般認(rèn)為通過合成和轉(zhuǎn)化中間體arogenate來由分支酸合成尿黑酸。由于參與尿黑酸合成的路徑還負(fù)責(zé)酪氨酸生成，這些路徑中的任何改變還會導(dǎo)致酪氨酸合成和其他芳香氨基酸合成的變化。葉綠基焦磷酸的合成生育酚是稱作類異戊二烯的化合物種類中的成員。其他類異戊二烯包括類胡蘿卜素、赤霉素、萜烯、葉綠素和脫落酸。生成類異戊二烯中的主要中間體是異戊烯基二磷酸(IPP)。生成IPP的胞質(zhì)和質(zhì)體路徑已經(jīng)被報道。胞質(zhì)路徑包括酶乙酰乙酰輔酶A硫解酶、HMGCoA合成酶、HMGCoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。最近，從Rohmer和Arigoni研究小組的試驗中得到存在可選擇的質(zhì)體、類異戊二烯生物合成路徑的證據(jù)(Eisenreichetal.，Chem.Bio.，5R221-R233(1998)；Rohmer，Prog.Drug.Res.，50135-154(1998)；Rohmer，ComprehensiveNaturalProductsChemistry，Vol.2，pp.45-68，BartonandNakanishi(eds.)，PergamonPress，Oxford，England(1999))，他們發(fā)現(xiàn)在對一些真細(xì)菌(eubacterial)的和植物萜類化合物的研究中觀察到的同位素標(biāo)記模式的不能通過甲羥戊酸路徑來解釋。接著Arigoni和coworkers表明1-脫氧木酮糖或其衍生物作為新路徑的中間體，該路徑現(xiàn)在稱作為MEP路徑(Rohmeretal.，Biochem.J.，295517-524(1993)；Schwarz，Ph.D.thesis，EidgenssicheTechnischeHochschule，Zurich，Switzerland(1994))。最近的研究表明從一分子的各種甘油醛3-磷酸(Rohmer，ComprehensiveNaturalProductsChemistry，Vol.2，pp.45-68，BartonandNakanishi(eds.)，PergamonPress，Oxford，England(1999))和丙酮酸(Eisenreichetal.，Chem.Biol.，5R223-R233(1998)；Schwarzsupra；Rohmeretal.，J.Am.Chem.Soc.，1182564-2566(1996)；和Sprengeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9412857-12862(1997))通過由dxs基因編碼的酶(Loisetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，952105-2110(1997)；andLangeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，952100-2104(1998))形成1-脫氧木糖酮5-磷酸(Broers，Ph.D.thesis，EidgenssicheTechnischeHochschule，Zurich，Switzerland(1994))。1-脫氧木酮糖5-磷酸可以被進(jìn)一步通過由dxr基因編碼的還原異構(gòu)酶(Bouvieretal.，PlantPhysiol，1171421-1431(1998)；和Rohdichetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9611758-11763(1999))轉(zhuǎn)化為2-C-甲基赤蘚糖醇4-磷酸(Arigonietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9410600-10605(1997))。報道存在于MEP路徑的基因還包括催化2-C-甲基赤蘚糖醇4-磷酸轉(zhuǎn)化為各自的胞嘧啶焦磷酸衍生物的ygbP和催化4-磷酸胞嘧啶-2-C-甲基-D-赤藻糖醇轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤藻糖醇，3，4-環(huán)磷酸的ygbB。這些基因在大腸桿菌基因組中緊密連接(Herzetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，97(6)2485-2490(2000))。一旦IPP通過MEP路徑形成，其通過GGPDP合成酶轉(zhuǎn)化為GGDP然后轉(zhuǎn)化為葉綠基焦磷酸，其是生育酚側(cè)鏈的關(guān)鍵組成。結(jié)合與環(huán)化尿黑酸通過尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(HPT)與葉綠基焦磷酸或茄基(solanyl)-焦磷酸結(jié)合，分別形成2-甲基葉綠基質(zhì)體醌醇或2-甲基茄基(solanyl)質(zhì)體醌醇。2-甲基茄基(solanyl)質(zhì)體醌醇是生物合成質(zhì)體醌的前體，而2-甲基葉綠基質(zhì)體醌醇最終轉(zhuǎn)化為生育酚。芳香環(huán)的甲基化各種生育酚亞型的主要結(jié)構(gòu)差別是環(huán)繞苯環(huán)的甲基基團(tuán)的位置。2-甲基葉綠基質(zhì)體醌醇和2-甲基茄基(solanyl)質(zhì)體醌醇都作為植物酶2-甲基葉綠基質(zhì)體醌醇/2-甲基茄基(solanyl)質(zhì)體醌醇甲基轉(zhuǎn)移酶(生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶2；甲基轉(zhuǎn)移酶2；MT2；tMT2)的底物，其能夠使生育酚前體甲基化。接著由γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(GMT)在γ-生育酚的位置5的甲基化產(chǎn)生生物活性的α-生育酚。一些植物如大豆在其種子中生成大量δ-生育酚，隨后為β-生育酚?？梢酝ㄟ^過度表達(dá)tMT2來阻止δ-生育酚和β-生育酚的形成，導(dǎo)致δ-生育酚前體2-甲基葉綠基質(zhì)體醌甲基化形成2，3-二甲基-5-葉綠基質(zhì)體醌，接著被生育酚環(huán)化酶環(huán)化形成γ-生育酚，接著被GMT甲基化形成α-生育酚。在另一個可能的路徑中，β-生育酚通過tMT2甲基化3位置直接轉(zhuǎn)化為α-生育酚(參見，如BiochemicalSocietyTransactions，11504-510(1983)；IntroductiontoPlantBiochemistry，2ndedition，Chapter11(1983)；VitaminHormone，29153-200(1971)；BiochemicalJournal，109577(1968)；and，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunication，28(3)295(1967))。由于生成α-生育酚的所有可能機制都包括由tMT2催化，缺乏這種活性的植物沉積δ-生育酚和β-生育酚。tmT2活性升高的植物傾向于蓄積γ-生育酚和α-生育酚。由于在許多植物種子中，GMT活性受限，這些植物傾向于蓄積γ-生育酚。在本領(lǐng)域需要編碼參與生育酚生物合成的酶以及相關(guān)酶和在植物增強或改變生育酚生產(chǎn)的抗體的核酸分子。還需要表達(dá)這些參與生育酚生物合成的核酸分子的轉(zhuǎn)基因生物，能夠在營養(yǎng)學(xué)上增加食物和飼料來源。發(fā)明概述本發(fā)明包括和提供基本上純的核酸分子，其編碼的氨基酸序列選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽分子，包括選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供能夠特異結(jié)合多肽的抗體，多肽包括選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的核酸分子，其編碼的多肽具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性，包括選自SEQIDNO43或44的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽，其具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性，包括選自SEQIDNO43或44的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供被轉(zhuǎn)化的植物，包含被導(dǎo)入的核酸分子，其編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽或其互互補體。本發(fā)明包括和提供被轉(zhuǎn)化的植物，其包括被導(dǎo)入的編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽或其互補體的第一個核酸分子，和被導(dǎo)入的編碼選自tyrA、預(yù)苯酸(prephenate)脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GMT、MT1、tMT2、GCPE、GGPPS、HPPD、AANT1、IDI、GGH的酶及其互補體的第二個核酸分子。本發(fā)明包括和提供被轉(zhuǎn)化的植物，包括包含導(dǎo)入的啟動子區(qū)的核酸分子，啟動子區(qū)在植物細(xì)胞中的作用導(dǎo)致mRNA分子生成，其中所述被導(dǎo)入的啟動子區(qū)被連接到被轉(zhuǎn)錄的核酸分子上，核酸分子具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈，其中所述轉(zhuǎn)錄鏈與編碼多肽的核酸分子互補，該多肽選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90，其中所述被轉(zhuǎn)錄的核酸分子被連接到3’非翻譯序列上，非翻譯序列在植物細(xì)胞中起導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止和添加聚腺苷酸化核苷酸到mRNA序列的3’末端的作用。本發(fā)明包括和提供制備種子中生育酚水平提高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物，該核酸分子編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽；和(B)種植所述轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括和提供制備種子中生育酚水平提高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的第一核酸分子和第二核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物，第一核酸分子編碼具有選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的氨基酸序列的多肽，第二核酸分子編碼選自tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GMT、MT1、tMT2、GGPPS、GCPE、HPPD、AANT1、IDI、GGH的酶或其互補體；和(B)種植所述轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明包括和提供來自被轉(zhuǎn)化的植物的種子，其包括導(dǎo)入的編碼包含選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽的核酸分子。本發(fā)明包括和提供來自被轉(zhuǎn)化的植物的種子，其包括導(dǎo)入的編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽的第一核酸分子，和導(dǎo)入的編碼選自tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GMT、MT1、GCPE、tMT2、GGPPS、HPPD、AANT1、IDI、GGH的酶及其互補體導(dǎo)入的第二核酸分子。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽，包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列不是來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌(NostocPunctiforme)、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)、集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)、玉蜀黍(Zeamays)，大豆(Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、稻(Oryzasativa)、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌(Trichodesmiumerythraeum)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexusaurantiacus)、小麥、韭、菜籽(Canola)、棉花或西紅柿的核酸分子。本發(fā)明包括和提供所述基本上純的多肽，其中一種以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。本發(fā)明包括和提供基本上純的編碼多肽的核酸分子，多肽包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列，其中所述核酸分子不是來自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿。本發(fā)明提供和包括所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的編碼多肽的核酸分子，多肽包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列，其中所述核酸分子不是來自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、Aeropyum、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、高梁、小麥、西紅柿或韭。本發(fā)明提供和包括所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供用核酸分子轉(zhuǎn)化的植物，該核酸分子編碼包含選自的SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不是來自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、硫化葉菌、Aeropyum、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、高梁、小麥、西紅柿或韭。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽，其包含選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的氨基酸序列，其中所述多肽不包含任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060(這些序列在此引入作為參考)的序列表中的氨基酸序列(這些序列在此引入作為參考)，和不包含本申請的SEQIDNO1-11、43-45、57-58、61-62或90。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽，其包含一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不包含任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060的序列表中的核酸序列，和不包含本發(fā)明的SEQIDNO27-36、59-60、88-89和91或Genebank登錄號為AI897027或AW563431的基因。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中該多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供用核酸分子轉(zhuǎn)化的植物，該核酸分子編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不包含任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060的序列表中的核酸序列，和不包含本發(fā)明的SEQIDNO27-36、59-60、88-89和91或Genebank登錄號為AI897027或AW563431的基因。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中該多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。本發(fā)明包括和提供基本上純的核酸分子，包含選自SEQIDNO31、34-36、59-60或91的核酸分子。本發(fā)明包括和提供尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，其用附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-35b和36的一種或多種比對發(fā)現(xiàn)。核酸和氨基酸序列描述SEQIDNO1表示點型念珠藍(lán)細(xì)菌尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO2表示魚腥藍(lán)細(xì)菌屬尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO3表示集胞藍(lán)細(xì)菌屬尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO4表示玉米尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)。SEQIDNO5表示大豆尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1-2)。SEQIDNO6表示大豆尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1-1)。SEQIDNO7表示擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)。SEQIDNO8表示部分萼距花(Cupheapulcherrima)尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO9表示韭的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)。SEQIDNO10表示小麥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)。SEQIDNO11表示萼距花尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)。SEQIDNO12-15表示SEQIDNO1-8的結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO16-26表示引物序列。SEQIDNO27表示編碼點型念珠藍(lán)細(xì)菌尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。SEQIDNO28表示編碼魚腥藍(lán)細(xì)菌屬尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。SEQIDNO29表示編碼集胞藍(lán)細(xì)菌屬尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。SEQIDNO30表示編碼玉米尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)的核酸分子。SEQIDNO31表示編碼大豆尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1-2)的核酸分子。SEQIDNO32表示編碼大豆尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1-1)的核酸分子。SEQIDNO33表示編碼擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)的核酸分子。SEQIDNO34表示編碼萼距花尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)的核酸分子。SEQIDNO35表示編碼韭的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)的核酸分子。SEQIDNO36表示編碼小麥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT1)的核酸分子。SEQIDNO37-38表示引物序列。SEQIDNO39-42表示SEQIDNO1-7和9-11的結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO43表示來自紅海束毛藍(lán)細(xì)菌的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO44表示來自橙色綠屈撓菌的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽。SEQIDNO45表示擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)的推定序列。SEQIDNO46-49表示SEQIDNO1-4、6-7、9-11、57-58和91的結(jié)構(gòu)域。SEQIDNO50-56表示引物序列。SEQIDNO57表示擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)。SEQIDNO58表示稻尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)。SEQIDNO59表示編碼擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)的核酸分子。SEQIDNO60表示編碼稻尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)的核酸分子。SEQIDNO61表示推定的擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)。SEQIDNO62表示推定的擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)。SEQIDNO63表示來自擬南芥的EST。SEQIDNO64表示來自蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的EST。SEQIDNO65表示來自蒺藜苜蓿發(fā)育(developing)的莖的EST。SEQIDNO66表示來自蒺藜苜蓿發(fā)育的莖的EST。SEQIDNO67表示來自蒺藜苜蓿發(fā)育的莖的EST。SEQIDNO68表示來自混合的馬鈴薯組織的EST。SEQIDNO69表示來自擬南芥，哥倫比亞生態(tài)型的花芽的EST。SEQIDNO70表示來自擬南芥的EST。SEQIDNO71表示來自蒺藜苜蓿的EST。SEQIDNO72表示來自大豆的EST。SEQIDNO73-83和84-87表示引物序列。SEQIDNO88表示編碼來自藍(lán)綠藻紅海束毛藍(lán)細(xì)菌的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。SEQIDNO89表示編碼來自發(fā)光細(xì)菌橙色綠屈撓菌尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子。SEQIDNO90表示大豆尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)。SEQIDNO91表示編碼來自大豆的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽(HPT2)的核酸分子。SEQIDNO92-95表示來自SEQIDNO1-4、6-7、9-11、43-44、57-58和90的結(jié)構(gòu)域。注釋藍(lán)細(xì)菌和發(fā)光細(xì)菌具有一個HPT。植物具有HPT1和HPT2。在大豆中，有兩種HPT1變種，HPT1-1和HPT1-2，以及HPT2。附圖簡介附圖1是生育酚生物合成路徑的示意圖。附圖2a-2c描述幾種尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的序列比對(SEQIDNO1-8)。附圖3a-3c描述幾種尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的序列比對(SEQIDNO1-7和9-11)。附圖4提供表達(dá)構(gòu)建體pCGN10800的示意圖。附圖5提供表達(dá)構(gòu)建體pCGN10801的示意圖。附圖6提供表達(dá)構(gòu)建體pCGN10803的示意圖附圖7提供表達(dá)構(gòu)建體pCGN10822的示意圖附圖8提供從含有pCGN10822的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬的種子提取物獲得的數(shù)據(jù)的柱形圖，其提供從napin啟動子的有義方向表達(dá)ATPT2序列(SEQIDNO33)。提供的是α、γ、δ-生育酚，以及22種被轉(zhuǎn)化的系的總生育酚，以及非轉(zhuǎn)化(野生型)的對照的曲線圖。附圖9提供HPLC分析pCGN10803轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬植物(品系1387到1624，增強35S-ATPT2，以反義方向)、未轉(zhuǎn)化(wt)的對照和空載體轉(zhuǎn)化的對照的種子提取物的柱形圖。附圖10提供表達(dá)構(gòu)建體pMON36581的示意圖。附圖11提供表達(dá)構(gòu)建體pMON69933的示意圖。附圖12提供表達(dá)構(gòu)建體pMON69924的示意圖。附圖13提供表達(dá)構(gòu)建體pMON69943的示意圖。附圖14提供重組大豆品系中總生育酚水平的柱形圖。附圖15描述pMON69960。附圖16描述pMON36525。附圖17描述pMON69963。附圖18描述pMON69965。附圖19描述pMON10098。附圖20描述pMON69964。附圖21描述pMON69966。附圖22描述種子總生育酚分析的結(jié)果。附圖23描述種子總生育酚分析的結(jié)果。附圖24描述SEQIDNO1-4、6-7、9-11、57和90的比較。附圖25描述基序V到VIII，SEQIDNO46-49。附圖26描述來自多種示于SEQIDNO1-7、9-11、43、44、57-58和90的比對的序列樹。附圖27描述pMON81028。附圖28描述pMON81023。附圖29描述pMON36596。附圖30描述pET30a(+)載體。附圖31描述pMON69993。附圖32描述pMON69992。附圖33a-33c描述幾種尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽SEQIDNO1-4、6-7、9-11、43-44、57-58和90的序列比較。附圖34描述基序IX-XII，SEQIDNO92-95。附圖35描述基序I-IV，SEQIDNO39-42。附圖36描述基序A-D。發(fā)明詳述本發(fā)明提供許多制劑，例如與生育酚合成相關(guān)的核酸分子和多肽，并提供這些制劑的用途。制劑本發(fā)明的制劑優(yōu)選具有“生物活性”，在結(jié)構(gòu)特征方面，如核酸與其他核酸分子雜交的能力，或一種蛋白質(zhì)被抗體結(jié)合的能力(或與其他分子競爭這種結(jié)合)。或者，這種特征是催化的，因而包括該制劑介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答的能力。這種制劑優(yōu)選是“基本上被純化的”。在此所用的術(shù)語“基本上被純化”是指一種分子從在天然環(huán)境條件下通常與其結(jié)合的所有其他分子中基本上分開。更加優(yōu)選的是基本上被純化的分子是存在于制備物中的主要種類?；旧媳患兓姆肿尤コ顺^約60％，優(yōu)選約75％，更加優(yōu)選約90％，和最優(yōu)選約95％的存在于天然混合物中的其他分子(不包括溶劑)。術(shù)語“基本上被純化的”不是包括存在其天然環(huán)境條件下的分子。本發(fā)明的制劑也可以是重組的。如在此所用的術(shù)語重組是指任何制劑(如DNA，肽等)，也就是說，但是間接地來自人為加工核酸分子的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的制劑可以用便于檢測制劑的試劑標(biāo)記(如，熒光標(biāo)記Proberetal.，Science，238336-340(1987)；Albarellaetal.，EP144914；chemicallabels，Sheldonetal.，US4，582，789；Albarellaetal.，US4,563,417；modifiedbases，Miyoshietal.，EP119448)。核酸分子本發(fā)明的制劑包括核酸分子。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，核酸分子包括編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。在此所用的，尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶是能夠特異性地催化由異戊二烯基DP(GGDP)和尿黑酸形成2-甲基-6-葉綠基苯喹啉(2-甲基-6-香葉基香葉基苯喹啉)的任何植物蛋白。更加優(yōu)選的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的例子是具有選自SEQIDNO5、9-11、43-44、55、58和90的氨基酸序列的多肽。在更加優(yōu)選的實施方案中，尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶是由任何編碼選自SEQIDNO5、9-11、43-44、55、58或90的氨基酸序列的核酸分子編碼。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子包括編碼選自SEQIDNO5、9-11、43-44、55、58或90的多肽的核酸序列，及其互互補體(complement)和片段。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子包括選自SEQIDNO31、34-36、59-60或91的核酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有示于任何附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36中的保守氨基酸序列區(qū)域的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或更多、三條或更多或四條序列的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互互補體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和示于任何附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36中的保守氨基酸區(qū)域的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或更多、三條或更多或四條序列的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有示于任何附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36中的保守氨基酸序列區(qū)域的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼包括選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的序列的多肽的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的兩條或更多、三條或更多或四條序列的多肽的核酸分子，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和示于任何附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36中的保守氨基酸區(qū)域的核酸分子，以及這些核酸分子的互補體，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花、硫化葉菌、Aeropyum、高梁或西紅柿的核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包括選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95的序列的多肽的核酸分子，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子。本發(fā)明包括和提供所述核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包括選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或更多、三條或更多或四條序列的多肽的核酸分子，不包括衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子。在本發(fā)明的方法實施方案中，本發(fā)明的任何核酸序列或多肽序列或其片段，可以被用于檢索相關(guān)序列。在優(yōu)選實施方案中，選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的序列被用于檢索相關(guān)序列。在優(yōu)選實施方案中，選自SEQIDNO31、34-36、59-60、88-89或91的序列被用于檢索相關(guān)序列。在另一個實施方案中，任何示于附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36的基序或保守序列區(qū)域被用于檢索相關(guān)序列。在一個優(yōu)選實施方案中，選自SEQIDNO39-42或46-49的序列被用于檢索相關(guān)序列。在一個實施方案中，SEQIDNO39-42、46-49或92-95中的一種或多種被用于檢索相關(guān)序列。如在此所用“檢索相關(guān)序列”是指確定兩條序列之間相關(guān)程度的任何方法，包括但不限于比較序列同源性的檢索例如，PBLAST檢索數(shù)據(jù)庫來確定與單氨基酸序列的相關(guān)程度。其他檢索可以采用基于模型的方法(profilebasedmethods)進(jìn)行，例如HMM(HiddenMarkovmodel)META-MEME(http://metameme.sdsc.edu/mhmm-links.html)、PSI-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。本發(fā)明包括和提供通過附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-b和36一種或多種對比發(fā)現(xiàn)的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。在此所用，當(dāng)核酸分子序列來自特定生物體、種類、生態(tài)型等，則核酸分子被認(rèn)為是“衍生自”該生物體、種類、生態(tài)型等。因此，“衍生自”包括通過如PCR獲得的核酸分子的拷貝，以及具有與原始生物體、種類、生態(tài)型等相同的核酸序列的合成的核酸分子。同樣地，當(dāng)核酸分子被用于編碼多肽，該多肽被認(rèn)為是“衍生自”核酸分子，無論該多肽是從核酸分子酶催化生成或根據(jù)核酸分子的內(nèi)在序列信息合成的。本發(fā)明包括上述保守序列及其片段在轉(zhuǎn)基因植物、其他生物體中的用途和其他用途，包括但不限于下面描述的。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，核酸分子包括編碼質(zhì)體運輸肽的核苷酸序列，其被可操作地融合到編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段的核酸分子上。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼突變的生育酚尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。如在此所用，突變的酶是任何含有不同于相同類型的野生型酶的相同位置上的氨基酸的氨基酸的酶。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的核酸序列的另一個方面，核酸能夠編碼一種不同于任何這些蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，其中一個或多個氨基酸被刪除、取代或添加，而不改變功能。例如，應(yīng)當(dāng)理解，能夠編碼這種保守型氨基酸取代的密碼子在本領(lǐng)域是已知的。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的核酸被認(rèn)為是被導(dǎo)入的核酸分子。如果核酸分子由于人工操作被插入到細(xì)胞或生物體中，無論多么間接，則該核酸分子被認(rèn)為是“被導(dǎo)入的”。被導(dǎo)入的核酸分子的例子包括但不限于通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、注射和發(fā)射(Projection)被導(dǎo)入到細(xì)胞中的核酸，以及通過接合、胞吞、吞噬等導(dǎo)入生物體的那些核酸。本發(fā)明的核酸分子的亞型是片段核酸分子。片段核酸分子可以由本發(fā)明的核酸分子的重要部分或絕大部分組成，如特別公開的那些?；蛘?，片段可以包括較小的寡核苷酸(具有從約15到約400的核苷酸殘基和更加優(yōu)選的，約15到約30個核苷酸殘基，或約50到約100個核苷酸殘基，或約100到約200個核苷酸殘基，或約200到約400個核苷酸殘基，或約275到約350個核苷酸殘基)。本發(fā)明的一種或多種核酸分子的片段可以是探針，特別是PCR探針。PCR探針是能夠在另一個核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)中起動聚合酶活性的核酸分子。確定PCR探針結(jié)構(gòu)的各種方法和PCR技術(shù)存在于本領(lǐng)域。采用程序如Primer3(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)、STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)或GeneUp(Pesoleetal.，BioTechniques，25112-123(1998))的計算機產(chǎn)生的檢索，如可以用于確定可能的PCR引物。在某些條件下，本發(fā)明的核酸分子或其片段能夠特異地雜交到其他核酸分子上。本發(fā)明的核酸分子包括那些特異地雜交到那些在此公開的核酸分子上，如編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90任何之一的核酸，及其互補體。本發(fā)明的核酸分子包括那些特異地雜交到包括選自SEQIDNO31、34-36、59-60或91的之一的核酸分子上的核酸分子，及其互補體。如在此所用，如果兩個核酸分子能夠形成反平行、雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，那么這兩個分子被認(rèn)為能夠特異地相互雜交。核酸分子被認(rèn)為是另一個核酸分子的“互補體”，如果它們具有完全互補性。在此所用，當(dāng)分子之一的每個核苷酸與其他分子的核苷酸互補，核酸被認(rèn)為具有“完全互補性”。如果兩個分子能夠相互雜交以足夠的穩(wěn)定性來使得至少在常規(guī)的“低嚴(yán)謹(jǐn)”條件下保持相互退火，這兩個分子被認(rèn)為具有“最低限度的互補性”。類似地，如果能夠相互雜交，以足夠的穩(wěn)定性來使得至少在常規(guī)的“高嚴(yán)謹(jǐn)”條件下保持相互退火，分子被認(rèn)為具有“互補性”。常規(guī)的嚴(yán)謹(jǐn)條件被描述在Sambrooketal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSprisagHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)，和Haymesetal.，NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，DC(1985)。因此，脫離完全互補性是允許的，只要這種脫離不會完全妨礙分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。因此，為了使核酸分子作為引物或探針，其序列僅需要足夠互補性使得在所用的特定溶劑和鹽濃度條件下能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)條件為如6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)約45℃，接著用20-25℃的2.0XSSC洗脫，是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的，可見于CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NY(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募s2.0XSSC50℃到高嚴(yán)謹(jǐn)約0.2XSSC65℃進(jìn)行選擇。此外，洗滌步驟的溫度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)條件的室溫下約22℃升高到高嚴(yán)謹(jǐn)條件的約65℃。溫度和鹽可以被改變，或者溫度或鹽濃度可以保持不變，而其他變量被改變。在一個優(yōu)選實施方案中，在適度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，如約2.0XSSC和約65℃，本發(fā)明的核酸將特異地雜交到在此描述的一種或多種核酸分子及其互補體上，如那些編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90任何之一的核酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下如約0.2XSSC和約65℃，本發(fā)明的核酸將包括那些特異地雜交到一種或多種編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90任何之一的核酸分子，及其互補體上。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的核酸分子具有一種或多種編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸序列，或其互補體。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的核酸分子的一種或多種與編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸序列的一種或多種，及其互補體和片段具有約100％和約90％序列同一性。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的核酸分子的一種或多種與編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸序列的一種或多種，及其互補體和片段具有約100％和約95％序列同一性。在本發(fā)明的更加優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子的一種或多種與編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸序列的一種或多種，及其互補體和片段具有約100％和約98％序列同一性。在本發(fā)明的更加優(yōu)選方面，本發(fā)明的核酸分子的一種或多種與編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸序列的一種或多種，及其互補體和片段具有約100％和約99％序列同一性。在一個優(yōu)選實施方案中，百分同一性計算采用BLASTN或BLASTP(默認(rèn)值、參數(shù)、版本2.0.8，Altschuletal.，NucleicAcidsRes.，253389-3402(1997))進(jìn)行。本發(fā)明的核酸分子還編碼同系物多肽。如在此所用，同系物多肽分子或其片段是第二種品種的相對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子或其片段(如玉米核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基是擬南芥屬核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基的同系物)。同系物還可以通過分子進(jìn)化或DNA改組技術(shù)來生成，使得該分子至少保留起始多肽的一種功能或結(jié)構(gòu)特征(參見，如US5,811,238)。在另一個實施方案中，同系物選自紫苜蓿、擬南芥屬(Arabidopsis)、大麥、蕓苔(Brassicacampestris)、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、嫩莖花椰菜、甘藍(lán)(Cabbage)、菜籽(Canola)、柑桔(Citrus)、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬(Allium)、亞麻(flax)、觀賞性植物、花生、胡椒、馬鈴薯、油菜籽(rapeseed)、稻、黑麥、高梁、草莓、甘蔗、甜菜(Sugarbeet)、西紅柿、小麥、白楊(Poplar)、松樹、冷杉(fir)、桉樹(eucalyptus)、蘋果樹(apple)、萵苣、豆科(lentils)、葡萄(grape)、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆屬(phaseolus)、海甘藍(lán)(crambe)、芥菜(mustard)、蓖麻子(castorbean)、芝麻(sesame)、棉籽(cottonseed)、亞麻子(linseed)、紅花(safflower)和油棕櫚(oilpalm)。更加特別地，優(yōu)選的同系物選自菜籽、玉米、蕓苔、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油菜籽、紅花、油棕櫚、亞麻和向日葵。在更加優(yōu)選的實施方案中，同系物選自菜籽、油菜籽、玉米、蕓苔、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、大豆、向日葵、紅花、油棕櫚和花生。在特別優(yōu)選的實施方案中，同系物是大豆。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，同系物是菜籽。在特別優(yōu)選的實施方案中，同系物是甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸分子及其互互補體和其片段；或者優(yōu)選編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸分子及其互互補體被用于獲得這種同系物。在本發(fā)明的還有另一個方面，由于多肽可以具有一種或多種保守性氨基酸變化，從而編碼多肽的核酸序列具有序列差異，本發(fā)明的核酸分子可以包括不同于編碼多肽或其片段的序列。應(yīng)當(dāng)理解，能夠編碼這種保守性氨基酸取代的密碼子在本領(lǐng)域是已知的。本領(lǐng)域熟知天然序列中的一個或多個氨基酸可以用其他氨基酸取代，取代的氨基酸的電荷和極性與天然氨基酸的相似，即保守性氨基酸取代。天然多肽序列中氨基酸的保守取代可以從氨基酸所屬類別的其他成員中選擇。氨基酸可以被分成如下四組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。在這些不同組中的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(負(fù)電荷)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(正電荷)氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非極性(疏水性)氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸?？梢酝ㄟ^用來自這些組之一中的另一種氨基酸替代相同組的一種氨基酸，來進(jìn)行天然多肽序列中的保守性氨基酸取代。在優(yōu)選方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段的生物學(xué)功能等價物可以具有十個或更少的保守性氨基酸變化，更優(yōu)選地7個或更少的保守性氨基酸變化，和最優(yōu)選為5個或更少的保守性氨基酸變化。因此，這些編碼核苷酸序列將具有相應(yīng)的堿基取代，使得其編碼本發(fā)明的多肽的生物學(xué)功能性等價物形式。應(yīng)當(dāng)理解，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中一些氨基酸用其他氨基酸取代，而不使該結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力產(chǎn)生可檢測的丟失，例如，抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子的結(jié)合位點。由于蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能活性，在蛋白質(zhì)序列中可以進(jìn)行氨基酸序列取代，并且其潛在的DNA編碼序列，但是還可以得到具有類似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明包括對本發(fā)明的蛋白質(zhì)肽序列或其片段，或者編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列進(jìn)行的各種改變，而沒有可檢測地丟失其生物學(xué)利用或活性。應(yīng)當(dāng)理解，能夠編碼這種氨基酸改變的密碼子在本領(lǐng)域是已知的。在進(jìn)行這種改變時，考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域通曉親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)功能中的重要性(KyteandDoolittle，J.Mol.Biol.，157105-132(1982))。一般認(rèn)為，氨基酸的相關(guān)親水特性導(dǎo)致得到的多肽的二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)隨后限定蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等。根據(jù)疏水性和電荷特征，各種氨基酸具有確定的親水指數(shù)，(KyteandDoolittle，J.Mol.Biol.，157105-132(1982))；這些氨基酸為異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在進(jìn)行這種改變時，親水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1之內(nèi)的那些是特別優(yōu)選的，親水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的是更加特別優(yōu)選的。還應(yīng)當(dāng)理解，在本領(lǐng)域中，根據(jù)親水性可以有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。US4,554,101提出蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性受其鄰近的氨基酸的親水性的控制，與蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)。如US4,554,101中提出，如下親水性值被賦予氨基酸殘基精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、，纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在進(jìn)行這種變化時，親水性值在±2之內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，親水性值在±1之內(nèi)的氨基酸的取代是特別優(yōu)選的，親水性值在±0.5之內(nèi)的氨基酸的取代是更加特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的還有一個方面，由于一個或多個密碼子用編碼原先所編碼的氨基酸的保守取代的密碼子替代，一種或多種本發(fā)明的核酸分子在核酸序列上不同于那些在此提供了特定序列的核酸。本發(fā)明的制劑包括核酸分子，其至少編碼本發(fā)明的多肽的約連續(xù)10個氨基酸的區(qū)域，更加優(yōu)選至少本發(fā)明的多肽的約連續(xù)的25、40、50、100或125個氨基酸區(qū)域。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的任何核酸分子可以被可操作地連接到啟動子區(qū)域，啟動子在植物細(xì)胞中起作用來促使mRNA分子生成，其中被連接到啟動子的核酸分子與該啟動子是異源。在此所用“異源”是指不是天然在一起的。非植物基因的編碼序列的性質(zhì)使得它們與植物基因以及許多其他在植物中表達(dá)的異源基因區(qū)分開。例如，細(xì)菌的平均A+T含量比植物中的高。任何生物體的基因組(和基因)的A+T含量是生物體的特征，反映其進(jìn)化史。雖然在任何一種生物體中，基因具有類似A+T含量，生物體之間的A+T含量變化極大。例如，一些芽孢桿菌屬的種(Bacillus)具有A+T最豐富的基因組，而一些鏈霉菌屬(Steptomyces)的種屬于A+T最少的基因組(約30-35％A+T)。由于遺傳密碼的簡并性，任何氨基酸的密碼子選擇的有限個數(shù)，例如一些芽孢桿菌屬種類的結(jié)構(gòu)性編碼序列的“過度”A+T的大部分存在于密碼子的第三個位置上。也就是說，一些芽孢桿菌屬種類的基因在許多密碼子上以A或T作為第三個核苷酸。因此，A+T含量部分地決定了密碼子選擇的偏向。此外，顯然基因在它們所進(jìn)行進(jìn)化的生物體中進(jìn)化以得到最大功能。這表明存在于來自一種生物體的基因的特定核苷酸序列在生物體中除了編碼特定長度的氨基酸外不具有其他作用，可能在其他生物體(如轉(zhuǎn)錄啟動子或終止子、polyA添加位點、內(nèi)含子剪接位點或特定mRNA降解信號)中作為基因控制元件?？赡芰钊梭@奇的是，這種錯讀信號不是異源基因表達(dá)的更加常見的特征，但是這可以部分地解釋為許多生物體中相對一致的A+T含量(約50％)。該A+T含量加上遺傳密碼子的性質(zhì)顯然限制任何特定寡核苷酸序列發(fā)生的可能性。因此，相對于蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的基因，具有50％A+T含量的大腸桿菌基因含有任何富含A+T的特定片段的可能性更小。例如，在細(xì)菌基因和植物基因之間的情況也是如此。任何本發(fā)明的核酸分子可以通過本領(lǐng)域已知方法改變，來使核酸分子中的密碼子更適合于核酸分子所在的生物體。也就是說，本發(fā)明包括修飾在此公開的任何核酸分子來在宿主生物體中改進(jìn)密碼子選擇。優(yōu)選地，包含任何保守性A+T堿基或G+C堿基的區(qū)域被破壞，由于這些區(qū)域自互補被預(yù)期極其可能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。因此，插入異源堿基對將降低自互補的二級結(jié)構(gòu)形成的可能性，自互補的二級結(jié)構(gòu)已知會在一些生物體中抑制轉(zhuǎn)錄/或翻譯。在大多數(shù)情況下，可以通過采用不含超過5個連續(xù)A+T或G+C的序列來最小化不利影響。蛋白質(zhì)和肽分子一類制劑包括一種或多種由本發(fā)明的核酸制劑編碼的多肽分子。特定的優(yōu)選類的蛋白質(zhì)是具有選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列及其片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括具有示于附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、35a-35b和36任何之一中的保守氨基酸序列區(qū)的多肽。在一種實施方案中，本發(fā)明包括包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽。本發(fā)明包括和提供所述的基本上純的多肽，其中一種以上氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。在另一個更加優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或更多、三條或更多、或四條序列的多肽在另一個實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和示于附圖2a-2c、3a-3c、25a-25c、33a-33c、34a-34b、35a-35b和36任何之一中的保守氨基酸序列的區(qū)域的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽。本發(fā)明包括和提供所述基本上純的多肽，其中一種以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或更多、三條或更多、或四條序列的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括具有示于附圖2a-2c、3a-3c、25a-25c、33a-33c、34a-34b、35a-35b和36任何之一中的保守氨基酸序列區(qū)域的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花、硫化葉菌、Aeropyum、高梁或西紅柿的核酸分子的多肽。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子的多肽。本發(fā)明包括和提供所述基本上純的多肽，其中一種以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49和92-95。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或多條、三條或多條，或四條序列的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子的多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和示于附圖2a-2c、3a-3c、25a-25c、33a-33c、34a-34b、35a-35b和36任何之一中的保守氨基酸序列的區(qū)域的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的序列的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子的多肽。本發(fā)明包括和提供基本上純的多肽，其中一條以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的兩條或多條、三條或多條，或四條序列的多肽，不包括衍生自來源于點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、菜籽、棉花或西紅柿的核酸分子的多肽。多肽制劑可能具有C-末端或N-末端氨基酸序列延伸。一種類型的N-末端延伸在優(yōu)選實施方案中被采用，是質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽。當(dāng)質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽被采用時，可以被可操作地連接到N-末端序列上，從而使制劑多肽定位到質(zhì)體上。在本發(fā)明的實施方案中，可以采用任何合適的質(zhì)體導(dǎo)向(targeting)序列。如果合適，質(zhì)體導(dǎo)向序列可以被用于替代天然的質(zhì)體導(dǎo)向序列，例如，替代天然存在于生育酚尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶中的CTP。在另一個實施方案中，可以采用與在此描述的與任何尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)或其片段異源的質(zhì)體導(dǎo)向序列。在另一個實施方案中，可以采用任何合適的被修飾的質(zhì)體導(dǎo)向序列。在另一個實施方案中，質(zhì)體導(dǎo)向序列是CTP1序列(參見WO00/61771)。在優(yōu)選方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)被靶向于質(zhì)體，采用天然轉(zhuǎn)運肽序列或異源的轉(zhuǎn)運肽序列。當(dāng)為對應(yīng)于非高等植物如藍(lán)綠藻的核酸序列的核酸序列時，這種核酸序列可以被改進(jìn)來將蛋白質(zhì)的編碼序列結(jié)合到質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽核酸序列上。如在此所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽分子”或“多肽”包括任何包含5個或更多氨基酸的分子。在本領(lǐng)域已知，蛋白質(zhì)、肽或多肽分子可以被修飾，包括翻譯后修飾，如但不限于二硫鍵形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如在此所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽分子”或“多肽”包括通過任何生物的或非生物的方法改進(jìn)的任何蛋白質(zhì)。術(shù)語“氨基酸”是指所用天然的L-氨基酸。這種定義是指包括正亮氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸、高半胱氨酸和高絲氨酸。制備一種或多種蛋白質(zhì)或其片段、肽分子或多肽分子可以通過化學(xué)合成、或更加優(yōu)選通過在合適的細(xì)菌或真核宿主中表達(dá)。用于表達(dá)的合適方法被描述在Sambrooketal.，InMolecularCloning，ALaboratoryManual，2ndEdition，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)或類似文章中。“蛋白質(zhì)片段”是肽或多肽分子，其氨基酸序列包括該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的集合。包含一種或多種非來源于該蛋白質(zhì)的附加肽區(qū)域的蛋白質(zhì)或其片段是一種“融合”蛋白。這種分子被衍生來含有糖或其他成分(例如匙孔血藍(lán)蛋白)。本發(fā)明的融合蛋白或肽分子優(yōu)選通過重組方法制備。另一種制劑包括蛋白質(zhì)、肽分子或多肽分子，或其片段或融合，包含SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90或其片段，其中保守的、非必要的或非相關(guān)的氨基酸殘基已經(jīng)被添加、取代或刪除。用于設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改進(jìn)的計算化方法在本領(lǐng)域是已知的(DahiyatandMayo，Science，27882-87(1997))。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、肽或多肽還可以是同系物蛋白質(zhì)、肽或多肽。如在此所用，同系物蛋白質(zhì)、肽或多肽或其片段是其在第二種種類中對應(yīng)的蛋白質(zhì)、肽或多肽或其片段。同系物還可以通過分子進(jìn)化或DNA改組技術(shù)來生成，使得該分子保留至少一種原始的功能或結(jié)構(gòu)特征(參見如US5,811,238)。在另一個實施方案中，同系物是選自紫苜蓿、擬南芥屬、大麥、嫩莖花椰菜(broccoli)、甘藍(lán)、菜籽、柑桔、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬、亞麻、觀賞性植物、花生、胡椒(pepper)、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、高梁、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉(fir)、桉樹(eucalyptus)、蘋果、萵苣、豆科、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米和菜豆屬。更加特別地，優(yōu)選的同系物選自菜籽、油菜籽、玉米、蕓苔、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、大豆、海甘藍(lán)、芥菜(mustard)、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕櫚、亞麻和向日葵。在甚至更加優(yōu)選的實施方案中，同系物選自菜籽、油菜籽、玉米、蕓苔、Brassicanapus、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、大豆、向日葵、紅花、油棕櫚和花生。在優(yōu)選實施方案中，同系物是大豆。在優(yōu)選實施方案中，同系物是菜籽。在優(yōu)選實施方案中，同系物是甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸分子或其互補體和片段可以被用于獲得這種同系物。本發(fā)明的制劑包括蛋白質(zhì)和其片段，其包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)的至少約連續(xù)的10個氨基酸區(qū)域，優(yōu)選包括至少約連續(xù)20個氨基酸區(qū)域，甚至優(yōu)選包括至少約連續(xù)25、35、50、75或100氨基酸區(qū)域。在另一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括在約10個和約25個連續(xù)氨基酸之間的區(qū)域、更加優(yōu)選地在約20個和約50個連續(xù)氨基酸之間的區(qū)域和甚至更加優(yōu)選在約40個和約80個連續(xù)氨基酸之間的區(qū)域。植物構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化體一種或多種本發(fā)明的核酸分子可被用于植物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。外源遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，植物細(xì)胞再生到完整的、具有繁殖能力或不育的植物中。外源遺傳物質(zhì)是能夠被插入到任何生物體中的任何遺傳物質(zhì)，無論是天然的或其他任何來源的。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，外源遺傳物質(zhì)包含本發(fā)明的核酸序列，更優(yōu)選地是編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的核酸。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的外源遺傳物質(zhì)包含編碼選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列或其互補體和片段的核酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，外源遺傳物質(zhì)包含編碼選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90氨基酸序列的核酸序列，或選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的片段。在本發(fā)明的實施方案中，編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶或其片段的外源遺傳物質(zhì)被插入到具有一種或多種其他額外基因的植物中。在一個實施方案中，優(yōu)選的基因組合包括本發(fā)明的核酸分子與一種或多種如下基因tyrA(如WO02/089561和Xiaetal.，J.Gen.Microbiol.，1381309-1316(1992))、生育酚環(huán)化酶(如WO01/79472)、預(yù)苯酸脫氫酶、dxs(如Loisetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110(1998))、dxr(如US2002/0108814A和Takahashietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)，9879-9884(1998))、GGPPS(如BartleyandScolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470(1994))、HPPD(如Norrisetal.，PlantPhysiol.，1171317-1323(1998))、GMT(如US10/219,810，2002年8月16日申請)、tMT2(如US10/279,029，2002年10月24日申請)、AANTI(如WO02/090506)、IDI(E.C.5.3.3.2；Blancetal.，InPlantGeneRegister，PRG96-036；和Satoetal.，DNARes.，4215-230(1997))，GGH(Graβesetal.，Planta.213-620(2001))，或尿黑酸雙加氧酶的植物定向進(jìn)化同源基因(ortholog)和反義構(gòu)建體(Kridletal.，SeedSci.Res.，1209219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)247-53(1989)；Nawrath，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12764(1994)；Cyanobase，www.kazusa.orjp/cyanobase；Smithetal，PlantJ.，1183-92(1997)；WO00/32757；ExPASyMolecularBiologyServer，http://us.expasy.org/enzyme；MT1WO00/10380；gcpE，WO02/12478；SaintGuilyetal.，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Satoetal.，J.DNARes.，7(1)31-63(2000))。在這種組合中，在一些農(nóng)作物植物，如菜籽，優(yōu)選啟動子是napin啟動子，優(yōu)選的質(zhì)體導(dǎo)向序列是CTP1序列。優(yōu)選基因產(chǎn)物被靶向到質(zhì)體上。在優(yōu)選組合中，編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子和編碼任何如下酶的核酸分子tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、tMT2、MT1、GCPE、AANT1、IDI、GGH、GMT或尿黑酸雙加氧酶的植物定向進(jìn)化同源基因和反義構(gòu)建體被導(dǎo)入到植物中。對于上述任何組合，編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子編碼包含選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的序列的多肽。在另一個優(yōu)選實施方案中，編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸分子編碼SEQIDNO39-42、46-49和92-95的一種或多種。在優(yōu)選實施方案中，尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶多肽不具有來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、小麥、韭、菜籽、棉花或馬鈴薯的核酸的氨基酸序列。這種遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到單子葉植物或雙子葉植物中，包括但不限于菜籽、谷物(corn)、大豆、擬南芥型菜豆(Arabidopsisphaseolus)、花生、紫苜蓿、小麥、稻、燕麥、高梁、油菜籽、黑麥、tritordeum、黍類、羊茅(fescue)、多年生黑麥草(ryegrass)、甘蔗、酸果(cranberry)、番木瓜(papaya)、香蕉、紅花、油棕櫚、亞麻、香瓜(muskmelon)、蘋果、黃瓜、石斛(dendrobium)、劍蘭(gladiolus)、菊花(chrysanthemum)、百合(lilialea)、棉花、桉樹、向日葵、蕓苔、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、草坪草、sugarbeet、咖啡樹(coffee)和薯蕷屬(dioscorea)(Christou，InParticleBomzbardmentforGeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit.AcademicPress，SanDiego，CA(1996))，菜籽、玉米、蕓苔、歐洲油菜(Brassicanapus)、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)、油菜籽、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕櫚、亞麻和向日葵是優(yōu)選的。canola，油菜籽，棉花，玉米(corn)，蕓苔(Brassicacampestris)，歐洲油菜，甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)，大豆，向日葵，紅花，油棕櫚，花生是優(yōu)選的。在更加優(yōu)選實施方案中，遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)中。在另一個特別優(yōu)選實施方案中，遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到大豆中。編碼蛋白質(zhì)的核酸分子的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致多肽在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)或過表達(dá)。由本發(fā)明的核酸分子編碼的一種或多種蛋白質(zhì)或其片段在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或被轉(zhuǎn)化植物中被過表達(dá)。這種表達(dá)或過表達(dá)可能是外源遺傳物質(zhì)的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的結(jié)果。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的α-生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的γ-生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的δ-生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的β-生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的生育三烯酸(tocotrienols)水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的α-生育三烯酸水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的γ-生育三烯酸(tocotrienols)水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的δ-生育三烯酸水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的β-生育三烯酸水平。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)或過表達(dá)在該植物中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)體醌醇(plastoquinols)水平。在任何在此描述的實施方案中，γ-生育酚、α-生育酚或兩者的升高導(dǎo)致β-生育酚、δ-生育酚或兩者的相對比例下降。類似地，γ-三烯生育酚(tocotrienol)、α-三烯生育酚或兩者的升高導(dǎo)致β-三烯生育酚、δ-三烯生育酚或兩者的相對比例下降。在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽在植物中表達(dá)和過度表達(dá)，在該植物或該植物的組織中產(chǎn)生相對高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化植物或植物組織的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白或其片段水平。在一些實施方案中，生育酚生物合成路徑的一種或多種產(chǎn)物的水平上升超過約10％、或更加優(yōu)選超過約25％、35％、50％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、1,000％、2,000％或2,500％，包括任何一種或多種生育酚，α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚、三烯生育酚、α-三烯生育酚、γ-三烯生育酚、δ-三烯生育酚、β-三烯生育酚(tocotrienols)。產(chǎn)物水平上升是在整個生物體中如植物中或限制在生物體的一個或多個特定器官或組織中。例如，產(chǎn)物水平可能在植物的一個或多個組織和器官中，包括但不限于根、塊莖、莖、葉、柄、果實、漿果、堅果(nut)、樹皮、莢、種子和花。優(yōu)選器官是種子。在一些實施方案中，一種或多種生育酚生物合成路徑的產(chǎn)物，包括任何一種或多種生育酚，α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚、三烯生育酚、α-三烯生育酚、γ-三烯生育酚、δ-三烯生育酚、β-三烯生育酚升高，使得它們構(gòu)成生物體或組織總生育酚含量的約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上。產(chǎn)物水平上升是在整個生物體中如植物中或限制在生物體的一個或多個特定器官或組織中。例如，產(chǎn)物水平可能在植物的一個或多個組織和器官中，包括但不限于根、塊莖、莖、葉、柄、果實、漿果、堅果、樹皮、莢、種子和花。優(yōu)選器官是種子。在優(yōu)選實施方案中，參與生育酚、三烯生育酚或質(zhì)體醌醇生物合成的酶在種子中表達(dá)將會導(dǎo)致γ-生育酚水平升高，這是由于這些組織中缺乏高水平的GMT活性。在另一個優(yōu)選實施方案中，參與生育酚、三烯生育酚或質(zhì)體醌醇合成的酶在光合組織中表達(dá)將會導(dǎo)致α-生育酚升高，這是由于這些組織中的GMT活性水平相對高于種子組織中的同一活性。在另一個優(yōu)選實施方案中，參與生育酚、三烯生育酚或質(zhì)體醌醇生物合成的酶在種子中表達(dá)將會導(dǎo)致植物中的總生育酚、三烯生育酚或質(zhì)體醌醇水平升高。在一些實施方案中，生育酚水平或種類如α-生育酚被改變。在一些實施方案中，三烯生育酚水平被改變。這種改變可以與具有類似背景的植物比較。在另一方實施方案中，可以通過導(dǎo)入編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的基因來提高天然生產(chǎn)高水平α-生育酚水平、α-三烯生育酚水平或兩者的植物(如向日葵)中的α-生育酚水平、α-三烯生育酚水平或兩者。在一個優(yōu)選方面，類似的遺傳背景是被比較的生物體共有約50％或更高核遺傳物質(zhì)的背景。在更加優(yōu)選的方面，類似的遺傳背景是被比較的生物體共有約75％或更高，甚至更加優(yōu)選約90％或更高的核遺傳物質(zhì)的背景。在另一個甚至更加優(yōu)選方面，類似遺傳背景是其中被比較的生物體是植物的背景，除了采用植物轉(zhuǎn)化技術(shù)最先導(dǎo)入的任何遺傳物質(zhì)，該植物是等基因的。在另一個優(yōu)選實施方案中，在轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)或過表達(dá)本發(fā)明的多肽可能產(chǎn)生對各種應(yīng)激的耐受，如對氧氣或臭氧的氧化應(yīng)激耐受、UV耐受、耐寒(cold)、耐受真菌/微生物病原體。如在此所用，在優(yōu)選方面，對應(yīng)激的耐受或抵抗通過植物的能力來確定，當(dāng)通過應(yīng)激如寒冷攻擊來制備產(chǎn)量高而不具有這種對應(yīng)激耐受或抵抗的植物的植物。在本發(fā)明的特別優(yōu)選方面，對應(yīng)激(stress)的耐受或抗性的測定是通過相對于與該耐受或抗性的植物(除了該植物降低表達(dá)的之外)，具有類似遺傳背景的植物表達(dá)或過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段而進(jìn)行的。外源遺傳物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，通過使用設(shè)計用于該目的的DNA載體或構(gòu)建體。這種載體的設(shè)計一般屬于本領(lǐng)域的技術(shù)(參見PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Clark(ed.)，Springer，NY(1997))。構(gòu)建體或載體可能包括表達(dá)所選多肽的植物啟動子。在優(yōu)選實施方案中，在此描述的任何核酸分子可以被可操作地連接到啟動子區(qū)域，啟動子在植物細(xì)胞中導(dǎo)致mRNA分子生成。例如，可以采用任何在植物細(xì)胞中導(dǎo)致mRNA分子生成的啟動子，如在此描述的那些啟動子，但不限于此。在優(yōu)選實施方案中，啟動子是植物啟動子。許多在植物細(xì)胞中具有活性的啟動子在文獻(xiàn)中描述。這些啟動子包括胭脂堿合成酶(NOS)啟動子(Ebertetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，845745-5749(1987))、章魚堿合成酶(OCS)啟動子(其攜帶在腫瘤誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌(Agrobacteriamtamefaciens)質(zhì)粒上)、花葉病毒啟動子如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawtonetal.，PlantMol.Biol.，9315-324(1987))和CaMV35S啟動子(Odelletal.，Nature，313810-812(1985))、玄參花葉病毒35S-啟動子、核酮糖-1，5-二磷酸羧酸酶小亞基的光誘導(dǎo)啟動子(ssRUBISCO)、Adh啟動子(Walkeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，846624-6628(1987))、蔗糖合成酶啟動子(Yangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，874144-4148(1990))、R基因復(fù)合啟動子(Chandleretal.，ThePlantCell，11175-1183(1989))和葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子等。這些啟動子已經(jīng)被用于建立已經(jīng)在植物中被表達(dá)的DNA構(gòu)建體；參見如，WO84/02913。CaMV35S啟動子優(yōu)選用于植物中。已知的或被發(fā)現(xiàn)引起DNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子可被用于本發(fā)明。為了在植物的起始(source)組織，如葉、種子、根或莖中表達(dá)，優(yōu)選所用的啟動子在這些特定組織中具有相對高的表達(dá)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的組織特異性表達(dá)是特別優(yōu)選的實施方案。為了該目的，可以從大量組織或細(xì)胞特異性或增強表達(dá)基因的啟動子中選擇。文獻(xiàn)中報道的這種啟動子的例子包括豌豆的葉綠體谷氨酸合成酶GS2啟動子(Edwardsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，873459-3463(1990))、小麥的葉綠體果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)啟動子(Lloydetal.，Mol.Gen.Genet.，225209-216(1991))、馬鈴薯核光合ST-LS1啟動子(Stockhausetal.，EMBOJ.，82445-2451(1989))、擬南芥的絲氨酸/蘇氨酸激酶(PAL)啟動子和葡糖淀粉酶(CHS)啟動子。此外，被報道在光合活性組織中具有活性的是美洲落葉松(Larixlaricina的核酮糖-1，5-二磷酸羧酸酶(RbcS)啟動子、松樹cab基因cab6的啟動子(Yamamotoetal.，PlantCellPhysio.，35773-778(1994))、小麥Cab-l基因啟動子(Fejesetal.，PlantMol.Biol.，15921-932(1990))、菠菜的CAB-1基因啟動子(Lubberstedtetal.，PlantPhysiol.，104997-1006(1994))稻的cablR基因啟動子(Luanetal.，PlantCell.，4971-981(1992))、玉米的丙酮酸，正磷酸二激酶(PPDK)啟動子(Matsuokaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，909586-9590(1993))、煙草Lhcb1*2基因啟動子(Cerdanetal.，PlantMol.Biol.，33245-255(1997))、擬南芥SUC2蔗糖-H+同向轉(zhuǎn)運子啟動子(Truernitetal.，Planta.，196564-570(1995))和菠菜類囊體膜蛋白質(zhì)啟動子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)。葉綠素a/b結(jié)合蛋白的其他啟動子也可以被用于本發(fā)明，例如白色芥菜的LhcB基因和PsbP基因啟動子(Sinapisalba；Kretschetal.，PlantMol.Biol.，28219-229(1995))。為了在植物的sink組織中表達(dá)，例如馬鈴薯植物的塊莖、西紅柿果實，或者玉米、稻和大麥種子，優(yōu)選在本發(fā)明中采用的啟動子在這些特異性組織中具有相對高的表達(dá)。具有塊莖特異性或塊莖增強表達(dá)的基因的大量啟動子是已知的，包括I類patatin啟動子(Bevanetal.，EMBOJ.，81899-1906(1986)；Jeffersonetal.，PlantMol.Biol.，14995-1006(1990))、馬鈴薯塊莖ADPGPP基因啟動子，大小亞基，蔗糖合成酶啟動子(SalanoubatandBelliard，Gene，6047-56(1987)，SalanoubatandBelliard，Gene，84181-185(1989)、主要塊莖蛋白包括22kd的蛋白質(zhì)復(fù)合體和蛋白酶抑制劑的啟動子(Hannapel，PlantPhysiol.，101703-704(1993))、顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因啟動子(GBSS)(Visseretal.，PlantMol.Biol.，17691-699(1991)和其他的I和II類patatin啟動子(Koster-Topferetal.，Mol.Gen.Genet.，219390-396(1989)；Migneryetal.，Gene.，6227-44(1988)。其他啟動子可以被用于在特定組織中表達(dá)多肽，如種子或果實。事實上，在優(yōu)選實施方案中，所用的啟動子是種子特異性啟動子。這種啟動子的例子包括來自這種基因的5’調(diào)控區(qū)如napin(Kridletal.，SeedSci.Res.，1209219(1991))、菜豆蛋白(phasedin)(Bustosetal.，PlantCell，1(9)839-853(1989))、大豆胰島素抑制劑(Riggsetal.，PlantCell，1(6)609-621(1989))、ACP(Baersonetal.，PlantMol.Biol.，22(2)255-267(1993))、硬酯酰-ACP脫氫酶(Slocombeetal.，PlantPhysiol.，104(4)167-176(1994)、大豆β-conglycinin的α’亞基(soy7s，(Chenetal，Pro.Natl.Acad.Sci.，838560-8564(1986)))，和oleosin(參見，如Hongetal.，PlantMol.Biol.，34(3)549-555(1997))。其他例子包括β-conglycinin啟動子(Chenetal.，Dev.Genet.，10112-122(1989))。還包括玉米蛋白，其是一組存在于玉米胚乳中的存儲蛋白。玉米蛋白基因的基因組克隆已經(jīng)被分離(Pedersrnetal，Cell，291015-1026(1982)，和Russelletal.，TransgenicRes.，6(2)157-168)和來自這些克隆的啟動子也被使用，包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD和基因。其他啟動子如已知在玉米中起作用，包括如下基因的啟動子wary、Brittle、Shrunken2、分支酶I和II、淀粉合成酶、脫支酶、oleosin、谷蛋白和蔗糖合成酶。用于玉米胚乳表達(dá)的特別優(yōu)選啟動子是稻谷蛋白的啟動子，更特別是Osgt-1啟動子(Zhengetal.，Mol.CellBiol.，135829-5842(1993))。適合于在小麥中表達(dá)的啟動子的例子包括ADP葡萄糖焦合成酶(pyrosynthase)(ADPGPP)亞基，顆粒結(jié)合和其他淀粉合成酶、分支和脫支酶、胚發(fā)生豐富蛋白、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的啟動子。稻中的這種啟動子的例子包括ADPGPP亞基、顆粒結(jié)合和其他淀粉合成酶、分支酶、脫支酶、蔗糖合成酶和谷蛋白的那些啟動子。特別優(yōu)選啟動子是稻谷蛋白、Osgt-1的啟動子。大麥的這種啟動子的例子包括ADPGPP亞基、顆粒結(jié)合和其他淀粉合成酶、分支酶、脫支酶、蔗糖合成酶、大麥醇溶蛋白、胚球蛋白和糊粉特異性蛋白的啟動子。在種子中表達(dá)的優(yōu)選啟動子是napin啟動子。其他用于表達(dá)的優(yōu)選啟動子是Arcelin5啟動子。還可以采用根特異性啟動子。這種啟動子的例子是酸性幾丁質(zhì)酶基因啟動子(Samacetal.，PlantMol.Biol.，25587-596(1994))。還可以通過采用已經(jīng)被確定的CaMV35S啟動子的根特異性亞結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)在根組織中表達(dá)(Lametal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，867890-7894(1989))。其他根特異性啟動子包括由Conklingetal.，PlantPhysiol.，931203-1211(1990)報道的啟動子。其他優(yōu)選啟動子包括7Sα′(Beachyetal.，EMBOJ.，43047(1985)；Schuleretal.，NucleicAcidRes.，10(24)8225-8244(1982))；USP88和增強的USP88(美國專利申請US60/377,236，2002年5月3日申請，在此引入作為參考)；和7Sα，(美國專利申請US10/235,618)。其他可以被使用的啟動子被描述在，如美國專利US5,378,619；US5,391,725；US5,428,147；US5,447,858；US5,608,144；US5,608,144；US5,614,399；US5,633,441；US5,633,435；和US4,633,436中。此外，可以使用組織特異性增強子(Frommetal.，ThePlantCell，1977-984(1989))。具有目標(biāo)編碼區(qū)的構(gòu)建體或載體還包括核酸序列，其完全地或部分地起作用來終止該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄。大量這種序列被分離，包括Tr73′序列和NOS3′序列(Ingelbrechtetal.，ThePlantCell，1671-680(1989)；Bevanetal.，NucleicAcidsRes.，11369-385(1983))。在本發(fā)明植物表達(dá)構(gòu)建體中還提供調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以通過編碼目標(biāo)基因的DNA序列提供或者來自于不同基因來源的便利的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，例如，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)天然地與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識到在本發(fā)明的構(gòu)建體中可以采用在植物細(xì)胞中終止轉(zhuǎn)錄的任何便利轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。載體或構(gòu)建體還包括調(diào)控元件。這種元件的例子包括Adh內(nèi)含子1(Callisetal.，GenesandDevelop.，11183-1200(1987))、蔗糖合成酶內(nèi)含子(Vasiletal.，PlantPhysiol.，911575-1579(1989))和TMVω元件(Gallieetal.，ThePlantCell，1301-311(1989))。適當(dāng)時可以包括這些或其他的調(diào)控元件。載體或構(gòu)建體還包括可選擇的標(biāo)記?？蛇x擇標(biāo)記還可以被用于選擇含有外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細(xì)胞。這些標(biāo)記的例子包括但不限于neo基因(Potrykusetal.，Mol.Gen.Genet.，199183-188(1985))，其編碼卡那霉素抗性，可以被選擇來使用卡那霉素、RptII、G418、hpt等；bar基因編碼bialaphos抗性；突變的EPSP合成酶基因(Hincheeetal.，Bio/Technology，6915-922(1988)；Reynaertsetal.，SelectableandScreenableMarkers.InGelvinandSchilperoort，PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988)；Reynaertsetal.，SelectableandScreenableMarkers.InGelvinandSchilperoort，PlantMolecularBiologyManual，Kluwer，Dordrecht(1988))，aadA(Jonesetal.，Mol.Gen.Genet.(1987))，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因賦予bromoxynil抗性(Stalkeretal.，J.Biol.Chem.，2636310-6314(1988))；突變的乙酰乳酸(acetolactate)合成酶基因(ALS)賦予imidazolinone或磺脲抗性(EP0154204(1985年9月11日))、ALS(D′Halluinetal.，Bio/Technology，10309-314(1992))，和氨甲蝶呤抗性DHFR基因(Thilletetal.，J.Biol.Chem.，26312500-12508(1988))。載體或構(gòu)建體還可以包括轉(zhuǎn)運肽。還可以采用合適的葉綠體轉(zhuǎn)運肽的組合(EP0218571)。轉(zhuǎn)錄增強子還可以被包含作為載體DNA的一部分。DNA構(gòu)建體可以含有一種或多種5′非翻譯前導(dǎo)序列，其起增強從生成的mRNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)基因產(chǎn)物的作用。這種序列可以來自于被選擇來表達(dá)基因的啟動子，可以被特異性地改進(jìn)來增強mRNA的翻譯。這種區(qū)域還可以從病毒RNA、合適的真核基因或合成的基因序列中獲得。對于優(yōu)化轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的綜述參見Kozieletal.，PlantMol.Biol.，32393-405(1996)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)運肽是CTP1。載體或構(gòu)建體還可以包括可篩選的標(biāo)記?？珊Y選的標(biāo)記可被用于監(jiān)控表達(dá)。示例性的篩選標(biāo)記包括β-葡糖苷酶或uidA基因(GUS)是已知的，它們編碼各種已知化學(xué)顯色底物的酶(Jefferson，PlantMol.Biol，Rep.，5387-405(1987)；Jeffersonetal.，EMBOJ.，63901-3907(1987))；R-座位基因，其編碼在植物中調(diào)控花色素苷色素生成的產(chǎn)物(紅色)(Dellaportaetal.，Stadlersyntposium，11263-282(1988))；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，753737-3741(1978))、編碼各種顯色底物的酶的基因是已知的(如PADAC，發(fā)色頭孢菌素)；熒光素酶基因(Owetal.，Science，234856-859(1986))；xylE基因(Zukowskyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，801101-1105(1983))，其編碼轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Iatuetal.，Bio/Technol.，8241-242(1990))；酪氨酸酶基因(Katzetal.，J.Gen.Microbiol.，1292703-2714(1983))，其編碼能夠氧化酪氨酸為DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，多巴醌隨后濃縮為黑色素；α-半乳糖苷酶將會轉(zhuǎn)化為顯色的α-半乳糖底物。術(shù)語“可選擇或可篩選的標(biāo)記基因”中所包括的還有編碼可選擇標(biāo)記的基因，可選擇標(biāo)記的分泌可以被檢測為確定或篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。例子包括編碼可分泌的抗原的標(biāo)記，抗原可以通過抗體作用被確定，或甚至可分泌的酶，其可以通過酶促測定?？煞置诘牡鞍踪|(zhì)分為多種類型，包括可檢測的小的擴散蛋白(如通過ELISA檢測)、在細(xì)胞外溶液中可檢測的小的活性酶(如α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、膦絲菌素轉(zhuǎn)移酶)，或被插入或捕獲在細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)(例如包括前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)，如存在于延伸表達(dá)單位或煙草PR-S中的)。其他可能的可選擇和/或可篩選的標(biāo)記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。有許多方法可以將轉(zhuǎn)化的核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞中。一般認(rèn)為合適方法實際上包括將核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的任何方法，如通過農(nóng)桿菌感染或直接傳遞核酸分子，如通過PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，通過電穿孔或通過加速DNA包被的粒子等(Potrykus，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，42205-225(1991)；Vasil，PlantMol.Biol.，25925-937(1994))。例如，電穿孔被用于轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體(Frommetal.，Nature，312791-793(1986))。適合于將轉(zhuǎn)化DNA導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞的其他載體系統(tǒng)包括但不限于雙元人工染色體(BIBAC)載體(Hamiltonetal.，Gene，200107-116(1997))；和用RNA病毒載體轉(zhuǎn)染(Della-Cioppaetal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.(1996)，792(EngineeringPlantsforCommercialProductsandApplications，57-61)。其他載體系統(tǒng)還包括植物可選擇YAC載體，如那些在Mullenetal.，MolecularBreeding，4449-457(1988)中描述的。將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域是技術(shù)人員熟知的。已經(jīng)描述了四種將基因傳遞到細(xì)胞中的常規(guī)方法(1)化學(xué)方法(GrahamandvanderEb，Virology，54536-539(1973))；(2)物理方法例如微注射(Capecchi，Cell，22479-488(1980))、電穿孔(WongandNeumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.，107584-587(1982)；Frommetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，825824-5828(1985)；US5,384,253)；基因槍(JohnstonandTang，MethodsCellBiol.，43353-365(1994))；和真空滲入(Bechtoldetal.，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.，3161194-1199(1993))；(3)病毒載體(Clapp，Clin.Perinatol.，20155-168(1993)；Luetal.，J.Exp.Med.，1782089-2096(1993)；EglitisandAnderson，Biotechniques，6608-614(1988))；和(4)受體介導(dǎo)機制(Curieletal.，Hum.Gen.Ther.，3147-154(1992)，Wagneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，896099-6103(1992))?？梢允褂玫募铀俜椒òǎ缥⒘＾Z擊等。一種將轉(zhuǎn)化核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法是微粒轟擊。這種方法在YangandChristou(eds.)，ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer，OxfordPress，Oxford，England(1994)中評述。非生物微粒(微粒)可以用核酸包被，并通過推進(jìn)力呈遞到細(xì)胞中。示例的粒子包括那些由鎢、金、鉑等組成的。除了作為可重復(fù)轉(zhuǎn)化單子葉植物的有效方法外，微粒轟擊的特別優(yōu)勢在于既不使原生質(zhì)體分離(Cristouetal.，PlantPhysiol.，87671-674(1988))，也不要求對農(nóng)桿菌感染的易感性。通過加速將DNA傳遞到玉米細(xì)胞中的方法的示例性實施方案是biolisticsα-粒子呈遞系統(tǒng)，其可以被用于推進(jìn)用DNA包被的粒子穿過網(wǎng)篩，例如不銹鋼或Nytex網(wǎng)篩到覆蓋了培養(yǎng)在懸浮液中的玉米細(xì)胞的濾器表面上。Gordon-Kammetal.，描述了用DNA包被鎢粒子的基本程序(Gordon-Kammetal.，PlantCell，2603-618(1990))。網(wǎng)篩(screen)分散鎢核酸粒子，使得它們不會以大聚集體形式被傳遞給受體細(xì)胞。適合用于本發(fā)明的粒子傳遞系統(tǒng)是氦加速PDS-1000/氦槍，其可以從Bio-RadLaboratories(Bio-Rad，Hercules，CA)購買(Sanfordetal.，Technique，33-16(1991))。對于轟擊，懸浮液中的細(xì)胞在濾器上濃縮。被轟擊的含有細(xì)胞的濾器位于粒子停止平板下的適當(dāng)位置上。如果需要，在槍和被轟擊的細(xì)胞之間還放置一個或多個網(wǎng)篩?？蛇x擇地，未成熟的胚或其他靶細(xì)胞被排布在固體培養(yǎng)基上。被轟擊的細(xì)胞定位在微粒停止平板下的合適位置上。如果需要，在加速裝置和被轟擊的細(xì)胞之間還放置一個或多個網(wǎng)篩。通過采用在此列舉的技術(shù)，可以獲得瞬時表達(dá)標(biāo)記基因的1000或更多基因座的細(xì)胞。在轟擊后48h，表達(dá)外源基因產(chǎn)物的中心中的細(xì)胞數(shù)量通常范圍在1-10個，平均1-3個。在轟擊轉(zhuǎn)化中，可以優(yōu)化轟擊前的培養(yǎng)條件和參數(shù)來獲得最大數(shù)量的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。轟擊的物理和生物學(xué)參數(shù)在這種方法中是重要的。物理因素是那些涉及加工DNA/微粒沉淀物或那些影響大顆粒或微粒的飛行和速度的因素。生物學(xué)因素包括涉及在轟擊前和轟擊后的對細(xì)胞操作的所有步驟，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的滲透性有助于降低與轟擊相關(guān)的損傷，以及轉(zhuǎn)化的DNA的性質(zhì)，如線性化DNA或完整超螺旋質(zhì)粒。一般認(rèn)為，轟擊前的操作對于未成熟胚的成功轉(zhuǎn)化是重要的。在另一種可選擇的實施方案中，質(zhì)粒被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。公開的在高等植物中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法包括粒子槍傳遞含有可選擇標(biāo)記的DNA，通過同源重組將DNA導(dǎo)向質(zhì)?；蚪M(Svabetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，878526-8530(1990)；SvabandMaliga，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，90913-917(1993)；StaubandMaliga，EMBOJ.，12601-606(1993)；美國專利US5,451,513和US5,545,818)。因此，包括在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)轟擊參數(shù)的各個方面來全面優(yōu)化調(diào)節(jié)。特別期望調(diào)節(jié)物理參數(shù)如間隔距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓。還可以通過改進(jìn)影響受體細(xì)胞的生理狀態(tài)來最小化損傷降低因素，從而影響轉(zhuǎn)化和綜合效率。例如，調(diào)整滲透細(xì)胞的滲透狀態(tài)、組織水合和次培養(yǎng)階段或細(xì)胞周期來優(yōu)化轉(zhuǎn)化。根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉進(jìn)行其他常規(guī)調(diào)整。農(nóng)桿菌(Agrobalfeyium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種廣泛用于將基因?qū)胫参锛?xì)胞中的系統(tǒng)，DNA可以被導(dǎo)入到整個植物組織中，從而實現(xiàn)從原生質(zhì)體再生完整植物的需要。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物整合載體來將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中在本領(lǐng)域是已知的。參見，如在Fraleyetal.，Bio/Thechnology，3629-635(1985)和Rogersetal.，MethodsEnzymol.，153253-277(1987)中描述的方法。此外，Ti-DNA的整合是產(chǎn)生極少重排的相對精確的方法。被轉(zhuǎn)化的DNA區(qū)域由邊界序列限定，并且干擾DNA通常如所描述的被插入植物基因組(Spielmannetal.，Mol.Gen.Genet.，20534(1986))。現(xiàn)代農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌以及農(nóng)桿菌中復(fù)制，以方便如所述操作(Kleeetal.，InPlantDNAInfectiousAgents，HohnandSchell(eds.)，Springer-Verlag，NY，pp.179-203(1985))。而且，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化的載體的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)提高載體中的基因和限制性位點的排列以方便構(gòu)建能夠表達(dá)各種多肽編碼基因的載體。被描述的載體具有便于多重連接區(qū)域，側(cè)接為用于直接表達(dá)插入的多肽編碼基因的啟動子和聚腺苷酸化位點，適合用于本發(fā)明目的(Rogersetal.，MethodsEnzyrnol.，153253-277(1987))。此外，含有加臂(armed)的和去臂(disarmed)的Ti基因的農(nóng)桿菌可以被用于轉(zhuǎn)化。在這些農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有效的植物品種中，這是可選的方法，這是由于基因轉(zhuǎn)化的易行性和確定的特性。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常在一個染色體上含有單基因。這種轉(zhuǎn)基因植物被稱作為與被加入的基因雜合。更加優(yōu)選的是與被加入結(jié)構(gòu)基因是同型結(jié)合(homozygous)的轉(zhuǎn)基因植物；即轉(zhuǎn)基因植物含有兩種添加的基因，在染色體對的各個染色體上的相同基因座位點上的一個基因。純合子轉(zhuǎn)基因植物可以通過下述獲得，有性雜交(自交)自由分離子，含有單一加入基因的轉(zhuǎn)基因植物，使一些生成的種子發(fā)芽，并分析生成的植物中的目標(biāo)基因。還應(yīng)當(dāng)理解，兩種不同轉(zhuǎn)基因植物還可以雜交產(chǎn)生含有兩種自由分離的外源基因的子代。適當(dāng)子代子交能夠生成對于加入基因和編碼目標(biāo)多肽的外源基因來說是純化子的植物。還包括與父本植物回交和與非轉(zhuǎn)基因植物異型雜交，這是無性繁殖。進(jìn)行轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體可以采用磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法(參見，如Potrykusetal.，Mol.Gen.Genet.，205193-200(1986)；Lorzetal.，Mol.Gen.Genet.，199178(1985)；Frommetal.，Nature，319791(1986)；Uchimiyaetal.，Mol.Gen.Genet.，204204(1986)；Marcotteetal.，Nature，335454-457(1988))。將這些系統(tǒng)應(yīng)用于不同植物品系取決于從原生質(zhì)體再生那些特定植物品種的能力。從原生質(zhì)體再生谷類植物的示例方法被描述(Fujimuraetal.，PlantTissueCultureLetters，274(1985)；Toriyamaetal.，Theor.Appl.Genet.，20534(1986)；Yamadaetal.，PlantCellRep.，485(1986)；Abdullahetal.，Biotechnology，41087(1986))。為了轉(zhuǎn)化不能成功地從原生質(zhì)體中再生的植物品系，可采用將DNA導(dǎo)入完整細(xì)胞或組織中的方法。例如，從未成熟的胚或外植體再生谷類植物的方法是有效的，如(Vasil，Biotechnology，6397(1988))描述。此外，“粒子槍”或高速微粒技術(shù)可以被采用(Vasiletal.，BiolTechnology，10667(1992))。采用后一種技術(shù)，DNA在小金屬顆粒的表面上被攜帶過細(xì)胞壁，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，如(Kleinetal.，Nature，32870(1987)；Kleinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，858502-8505(1988)；McCabeetal.，BiolTechnology，6923(1988))所描述。金屬顆粒穿透多層細(xì)胞，以在組織外植體中轉(zhuǎn)化細(xì)胞。還可以采用其他細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法，包括但不限于直接DNA轉(zhuǎn)移到花粉中來將DNA導(dǎo)入植物(Hessetal.，InternRev.Cytol.，107367(1987)；Luoetal.，PlantMolBiol.Reporter，6165(1988))，通過將DNA直接注射到植物繁殖器官中(Penaetal.，Nature，325274(1987))，或者通過將DNA直接注射到未成熟的胚的細(xì)胞中，接著再水合干的胚(Neuhausetal.，Theor.Appl.Genet.，7530(1987))。從單一植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化株或各種轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物，在本領(lǐng)域是已知的(WeissbachandWeissbach，InMethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，SanDiego，CA，(1988))。這種再生和培養(yǎng)方法通常包括選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)胞、培養(yǎng)這些賦予個性細(xì)胞通過胚發(fā)育的常規(guī)階段，通過生根苗(plantlet)階段的步驟。類似地再生轉(zhuǎn)基因胚和種子。生成的轉(zhuǎn)基因生根苗隨后被種植在適當(dāng)?shù)闹参锷L制劑中如土壤中。含有編碼目標(biāo)蛋白的外源基因的植物的發(fā)育或再生在本領(lǐng)域是熟知的。優(yōu)選地，再生植物自花授粉來產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物。此外，從再生植物獲得的花粉與農(nóng)業(yè)上重要品系的種子生長的植物雜交。相反地，來自這些重要品系的植物的花粉用于對再生的植物進(jìn)行授粉。本發(fā)明的含有期望多肽的轉(zhuǎn)基因植物采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法種植。有各種方法用于從植物組織中再生植物。特定的再生方法將依賴于起始植物組織和被再生的特定植物種類。轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法，主要是采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法已經(jīng)被公布用于棉花(美國專利US5,004,863；US5,159,135；和US5,518,908)；大豆(美國專利US5,569,834和US5,416,011；McCabeetal.，Biotechnology，6923(1988)；Christouetal.，PlantPhysiol.，8767l-674(1988))；蕓苔(Brassica)(美國專利US5,463,174)；花生(Chengetal.，PlantCellRep.，15653-657(1996)，McKentlyetal.，PlantCellRep.，14699-703(1995))；番木瓜(papaya)；豌豆(Grantetal.，PlantCellRep.，15254-258(1995))；和擬南芥(Bechtoldetal.，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.，3161194-1199(1993))。后一種用于轉(zhuǎn)化擬南芥的方法通常稱作″蘸(dipping)″或真空滲入或種質(zhì)轉(zhuǎn)化。采用電穿孔、粒子轟擊和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物也已經(jīng)被報道。轉(zhuǎn)化和植物再生已經(jīng)在天門冬(asparagus)(Bytebieretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，845354(1987))；大麥(WanandLemaux，PlantPhysiol，10437(1994))；玉米(corn)(Rhodesetal.，Science，240204(1988)；Gordon-Kammetal.，PlatCell，2603-618(1990)；Frommetal.，Bio/Technology，8833(1990)；Kozieletal.，BiolTechnology，11194(1993)；Armstrongetal.，CropScience，35550-557(1995))；燕麥(Somersetal.，BiolTechnology，101589(1992))；果園草(Hornetal.，PlantCellRep.，7469(1988))；稻(Toriyamaetal.，TheorAppl.Genet.，20534(1986)；Partetal.，PlantMol.Biol.，321135-1148(1996)；Abediniaetal.，Aust.J.PlantPhysiol.，24133-141(1997)；ZhangandWu，Theor.Appl.Genet.，76835(1988)；Zhangetal.，PlantCellRep.，7379(1988)；BattrawandHall，PlantSci.，86191-202(1992)；Christouetal.，Bio/Technology，9957(1991))；黑麥(rye)(DelaPenaetal.，Nature，325274(1987))；甘蔗(BowerandBirch，PlantJ.，2409(1992))；葦狀羊茅(tallfeseue)(Wangetal.，BiolTeclanology，10691(1992))；和小麥(Vasiletal.，Bo/Technology，10667(1992)；美國專利US5,631,152)中獲得。已經(jīng)開發(fā)了基于瞬時表達(dá)克隆的核酸構(gòu)建體的基因表達(dá)分析，通過聚乙二醇處理、電穿孔或粒子攻擊將核酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Marcotteetal.，Nature，335454-457(1988)；Marcotteetal.，PlantCell，1523-532(1989)；McCartyetal.，Cell，66895-905(1991)；Hattorietal.，GenesDev.，6609-618(1992)；Goffetal.，EMBOJ.，92517-2522(1990))。瞬時表達(dá)系統(tǒng)被用于功能性地分裂基因構(gòu)建體(通常常見Mailgaetal.，MethodsinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarborPress，NY(1995))。任何本發(fā)明的核酸分子與其他遺傳元件一起以永久或暫時的方式被導(dǎo)入植物細(xì)胞中，這些遺傳元件如載體、啟動子、增強子等。此外，任何本發(fā)明的核酸分子以能夠表達(dá)或過度表達(dá)由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或其片段的方式被導(dǎo)入到植物細(xì)胞中。特定的內(nèi)源基因或基因家族的共抑制在表達(dá)水平、通常在RNA水平被同源有義構(gòu)建體的表達(dá)降低，該構(gòu)建體能夠轉(zhuǎn)錄與內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄本相同的鏈的mRNA(Napolietal.，PlantCell，2279-289(1990)；vanderKroletal.，PlantCell，2291-299(1990))。共抑制可以從用單拷貝的與存在于細(xì)胞的核酸序列同源核酸分子(ProllsandMeyer，PlantJ.，2465-475(1992))，或者用多拷貝的與存在于細(xì)胞的核酸序列同源核酸分子(Mittlestenetal.，Mol.Gen.Genet.，244325-330(1994))穩(wěn)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。被連接到啟動子的基因雖然不同，但是產(chǎn)生對連接基因的共抑制(Vaucheret，C.R.Acad.Sci.III，3161471-1483(1993)；Flavell，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，913490-3496(1994))；vanBloldandetal.，PlantJ.，6861-877(1994)；Jorgensen，TrendsBiotechnol.，8340-344(1990)；MeinsandKunz，InGenelnactivationandHomologousRecombinationinPlants，Paszkowski(ed.)，pp.335-348，KluwerAcademic，Netherlands(1994))。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種的本發(fā)明的核酸可以被導(dǎo)入到植物細(xì)胞，采用具有這種轉(zhuǎn)錄的合適啟動子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生對內(nèi)源蛋白的共抑制。反義方法是通過靶向遺傳物質(zhì)來阻止或降低基因功能的途經(jīng)(Moletal.，F(xiàn)EBSLett.，268427-430(1990))。反義方法的目標(biāo)是使用與靶基因互補的序列來阻斷基因表達(dá)，并建立突變細(xì)胞系或生物體，其中單個被選擇的蛋白質(zhì)水平被選擇性地降低或消除。相對于“反向遺傳(reversegenetic)”方法，反義技術(shù)具有一些優(yōu)勢。失活的位點及其可能(developmental)的作用可通過選擇反義基因的啟動子來加工，或者通過計時(timing)外部應(yīng)用或微注射。通過選擇目標(biāo)基因的獨特區(qū)域或者與其他相關(guān)基因同源的區(qū)域來加工反義序列的特異性(Hiattetal.，InGeneticEngineering，Setlow(ed.)，Vol.11，NewYorkPlenum49-63(1989))。反義RNA技術(shù)包括將與目標(biāo)mRNA互補的RNA導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生通過反義底物與目標(biāo)mRNA的堿基配對形成的特異RNARNA雙鏈體(Greenetal.，Annu.Rev.Biochem.，55569-597(1986))。在一個實施方案中，該方法包括反義基因序列的導(dǎo)入和表達(dá)。這種序列中，正?；蛐蛄械牟糠只蛉课挥趩幼拥南喾捶较蚴沟谩板e誤”或互補鏈被轉(zhuǎn)錄為非編碼反義RNA，其與靶mRNA雜交并干擾其表達(dá)(TakayamaandInouye，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，25155-184(1990))。反義載體通過常規(guī)方法構(gòu)建，并通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、感染等導(dǎo)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的類型和載體選擇將決定表達(dá)是瞬時的或穩(wěn)定的。用于反義基因的啟動子可能影響反義抑制的水平、計時(timming)、組織、特異性或可誘導(dǎo)性。應(yīng)當(dāng)理解，通過培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞來降低或抑制植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)活性，該植物細(xì)胞含有非轉(zhuǎn)錄鏈編碼蛋白質(zhì)或其片段的核酸分子?；钚酝ㄟ^任何方法降低或抑制的優(yōu)選蛋白質(zhì)是尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)會在植物中導(dǎo)致病毒免疫性或基因沉默。PTGS被dsRNA誘導(dǎo)，受RNA依賴的RNA聚合酶介導(dǎo)，聚合酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，需要模板。dsRNA通過互補的轉(zhuǎn)基因mRNA或相同轉(zhuǎn)錄本的互補區(qū)的雜交形成。采用來自共同存在于植物基因組的一條有義基因和一條反義基因的轉(zhuǎn)錄本、自互補的單一轉(zhuǎn)錄本、來自雜交結(jié)合的基因的有義和反義轉(zhuǎn)錄本來形成雙鏈體。dsRNA依賴RNA聚合酶使來自轉(zhuǎn)基因mRNA的互補鏈與RNAse分子結(jié)合到該互補鏈(cRNA)上。這些cRNA-RNase分子雜交到內(nèi)源mRNA上，并裂解鄰近雜合體的單鏈RNA。被裂解的單鏈RNA進(jìn)一步通過其他宿主RNase降解，是由于一條缺乏帶帽的5′端，而另一條缺乏poly(A)尾(Waterhouseetal.，PNAS，9513959-13964(1998))。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸可以被導(dǎo)入植物細(xì)胞中，使用這種轉(zhuǎn)錄的合適啟動子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。已經(jīng)在植物中表達(dá)了抗體(Hiattetal.，Nature，34276-78(1989)；ConradandFielder，PlantMol.Biol.，261023-1030(1994))。胞質(zhì)表達(dá)scFv(單鏈Fv抗體)已經(jīng)被報道用于延緩菊芋斑駁皺縮病毒(artichokemottledcrinklevirus)的感染。表達(dá)抗內(nèi)源蛋白的抗體的轉(zhuǎn)基因植物具有生理學(xué)作用(Philipsetal.，EMBOJ.，164489-4496(1997)；MarionPoll，TrendsinPlantScience，2447-448(1997))。例如抗脫落酸的抗體已經(jīng)被報道會產(chǎn)生對種子發(fā)育的全面干擾(Philipsetal.，EMBOJ.，164489-4496(1997))。具有催化功能的抗體也可以在植物中被表達(dá)(抗體酶)。抗體酶的原理是由于抗體產(chǎn)生來抵抗許多分子，這種識別能力被定向于產(chǎn)生結(jié)合過渡態(tài)(bindtransitionstate)來推進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的抗體(Persidas，NatureBiotechnology，151313-1315(1997)；Bacaetal.，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，26461-493(1997))。抗體酶的催化能力可以通過定點突變來提高?？贵w酶的例子為，例如，列舉在美國專利US5,658,753；US5,632,990；US5,631,137；US5,602,015；US5,559,538；US5,576,174；US5,500,358；US5，318,897；US5,298,409；US5,258,289；和US5,194,585中。應(yīng)當(dāng)理解，任何本發(fā)明的抗體可以在植物中被表達(dá)，并且這種表達(dá)能夠產(chǎn)生生理作用。還應(yīng)當(dāng)理解，任何被表達(dá)的抗體具有催化活性。本發(fā)明還提供本發(fā)明的植物的部分，特別是繁殖或儲存部分。植物部分不限于包括種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，植物部分是種子。在一個實施方案中，種子為動物飼料的組分。在另一個實施方案中，植物部分是果實，更加優(yōu)選是存放期被延長的果實。在另一個優(yōu)選實施方案中，果實的生育酚水平被提高。在另一個優(yōu)選實施方案中，果實的三烯生育酚水平被提高。本發(fā)明還包括超過約10,000種子，更加優(yōu)選約20,000和甚至更加優(yōu)選約40,000種子的容器(container)，其中超過約10％，更優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％和甚至更優(yōu)選75％或90％種子是來自本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明還提供超過約10kg，更加優(yōu)選約25kg和甚至更加優(yōu)選約50kg種子的容器，其中超過約10％，更優(yōu)選約25％，更優(yōu)選約50％和甚至更優(yōu)選75％或90％種子是來自本發(fā)明的植物的種子。任何本發(fā)明的植物或其部分可以被加工來生產(chǎn)飼料、食物(meal)、蛋白質(zhì)或油制品，包括總生育酚含量高的油制備物，和任何一種或多種各種在此所列的生育酚成分高的油制備物。用于該目的的特別優(yōu)選的植物部分是種子。在優(yōu)選實施方案中，飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物被設(shè)計給家畜或人或兩者。制備飼料、食物、蛋白質(zhì)和油制備物的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見，如美國專利US4,957,748；US5,100,679；US5,219,596；US5,936069；US6,005,076；US6,146,669；和US6,156,227。在優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)制備物是高蛋白制備物。這種高蛋白制備物優(yōu)選具有超過約5％w/v，更加優(yōu)選10％w/v和甚至更加優(yōu)選15％w/v的蛋白質(zhì)含量。在優(yōu)選油制備物中，油制備物是具有來自本發(fā)明的植物或其部分的油含量超過約5％w/v，更加優(yōu)選10％w/v和甚至更加優(yōu)選15％w/v的高含量油制備物。在優(yōu)選實施方案中，油制備物是液體的，具有超過約1、5、10或50L的體積。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物中制備的油或者通過本發(fā)明方法的生產(chǎn)的油。這種油可能具有高的氧化穩(wěn)定性。此外，這種油可以是任何生成的產(chǎn)物的次要(minor)或主要的成分。而且，這種油可以與其他油混合。在優(yōu)選實施方案中，從本發(fā)明植物制備的油或通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的油在體積或重量上構(gòu)成任何產(chǎn)品的油成分的約0.5％、1％、5％、10％、25％、50％、75％或90％以上。在另一個實施方案中，油制備物可以被混合，并在體積上構(gòu)成了混合物的10％、25％、35％、50％或75％以上。來自本發(fā)明植物的油制備物可以與一種或多種有機溶劑或石油蒸餾物(petroleumdistillates)混合。本發(fā)明的植物是繁育程序的一部分或從繁育程序中產(chǎn)生。繁育方法的選擇取決于植物繁殖的模式、被改進(jìn)的特性的遺傳力和商業(yè)上采用的栽培種的類型(如，F(xiàn)1雜合栽培種、純系栽培種等)。所選擇的非限制性方法用于繁育本發(fā)明的植物列舉在下面?？梢圆捎萌魏坞s交后代的標(biāo)記輔助選擇來增強繁育程序。還應(yīng)當(dāng)理解，任何商業(yè)的和非商業(yè)的栽培種可以被用于繁育程序。因素如應(yīng)激力(emergencevigor)、營養(yǎng)勢(vegetativevigor)、應(yīng)激耐受(stresstolerance)、抗病性、分支(branching)、開花、結(jié)實(seedset)、種子大小、種子密度、群從性(standability)和脫粒能力(threshability)等通常決定該選擇。對于高度遺傳性的特性，選擇在某一區(qū)域評價的較好的個別植物是有效的，但是對于低遺傳力的特征，應(yīng)當(dāng)根據(jù)從重復(fù)評價相關(guān)植物家族獲得的平均值來選擇。通用的選擇方法通常包括譜系選擇、改進(jìn)的譜系選擇、混合選擇和輪回選擇。在一個優(yōu)選實施方案中，進(jìn)行回交或輪回程序。遺傳的復(fù)雜性影響繁育方法的選擇?；亟环庇梢员挥糜趯⒁环N或一些高遺傳特性的有利目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化到期望的栽培種中。這種方法已經(jīng)被廣泛用于繁育抗病栽培種。各種輪回選擇技術(shù)被用于改進(jìn)受許多基因控制的數(shù)量遺傳特性。在自花授粉的農(nóng)作物中采用輪回選擇取決于授粉的容易性、從每次授粉成功雜合的頻率和每次成功雜交得到雜合后代的數(shù)量。繁殖系可以被檢測，并在商業(yè)目標(biāo)區(qū)域的代表性環(huán)境下與合適的標(biāo)準(zhǔn)物比較兩代或兩代以上。最好的品系是新的商業(yè)栽培種的候選；那些仍然缺乏特性的品系被用作親本來制備用于進(jìn)一步選擇的新種群。確定較好的植物的一種方法是觀察其相對于其他試驗植物和廣泛種植的標(biāo)準(zhǔn)栽培種的性能。如果單一觀察不能作出決定，重復(fù)觀察可以提供對其遺傳價值的較好估計。育種人員可以選擇和雜交兩種或多種親本品系，接著通過重復(fù)自交和選擇，制備許多新的遺傳組合。開發(fā)新的栽培種需要開發(fā)和選擇品種、雜交這些品種和選擇較好的雜合雜交。雜種種子可以通過被選擇的雄性可育親本之間的人為雜交來制備，或者通過雄性不育體系制備。雜合體被選擇用于特定的單一基因性狀，如莢顏色、花的顏色、種子產(chǎn)量、成熟(pubescene)顏色或除草劑抗性，這表明種子的確是雜合體。其他關(guān)于親本品系，以及雜合體表型的的數(shù)據(jù)影響育種人員是否繼續(xù)特異雜交的決定。譜系繁育和輪回選擇繁育方法可以被用于從繁育種群中開發(fā)栽培種。繁育程序?qū)碜詢煞N或多種栽培種或者各種廣泛來源的特性結(jié)合到繁殖集合中，從中通過自交和選擇期望表型來開發(fā)栽培種。新的栽培種可以被評價來決定是否具有商業(yè)潛質(zhì)。譜系繁育通常被用于改進(jìn)自花授粉的作物。兩種具有期望、互補特性的親本被雜交來制備F1。通過自交一個或多個F1來制備F2群體。從最好的家族中選擇最好的個體?？梢栽贔4代開始重復(fù)檢測家族來改進(jìn)低遺傳力的特性的選擇效率。近交的高級階段(即F6和F7)，最好的系或表型類似的系被檢測來確定可能分離作為新的栽培種?；亟环庇呀?jīng)被用于將簡單遺傳和高度可遺傳的特性的基因轉(zhuǎn)移到期望的純合栽培種或近交系中，作為輪回的親本。被轉(zhuǎn)移的特性的來源稱作供體親本。生成的植物被期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望特征。在最初雜交后，具有供體親本表型的個體被選擇和與輪回親本重復(fù)雜交(回交)。生成的親本期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望特征。單一種子傳代操作，嚴(yán)格意義上是指培植分離種群，收獲各個植物的一種種子樣本，用一種種子(one-seed)樣本培育下一代。當(dāng)該種群已經(jīng)從F2進(jìn)化到具有期望近交水平時，來自該品系的植物將各自追溯到不同F(xiàn)2個體。該種群中的植物的數(shù)量在各代中下降，其由于一些種子不能萌發(fā)或一些植物不能產(chǎn)生至少一粒種子。結(jié)果當(dāng)世代進(jìn)化完成，并非所有最初從種群采樣的F2植物都在子代中體現(xiàn)。在多種子操作中，育種人員通常從種群中的各種植物中收獲一種或多種莢果，一起脫粒形成批量。批量的部分被用于種植下一代，一部分被保存。這種方法被稱作為改進(jìn)的單一種子傳代方法或莢-批量技術(shù)(pod-bulktechnique)多種子操作已經(jīng)被用于在收割時節(jié)約勞動力。用機器脫粒莢果顯著地快于單一種子操作的通過手工從各個莢果中取出種子。多種子操作還可能在各個近交世代中種植相同數(shù)量種群的種子。對于其他通常用于不同特征和作物的育種方法的描述可參見一些參考書(如Fehr，PrinciplesofCultivarDevelopment，Vol.1，pp.2-3(1987))。還可以用無融合生殖繁殖本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。無融合生殖是一種遺傳控制植物繁殖的方法，其中胚形成不需要卵與精子結(jié)合。有三種基本類型的無融合生殖繁殖1)無孢子生殖，其中來源于核的胚囊中染色體未減數(shù)的卵發(fā)育得到胚；2)倍數(shù)孢子形成，其中來源于大孢子母細(xì)胞胚囊中不減數(shù)的卵發(fā)育得到胚；和3)不定胚生殖(adventitiousembryony)，其中胚直接從體細(xì)胞發(fā)育得到。在絕大多數(shù)類型的無融合生殖，假受精或極體核受精來制備胚乳對于種子活力是必須的。在無孢子生殖中，保育(nurse)栽培種被用作花粉來源來在種子中形成胚乳。由于栽培種的不減數(shù)卵孤雌地發(fā)育，但是可能形成胚乳，保育栽培種不影響無孢子的無融合生殖栽培種的遺傳學(xué)。無融合生殖具有重要經(jīng)濟(jì)意義，特別是在轉(zhuǎn)基因植物中，由于無論如何雜合，其生成正確繁育的任何基因型。因此，通過無融合生殖繁殖，雜合的轉(zhuǎn)基因植物能夠在重復(fù)生活周期中保持其遺傳忠實性。制備無融合生殖植物的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見美國專利US5,811,636。其他生物體本發(fā)明的核酸可以被導(dǎo)入任何細(xì)胞或生物體中，如哺乳動物細(xì)胞、哺乳動物、魚細(xì)胞、魚、鳥細(xì)胞、鳥、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌和細(xì)菌細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)在合適的細(xì)胞或生物體中制備。優(yōu)選宿主和轉(zhuǎn)化株包括真菌細(xì)胞，如曲霉屬菌種、酵母、哺乳動物，特別是牛和豬、昆蟲、細(xì)菌和藻類。特別優(yōu)選細(xì)菌是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteruimtumefaciens)和E.coli。轉(zhuǎn)化這種細(xì)胞或生物體的方法在本領(lǐng)域是已知的(EP0238023；Yeltonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，811470-1474(1984)；Malardieretal.，Gene，78147-156(1989)；BeckerandGuarente，InAbelsonandSimon(eds.)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodEnzymol.，Vol.194，pp.182-187，AcademicPress，Inc.，NY；Itoetal.，J.Bacteriology，153163(1983)；Hinnenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，751920(1978)；BennettandLaSure(eds.)，MoreGeneManipualtioninsinfungi，AcademicPress，CA(1991))。制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法也是已知的(Kudlaetal.，EMBO，91355-1364(1990)；JaraiandBuxton，CurrentGenetics，262238-2244(1994)；Verdier，Yeast，6271-297(1990)；MacKenzieetal.，JourenalofGen.Microbiol.，1392295-2307(1993)；Hartlatal.，TIBS，1920-25(1994)；Bergenronetal.，TIBS，19124-128(1994)；Demolderetal.，J.Biotechnology，32179-189(1994)；Craig，Science，2601902-1903(1993)；GethingandSambrook，Nature，35533-45(1992)；PuigandGilbert，J.，Biol.Chem.，2697764-7771(1994)；WangandTsou，F(xiàn)ASEBJournal，71515-1517(1993)；Robinsonetal.，Bio/Technology，1381-384(1994)；EnderlinandOgrydziak，Yeast，1067-79(1994)；Fulleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438(1989)；Juliusetal.，Cell，371075-1089(1984)；Juliusetal.，Cell，32839-852(1983))。在優(yōu)選實施方案中，在細(xì)胞或生物體中過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，在該細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的生育酚水平。在優(yōu)選實施方案中，在細(xì)胞或生物體中過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，在該細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的α-生育酚水平。優(yōu)選實施方案中，在細(xì)胞或生物體中過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，在該細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的α-生育酚水平。在另一個優(yōu)選實施方案中，在細(xì)胞或生物體中過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，在該細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的α-三烯生育酚水平。在另一個優(yōu)選實施方案中，在細(xì)胞或生物體中過度表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，在該細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生高于具有相似遺傳背景的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的γ-三烯生育酚水平?？贵w本發(fā)明的一個方面涉及抗體、單鏈抗原結(jié)合分子或其他特異地結(jié)合一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽分子的其他蛋白質(zhì)及其同系物、融合蛋白或片段。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗體特異地結(jié)合到具有示于SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段上。本發(fā)明的抗體被用于定量或定性地檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽分子，或者檢測蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。如在此所用，如果這種結(jié)合不被非相關(guān)分子的存在競爭性地抑制，抗體或肽被認(rèn)為是“特異地結(jié)合”本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽分子。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的全部或部分的核酸分子可以通過重組方法被表達(dá)來獲得蛋白質(zhì)或肽，蛋白質(zhì)或肽隨后被用于生產(chǎn)能夠結(jié)合被表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽的抗體。這種抗體被用于免疫測定這種蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)編碼分子或其片段可以是“融合”分子(即較大的核酸分子的一部分)，使得表達(dá)生成融合蛋白。應(yīng)當(dāng)理解，任何本發(fā)明的核酸分子通過重組方法被表達(dá)來獲得由這些核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或肽。特異地結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段的抗體可以是單克隆或多克隆抗體，可以包含完整免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原結(jié)合部分(例如(F(ab′)、F(ab′)2))或者可制備的單鏈免疫球蛋白，例如通過重組方法制備。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域?qū)嶋H操作人員熟悉描述抗體的構(gòu)建、加工和分離的特定條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)資料來源(參見，如HarlowandLane，InAntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1988))。如下文描述，這種抗體分子或其片段可以被用于診斷目的。當(dāng)抗體被用于診斷目的時，期望被配體基團(tuán)(如生物素)或可檢測的標(biāo)記基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性同位素或酶)衍生。制備結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽分子的抗體的能力使得可以鑒定衍生自這些分子的模擬化合物。這些模擬化合物可能含有蛋白質(zhì)或肽的片段，或者僅僅是結(jié)構(gòu)相似區(qū)，但是能夠與抗這種化合物的抗體特異地結(jié)合。示例性用途本發(fā)明的核酸分子及其片段被用于從相同品種中獲得其他核酸分子(來自玉米的核酸分子可以被用于獲得來自玉米的其他核酸分子)。這種核酸分子包括編碼蛋白質(zhì)的完整編碼序列核酸分子、啟動子和該分子的側(cè)翼序列。此外，這種核酸分子包括編碼其他同工酶的核酸分子或基因家族成員。這種分子容易通過采用上述核酸分子或其片段篩選cDNA或基因組文庫。構(gòu)建這種文庫的方法在本領(lǐng)域是熟知的。本發(fā)明的核酸分子及其片段也可以被用于獲得核酸同系物。這種同系物包括植物或其他生物體的核酸分子，包括細(xì)菌和真菌，包括完整地或部分地編碼其他植物種類或其他生物體的蛋白質(zhì)同系物的核酸分子，遺傳元件序列，如啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。采用上述核酸分子或其片段篩選從這些植物品種獲得的DNA或基因組文庫來容易獲得這種分子。構(gòu)建該文庫的方法在本領(lǐng)域是已知的。這種同系物分子在核苷酸序列上可以區(qū)別于那些編碼一種或多種SEQIDNO5、9-11、43-44、57-5和90的核酸分子及其互補體，由于穩(wěn)定雜交不需要完全互補性。因此，本發(fā)明的核酸分子還包括雖然能夠特異性地雜交核酸分子但缺乏“完整互補性”的核酸。任何各種方法可以用于獲得一種或多種上述核酸分子(Zamechiketal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，834143-4146(1986)；Goodchildetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，855507-5511(1988)；Wickstrometal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，851028-1032(1988)；Holtetal.，Molec.Cell.Biol.，8963-973(1988)；Gerwirtzetal.，Science，2421303-1306(1988)；Anfossietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，863379-3383(1989)；Beckeretal.，EMBOJ.，83685-3691(1989))。核酸自動合成儀可以被用于該目的。除了這種合成，公開的核酸分子可以被用于確定引物對，其與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一起(Mullisetal.，ColdSpringHarborsymp.Quant.Biol.，51263-273(1986)；Erlichetal.，EP50424；EP84796；EP258017；EP237362；Mullis，EP201184；Mullisetal.，US4,683,202；Erlich，US4,582,788；andSaikietal.，US4,683，194)來擴增和獲得任何期望的核酸分子或片段。啟動子序列和其他遺傳元件，包括但不限于與一種或多種公開的核酸序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控側(cè)翼序列，也可以采用在此提供的核酸序列來獲得。在一個實施方案中，這種序列通過將本發(fā)明的核酸分子與基因組文庫成員一起溫育，收獲雜交到這種核酸分子的克隆。在第二個實施方案中，“染色體步查(walking)”的方法或者反向PCR可以被用于獲得這種序列(Frohmanetal.，Proc.Natl.AcadSci.(U.S.A.)，858998-9002(1988)；Oharaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，865673-5677(1989)；Pangetal.，Biotechniques，221046-1048(1977)；Huangetal.，MethodsMol.Biol.，6989-96(1997)；Huangetal.，MethodMol.Biol.，67287-294(1997)；Benkeletal.，Genet.Anal.，13123-127(1996)；Hartletal.，MethodsMol.Biol.，58293-301(1996))。術(shù)語“染色體步查”是指通過連續(xù)雜交步驟延伸遺傳圖譜的方法。本發(fā)明的核酸分子可以被用于分離細(xì)胞增強、細(xì)胞特異、組織增強、組織特異、發(fā)育地或環(huán)境調(diào)控表達(dá)模式的啟動子。例如，采用基因組篩選方法和PCR技術(shù)分離和功能測定來自基因組文庫的基因的5’側(cè)翼啟動子序列，實現(xiàn)分離有用的啟動子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。這些方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，已經(jīng)被描述(參見，如Birrenetal.，GenomeAnalysisAnalyzingDNA，1，(1997)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。采用本發(fā)明的核酸分子獲得的啟動子還可以被改進(jìn)來影響它們的控制特征。這種改進(jìn)的例子包括但不限于增強子序列。這種遺傳元件可以被用于增強基因表達(dá)改進(jìn)作物的新的和已有特征。本發(fā)明的核酸分子的其他集合包括作為標(biāo)記的核酸分子。標(biāo)記可以大量常規(guī)方式被用于分子遺傳領(lǐng)域。這種標(biāo)記包括作為標(biāo)記的編碼SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的核酸分子及其互補體和片段，和作為標(biāo)記的本發(fā)明的其他核酸分子。本發(fā)明的遺傳標(biāo)記包括“顯性”或“共顯性”標(biāo)記?！肮诧@性標(biāo)記”表明一個位點上存在兩個或多個等位基因(每個雙倍體個體兩個)?！帮@性標(biāo)記”表明每個位點上僅存在單一等位基因。存在共顯性標(biāo)記表型(如DNA條帶)表明一種等位基因存在純合或雜合條件下。缺乏顯性標(biāo)記的表型(如缺乏DNA條帶)僅僅表明存在“一些其他”不確定的等位基因。當(dāng)種群中個體主要是純合的并且位點是二態(tài)的時，顯性和共顯性標(biāo)記是等價的。當(dāng)種群變得更加雜合和多重等位基因，共顯性標(biāo)記一般比顯性標(biāo)記具有更多表型信息。標(biāo)記分子可以如能夠檢測多態(tài)性，如單核苷酸的多態(tài)性(SNPs)動物和植物的基因組在其連續(xù)進(jìn)化過程中自然地進(jìn)行自發(fā)突變(Gusella，Ann.Rev.Biochem.，55831-854(1986))?！岸鄳B(tài)性”是基因序列或其側(cè)翼區(qū)域的變化或差異，這些側(cè)翼區(qū)域存在于該品種的一些個體中。變異序列和“原始”序列共同存在于品種種群中。在某些情況下，這種共存處于穩(wěn)定或準(zhǔn)穩(wěn)定的平衡中。因此，多態(tài)性被認(rèn)為是“等位基因的”，其中由于存在多態(tài)性種群中的一些成員可能具有原始序列(即原始“等位基因”)，而其他成員具有變異序列(即變異的“等位基因”)。在最簡單的情況下，僅存在一種變異序列，而多態(tài)性被認(rèn)為是雙等位基因的。在其他情況下，品種的種群可能含有多種等位基因，多態(tài)性被稱作三等位基因的等。單基因可以具有多種不同的無關(guān)多態(tài)性。例如，可能在一個位點上具有雙等位基因多態(tài)性，而在另一個位點上具有多個等位基因多態(tài)性。說明多態(tài)性的變化可能從單一核苷酸變化到在基因中插入或刪除延伸的區(qū)域。在某些情況下，DNA序列的變化在基因組的區(qū)域中，其特征在于短串聯(lián)重復(fù)(STRs)，包括核苷酸的串聯(lián)的二個或三個核苷酸的重復(fù)基序。特征為這種串聯(lián)重復(fù)的多態(tài)性稱作為“可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)”(″VNTR″)的多態(tài)性。VNTR已經(jīng)被用于鑒定分析(Weber，US5,075,217；Armouretal.，F(xiàn)EBSLett.，307113-115(1992)；Jonesetal.，Eur.J.Haematol.，39144-147(1987)；Hornetal.，PCT申請WO91/14003；Jeffreys，EP370719；Jeffreys，US5,175,082；Jeffreysetal.，Amer.J.Hum.Genet.，3911-24(1986)；Jeffreysetal.，Nature，31676-79(1985)；Grayetal.，Proc.R.Acad.Soc.Lond.，243241-253(1991)；Mooreetal.，Genomics，10654-660(1991)；Jeffreysetal.，Anim.Genet.，181-15(1987)；Hilleletal.，Anim.Genet.，20145-155(1989)；Hilleletal.，Genet，124783-789(1990))。采用核酸擴增方法以方便在DNA樣本中檢測多態(tài)性位點。這種方法特異地提高跨越多態(tài)性位點或者包括該位點和位于遠(yuǎn)側(cè)或鄰近的序列的多核苷酸的濃度。這種被擴增的分子可以容易通過電泳或其他方法檢測。在另一個實施方案中，這種多態(tài)性可以通過采用標(biāo)記核酸分子來檢測，這種標(biāo)記核酸分子被物理地連接到這種多態(tài)性上。為了該目的，采用標(biāo)記核酸分子，其包含位于多態(tài)性的1mb內(nèi)，和更優(yōu)選位于多態(tài)性的100kb內(nèi)和最優(yōu)選位于多態(tài)性的10kb內(nèi)的多核苷酸的核苷酸序列?？梢酝ㄟ^各種方式確定對多態(tài)性的鑒定。通過將植物中存在或缺失多態(tài)性與表型的存在或缺少相關(guān)聯(lián)，可能預(yù)測該植物的表型。如果多態(tài)性建立或破壞限制性內(nèi)切酶裂解位點，或者如果其導(dǎo)致DNA的缺失或插入(如VNTR多態(tài)性)，其將改變用限制性內(nèi)切酶消化得到的DNA片段的大小或模式。因此，具有變異序列的生物體可以通過限制性片段分析區(qū)別于具有那些原始序列的生物體。可以通過這種方式確定的多態(tài)性稱作為“限制性片段長度多態(tài)性”(RFLPs)(Glassberg，英國專利申請2135774；Skolnicketal.，Cytogen.CellGenet.，3258-67(1982)；Botsteinetal.，Ann.J.Hum.Genet.，32314-331(1980)；Fischeretal.，PCT申請WO90/13668；Uhlen，PCT申請WO90/11369)。多態(tài)性還可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析來確定(Elles，MethodsinMolecularMedicineMolecularDiagnosisofGeneticDiseases，HumanaPress(1996))；Oritaetal.，Genomics，5874-879(1989))。已經(jīng)描述了多種用于SSCP的方案，包括但不限于Leeetal.，Anal.Biochem.，205289-293(1992)；Suzukietal.，Anal.Biochem.，19282-84(1991)；Loetal.，NucleicAcidsResearch，201005-1009(1992)；Sarkaretal.，Genomics，13441-443(1992)。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸可以被用作標(biāo)記或探針，通過SSCP分析來檢測多態(tài)性。還可以采用稱作擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)的DNA指紋分析技術(shù)來確定多態(tài)性，AFLP是基于選擇性PCR擴增來自總消化基因組DNA的限制性片段來確定該DNA的模式(Vosetal.，NucleicAcidsRes.，234407-4414(1995))。這種方法可以特異性地共擴增大量限制性片段，不需要知曉核酸序列通過PCR可視化該片段。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸可以被用作標(biāo)記或探針來通過AFLP分析檢測多態(tài)性，或者用于指紋分析RNA。多態(tài)性還可以采用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)(Williamsetal.，Nucl.AcidsRes.，186531-6535(1990))和可裂解的擴增多態(tài)性序列(CAPS)(Lyamichevetal.，Science，260778-783(1993))來確定。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸分子可以被用作標(biāo)記或探針來通過RAPD或CAPS分析檢測多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常以大于其他多態(tài)性標(biāo)記的頻率發(fā)生，并且以比被報道的多態(tài)性形式大的一致性在基因組中被隔離。SNP較大的頻率和一致性是指這種多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)接近或存在于目標(biāo)遺傳位點的概率大于其他的多態(tài)性。SNP位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)和基因組的非編碼區(qū)。一些這種SNP可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)的缺陷型或變異(如，由于突變或缺陷型剪接)。特征性的SNP分析(基因型)僅需要加/減分析，而不需要長度(length)測定，便于自動操作。SNP可以采用任何各種方法來表征。這種方法包括位點的直接或間接測序，采用限制性酶(Botsteinetal.，Am.J.Hum.Genet.，32314-331(1980)；KoniecznyandAusubel，PlantJ.，4403-410(1993))，酶促和化學(xué)的錯配分析(Myersetal.，Nature，313495-498(1985))，等位基因特異性PCR(Newtonetal.，Nucl.AcidsRes.，172503-2516(1989)；Wuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，862757-2760(1989))，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，88189-193(1991))，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Labruneetal.，Am.J.Hum.Genet.，481115-1120(1991))，單堿基引物擴增(Kuppuswamyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，881143-1147(1991)，Goelet，US6,004,744；Goelet，US5,888,819)，基于固相ELISA寡核苷酸連接分析(Nikiforovetal.，Nucl.AcidsRes.，224167-4175(1994))，雙脫氧指紋分析(Sarkaretal.，Genomics，13441-443(1992))，寡核苷酸熒光淬滅分析(Livaketal.，PCRMethodsAppl.，4357-362(1995a))，5′-核酸酶等位基因特異雜交TaqMan分析(Livaketal.，NatureGenet.，9341-342(1995))，模板指引的染色終止子結(jié)合(TDI)分析(ChenandKwok，Nucl.AcidsRes.，25347-353(1997))，等位基因特異性分子束分析(Tyagietal.，NatureBiotech.，1649-53(1998))，針點分析(PinPointassay)(HaffandSmirnov，GenomeRes.，7378-388(1997))，dCAPS分析(Neffetal.，PlantJ.，14387-392(1998))，熱測序(pyrosequencing)(Ronaghietal.，AnalyticalBiochemistry，26765-71(1999)；Ronaghietal.，WO98/13523；Nyrenetal.，WO98/28440；www.pyrosequencing.com)，采用質(zhì)譜分析，如MasscodeTM系統(tǒng)(Howbertetal.，WO99/05319；Howbertetal.，WO97/27331；www.rapigene.com；Beckeretal.，WO98/26095；Beckeretal.，WO98/12355；Beckeretal.，WO97/33000；Monforteetal.，US5,965,363)，侵入性裂解寡核苷酸探針(Lyamichevetal.，NatureBiotechnology，17292-296；www.twt.com)，采用高密度寡核苷酸陣列(Haciaetal.，NatureGenetics，22164-167；www.affymetrix.com)。還可以采用等位基因特異性寡核苷酸(ASO)檢測多態(tài)性，ASO可以用于如與雜交技術(shù)結(jié)合，包括Southern，Northern和斑點印跡雜交、反向斑點印跡雜交和在微陣列上進(jìn)行的雜交，以及相關(guān)技術(shù)。用于多態(tài)性檢測的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性極大地依賴于各種因素，包括等位基因特異性寡核苷酸長度、序列組成、互補性大小(即存在或缺少堿基錯配)，鹽濃度和其他因素如甲酰胺和溫度。這些因素在雜交和隨后洗滌來去除未特異地雜交的目標(biāo)多核苷酸的過程中是重要的。實際上，最后的最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南疵摋l件是最關(guān)鍵的。此外，能夠雜交到等位基因特異性的寡核苷酸上的目標(biāo)多核苷酸的含量也受這些因素控制，如ASO和目標(biāo)多核苷酸的濃度，“束縛(tieup)”水分子的因素的存在和濃度，以及雜交過程和洗滌步驟期間，無論核酸被固定或在溶液中，以用于有效地濃縮試劑(例如PEG、葡聚糖、硫酸葡聚糖等)。雜交優(yōu)選在低于ASO的解鏈溫度(Tm)下進(jìn)行。雜交和/或洗滌步驟越接近Tm，嚴(yán)謹(jǐn)性越高。寡核苷酸的Tm可以被估計，例如按照如下公式Tm＝81.5+16.6x(log10[Na+])+0.41x(％G+C)-675/n；其中[Na+]是Na+或者其他合適的陽離子摩爾鹽濃度，而n＝寡核苷酸的堿基數(shù)量。還可以獲得其他用于估計Tm的公式，這在本領(lǐng)域是普通技術(shù)人員已知的。嚴(yán)謹(jǐn)性優(yōu)選被調(diào)整來使給定的ASO被差別地雜交到正確的等位基因的目標(biāo)多核苷酸和錯誤的等位基因的目標(biāo)多核苷酸上。優(yōu)選地，由ASO雜交到正確的等位基因的目標(biāo)多核苷酸上產(chǎn)生的信號水平和由ASO雜交錯誤的等位基因的目標(biāo)多核苷酸上(例如特異于突變等位基因的ASO交叉結(jié)合到野生型等位基因上)產(chǎn)生的信號之間至少差異兩倍。在本發(fā)明的更加優(yōu)選的實施方案中，存在至少5倍信號差異。在本發(fā)明的高度優(yōu)選實施方案中，在ASO雜交到正確的等位基因的目標(biāo)多核苷酸和由ASO交叉結(jié)合到錯誤的等位基因的目標(biāo)多核苷酸上產(chǎn)生的信號水平之間存在至少一個數(shù)量級信號差異。雖然在此描述了一些用于檢測多態(tài)性的方法，其他檢測方法也可以使用。例如，其他方法是已知的，并列舉在Birrenetal.，GenorneAnalysis，4135-186；ALaboratoryManual.MappingGenomes，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1999)；Maligaetal.，MethodsinPlantMolecularBiology.ALaboratoryCourseManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1995)；Paterson，BiotechnologyIntelligenceUnitGenomeMappinginPlants，R.G.LandesCo.，Georgetown，TX，andAcademicPress，SanDiego，CA(1996)；TheCornHandbook，F(xiàn)reelingandWalbot，(eds.)，Springe-Verlag，NewYork，NY(1994)；MethodsinMolecularMedicineMolecularDiagnosisofGeneticDiseases，Elles，(ed.)，HumanaPress，Totowa，NJ(1996)；Clark，(ed.)，PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Springer-Verlag，Berlin，Germany(1997)。在植物繁育程序中影響標(biāo)記輔助選擇的因素為(1)標(biāo)記應(yīng)當(dāng)共分離或被與期望性狀緊密連鎖；(2)用于在大種群中篩選分子標(biāo)記的有效方法應(yīng)當(dāng)是可得到的；和(3)篩選技術(shù)在實驗室中應(yīng)當(dāng)具有高重復(fù)性，優(yōu)選使用是經(jīng)濟(jì)的和容易掌握的。建立標(biāo)記分子的遺傳連鎖可通過基因作圖模式，例如而不限于由LanderandBotstein，Genetics，121185-199(1989)報道的側(cè)翼標(biāo)記模式和LanderandBotstein，Genetics，121185-199(1989)描述的基于最大似然(maximumlikelihood)方法的區(qū)間作圖(intervalmapping)，并且在軟件包MAPMAKER/QTL(LincolnandLander，MappingGenesControllingQuantitatveTraitsUsingMAPMAKERlQTL，WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch，MA(1990)中操作。其他軟件包括Qgene，版本2.23(1996)，DepartmentofPlantBreedingandBiometry，266EmersonHall，CornellUniversity，Ithaca，NY。采用Qgene軟件是特別優(yōu)選的方法。計算標(biāo)記存在的最大似然估計(MLE)，并用MLE估計非QTL作用來避免假陽性。然后用LOD＝log10(存在QTL的MLE/無被連接的QTL的MLE)計算讓步比(oddratio)的log10值(LOD)。LOD值基本上表明這些數(shù)據(jù)假定存在QTL比其假定缺乏QTL的可能性高多少。避免假陽性的LOD閾值具有特定的置信度，比如95％，該閾值取決于標(biāo)記的數(shù)量和基因組的長度。圖表說明LOD閾值列舉在LanderandBotstein，Genetics，121185-199(1989)中，還在ArusandMoreno-Gonzlez，PlantBreeding，Haywardetal.，(eds.)Chapman&Hall，London，pp.314-331(1993)中描述。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，核酸標(biāo)記的目標(biāo)特征或表型具有大于2.0、更加優(yōu)選2.5、甚至更加優(yōu)選大于3.0或4.0的LOD值。在優(yōu)選實施方案中，目標(biāo)特征是被改變的生育酚水平或組成或者被改變的三烯生育酚的水平或組成(composition)。可以采用其他模式。許多對區(qū)間作圖的改進(jìn)和變化的方法已經(jīng)被報道，包括采用非參數(shù)方法(KruglyakandLander，Genetics1391421-1428(1995))。多重回歸方法或模型也被采用，其中特征在大量標(biāo)記中被回歸(Jansen，BiometricsinPlantBreeding，vanOijenandJansen(eds.)，ProceedingsoftheNinthMeetingoftheEucarpiaSectionBiometricsinPlantBreeding，TheNetherlands，pp.116-124(1994)；WeberandWricke，AdvancesinPlantBreeding，Blackwell，Berlin，16(1994))。結(jié)合區(qū)間作圖和回歸分析的方法已經(jīng)被JansenandStam，Genetics，1361447-1455(1994)；和Zeng，Genetics，1361457-1468(1994)報道，其中表型在特定標(biāo)記區(qū)間中被回歸到單一的假定QTL，同時回歸到作為“輔助因子”的大量標(biāo)記上。一般地，采用輔助因子減少被估計的QTL位置的偏離和取樣誤差(UtzandMelchinger，BiometricsinPlantBreeding，vanOijenandJansen(eds.)，ProceedingsoftheNinthMeetingoftheEucarpiaSectionBiometricsinPlantBreeding，TheNetherlands，pp.195-204(1994)，從而提高了QTL作圖的精確度和效率(Zeng，Genetics，1361457-1468(1994))。這種模式可以被擴展到多環(huán)境試驗來分析基因型-環(huán)境互作(Jansenetal.，Theo.Appl.Genet.，9133-37(1995))。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸分子可以被用作分子標(biāo)記。還應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子可以被用作分子標(biāo)記。在優(yōu)選實施方案中，多態(tài)性被呈遞并在繪制群體中被篩選，例如能夠與如多態(tài)性標(biāo)記的標(biāo)記一起使用來繪制特征的遺傳位置的植物的集合。選擇適當(dāng)?shù)淖鲌D群體通常依賴于所用的標(biāo)記體系的類型(Tanksleyetal.，J.P.GustafsonandR.Appels(eds.).PlenumPress，NY，pp.157-173(1988))。應(yīng)當(dāng)考慮用于作圖群體中的親本來源(適應(yīng)的與外來的)。在遠(yuǎn)源雜交(適應(yīng)的與外來的)中，染色體配對和重組比例被嚴(yán)重打亂(抑制)，并且一般導(dǎo)致連鎖距離極大降低。與狹隘(narrow)雜交(適應(yīng)的x適應(yīng)的(adAPted))的后代相比，遠(yuǎn)源雜交通常將產(chǎn)生具有相對大量的多態(tài)性的分離種群。在生成雜合種子后，F(xiàn)2群體是自交(自花傳粉)的第一代。通常，單一的F1自花授粉來生產(chǎn)孟德爾模式(1∶2∶1)中的所有基因的分離群體。最大遺傳信息從完全分離的F2群體中獲得，采用共顯性標(biāo)記系統(tǒng)(Mather，MeasurementofLinkageinHeredityMethuenandCo.，(1938))。當(dāng)采用共顯性標(biāo)記時，需要進(jìn)行后代測驗(如F3，BCF2)來確定雜合子，以對群體分類。但是，這種方法通常由于后代測驗的費用和時間的原因受到限制。F2個體的后代測驗通常被用于繪制其中表型不能一致地反映基因型(如，抗病性)，或者其中特征的表達(dá)受QTL控制的構(gòu)建體。從后代測驗群體(如F3或BCF2)得到的分離數(shù)據(jù)可以被用于左圖構(gòu)建體。標(biāo)記輔助選擇可以被用于雜交標(biāo)記-特征作圖結(jié)合的后代(F2，F(xiàn)3)，其中連鎖群體未通過重組事件完全被分離(即最大平衡不穩(wěn)定)。重組近交系(RIL)(遺傳相關(guān)系；通常是超過F5，從連續(xù)自交F2系發(fā)育到純合子)可以被用作作圖群體。從共顯性標(biāo)記獲得的信息可以通過采用RIL最大化，因為所有基因座是純合的或者接近純合。在緊密連鎖的條件下(即約＜10％的重組)，與回交群體的任何標(biāo)記類型相比，在RIL群體中被評價的顯性和共顯性標(biāo)記在每個個體上提供更多信息(Reiteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，891477-1481(1992))。但是，由于標(biāo)記之間的距離變大(即基因座變得更加獨立)，RIL群體中的信息相對于共顯性標(biāo)記顯著減少。回交群體，如從成功品種(輪回親本)和攜帶不存在于前述品種中的特征的其他品種(供體親本)的雜交中產(chǎn)生，可以被用作作圖群體。與輪回親本進(jìn)行一系列回交來恢復(fù)期望的特性。因此，由幾乎近似于輪回親本但是攜帶各種含量或嵌合形式的來自供體親本的基因組區(qū)域的個體組成的群體被建立。如果輪回親本中的所有基因座是純合的，并且供體和輪回親本具有差異顯著的多態(tài)性標(biāo)記等位基因(Reiteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，891477-1481(1992))，回交群體可以被用于繪制顯性標(biāo)記。采用共顯性或顯性標(biāo)記從回交群體中獲得的信息比從F2群體中獲得的信息少，這是由于每個植物中僅一個而不是兩個重組配子被采樣。但是，當(dāng)與RIL比較時，由于RIL群體中的連鎖基因座間的距離增加(即約0.15％重組)，回交群體具有更多信息(低標(biāo)記飽和)。重組升高對于解除緊密連鎖是有利的，但是不期望出現(xiàn)在低標(biāo)記飽和的作圖構(gòu)建中。近等基因系(NIL)(通過多次回交建立來制備除了被研究的特性或基因組區(qū)域外遺傳組成幾乎相同的個體的集合)可以被用作作圖群體。在用NIL作圖時，僅部分多態(tài)性基因座被繪制到被選擇的區(qū)域。集團(tuán)分離分析(BSA)是一種開發(fā)來快速確定標(biāo)記與目標(biāo)特性之間的連鎖的方法(Michelmoreetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，889828-9832(1991))。在BSA中，從來源于單一雜交的分離群體中取出兩個集團(tuán)的DNA樣本。這些集團(tuán)含有針對特定特征(抵抗或易感特定疾病)相同或者基因組區(qū)域相同、但未連鎖區(qū)域是任意的(雜合的)個體。在BSA中，未連鎖到目標(biāo)區(qū)域的區(qū)域在許多個體的集團(tuán)樣本之間沒有差異。在本發(fā)明的一個方面，一種或多種本發(fā)明的核酸分子被用于檢測植物(優(yōu)選canola、玉米、白菜、甘藍(lán)型油菜、油菜籽、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕櫚、亞麻或向日葵)中，部分地或完全地由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)的水平(即，樣本中的mRNA濃度等)或模式(即，表達(dá)動力學(xué)、分解率、穩(wěn)定性模式)(統(tǒng)稱細(xì)胞或組織的“表達(dá)反應(yīng)”)。如在此所用，如果通過細(xì)胞或組織表現(xiàn)的表達(dá)反應(yīng)區(qū)別于不具有這種表型的植物的細(xì)胞或組織的表達(dá)反應(yīng)，其被認(rèn)為是“被改變的”。為了確定表達(dá)反應(yīng)(ExpressionResponse)是否被改變，通過具有該表型的植物的細(xì)胞或組織表現(xiàn)的表達(dá)反應(yīng)與不具有該表型的植物的類似細(xì)胞或組織的表達(dá)反應(yīng)比較?？梢灶A(yù)期，不需要每次進(jìn)行這種比較時都重新確定不具有這種表型的植物的細(xì)胞或組織的表達(dá)反應(yīng)；相反，特定植物的表達(dá)反應(yīng)可以先前獲得的正常植物的值比較。如在此所用，生物體的表型是生物體的任何一種或多種特征(如抗病性、耐蟲害、環(huán)境耐受性如對非生物應(yīng)激的耐受、雄性不育、品質(zhì)改進(jìn)或產(chǎn)量等)?；蛐突虮硇偷淖兓赡苁菚簳r或永久的。如在此所用，組織樣本是包含一個細(xì)胞以上的任何樣本。在優(yōu)選方面，組織樣本包含具有共同特征的細(xì)胞(如來自根、種子、花、葉子、莖或花粉等)。在本發(fā)明的一個方面，進(jìn)行評價來確定是否存在特定mRNA分子。一種或多種本發(fā)明的核酸分子被用于檢測mRNA種類的存在或數(shù)量。然后將這種分子與植物的細(xì)胞或組織提取物在足以使核酸雜交的條件下溫育。檢測到雙鏈的探針-mRNA雜合分子指示存在mRNA；這種形成的雜合體的含量與mRNA含量成比例。因此，這種探針可以被用于確定植物細(xì)胞或組織中這種mRNA生成的水平和程度。這種核酸雜交可以在定量條件下進(jìn)行(從而提供存在的mRNA的含量的數(shù)值)?？蛇x擇地，這種分析可以作為定性分析進(jìn)行，指示存在mRNA或者其水平超過用戶設(shè)定的預(yù)定值。許多方法可以被用于在兩個或多個細(xì)胞或組織樣本中比較表達(dá)反應(yīng)。這些方法包括雜交分析，如northern、RNA酶保護(hù)分析和原位雜交。可選擇地，這些方法包括PCR類型的分析。在優(yōu)選方法中，通過將來自兩種或多種樣本的核酸與核酸陣列雜交來比較表達(dá)反應(yīng)。該陣列含有大量已知或懷疑存在于樣本的細(xì)胞或組織中的被質(zhì)疑的序列。原位雜交相對于更加常規(guī)的方法用于檢測核酸的優(yōu)點在于，其可以確定精確的空間群體(Angereretal.，Dev.Biol.，101477-484(1984)；Angereretal.，Dev.Biol.，112157-166(1985)；Dixonetal.，EMBOJ.，101317-1324(1991))。原位雜交可以被用于測定穩(wěn)定狀態(tài)水平的RNA蓄積(Hardinetal.，J.Mol.Biol.，202417-431(1989))。大量操作可以被設(shè)計來進(jìn)行原位雜交，各種方法包括組織制備、雜交和洗滌條件(Meyerowitz，PlantMol.Biol.Rep.，5242-250(1987)；CoxandGoldberg，InPlantMolecularBiologyAPracticalApproach，Shaw(ed.)，pp.1-35，IRLPress，Oxford(1988)；Raikheletal.，InsituRNAhybridizationinplanttissues，InPlantMolecularBiologyManual，Vol.B91-32，KluwerAcademicPublisher，Dordrecht，Belgium(1989))。原位雜交還可以用于在組織或細(xì)胞中定位蛋白質(zhì)(Wilkinson，InSituHybridization，OxfordUniversityPress，Oxford(1992)；Langdale，InSituHybridizationInTheCornHandbook，F(xiàn)reelingandWalbot(eds.)，pp.165-179，Springer-Verlag，NY(1994))。應(yīng)當(dāng)理解，一種或多種本發(fā)明的核酸分子或其片段或者一種或多種本發(fā)明的抗體可以被用于通過原位雜交來檢測蛋白質(zhì)或其mRNA的水平或模式。熒光原位雜交可以在染色體上定位特定的DNA序列，在其他應(yīng)用中，用于基因作圖雜種系中的染色體，或者檢測具有易位、顛換或缺失的染色體。原位雜交已經(jīng)被用于在一些植物品種中確定染色體(Grifforetal.，PlantMol.Biol.，17101-109(1991)；Gustafsonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，871899-1902(1990)；MukaiandGill，Génome，34448-452(1991)；SchwarzacherandHeslop-Harrison，Genome，34317-323(1991)；Wangetal.，Jpn.J.Genet.，66313-316(1991)；ParraandWindle，NatureGenetics，517-21(1993))。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的核酸分子可以被用作探針或標(biāo)記來將序列定位在染色體上。其他定位分子表達(dá)的方法是組織印跡(tissueprinting)。組織印跡提供一種篩選途經(jīng)，同時在同一膜上有許多來自不同植物或不同發(fā)育階段的組織片(YomoandTaylor，Planta，11235-43(1973)；HarrisandChrispeels，PlantPhysiol.，56292-299(1975)；CassabandVarner，J.Cell.Biol.，1052581-2588(1987)；Spruceetal.，Phytochemistry，262901-2903(1987)；Barres.etal.，Neuron，5527-544(1990)；ReidandPont-Lezica，TissuePrintingToolsfortheStudyofAnatomy，HistochemistryandGeneExpression，AcademicPress，NewYork，NY(1992)；Reidetal.，PlantPhysio.，93160-165(1990)；Yeetal.，PlantJ.，1175-183(1991))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考一般的文獻(xiàn)來獲得在此討論的已知技術(shù)或等價技術(shù)的詳細(xì)描述。這些文獻(xiàn)包括CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubeletal.，(eds.)，JohnWiley&Sons，NY(1989)，以及9月的增刊(1998)，MolecularCloning，ALaboratoryManual，Sambrooketal.，2ndEd.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)，GenomeAnalysALaboratoryManual1AnalyzingDNA，Birrenetal.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1997)；GenomeAnalysisALaboratoryManual2DetectingGenes，Birrenetal.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1998)；GenomeAnalysisALaboratoryManual3CloningSystems，Birrenetal.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1999)；GenomeAnalysisALaboratoryManual4MappingGenomes，Birrenetal.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1999)；PlantMolecularBiologyALaboratoryManual，Clark，Springer-Verlag，Berlin，(1997)；MethodsinPlantMolecularBiology，Maligaetal.，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY(1995)。當(dāng)然，這些文獻(xiàn)可以被參考來構(gòu)成或使用本發(fā)明的一個方面。應(yīng)當(dāng)理解，任何本發(fā)明的制劑可以是基本上純的和/或生物學(xué)活性的和/或重組的。已經(jīng)大體上描述了本發(fā)明，通過參考如下實施例更加容易理解相同內(nèi)容，除非特別指出，這些實施例被提供用于說明，而不是限定本發(fā)明。實施例1確定尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列本實施例列舉用于分析來自各種來源的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列的方法，來確定尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶中含有的共同基序。來自大豆、擬南芥、玉米和萼距花(部分地)尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列被克隆，并從EST數(shù)據(jù)庫中的EST序列中測序。集胞藍(lán)細(xì)菌屬、點型念珠藍(lán)細(xì)菌和魚腥藍(lán)細(xì)菌屬序列得自Genbank。然后用多重比較軟件ClustalX相互比較這些序列(表示為SEQIDNO1-8)，這被描述在Thompsonetal.，NucleicAcidsResearch，244876-4882(1997)。蛋白質(zhì)的多重比較采用Genedoc可視化和編輯，這被描述在Nicholasetal.，EMBNEW.NEWS，414(1997)。采用前面提及的多重比較工具，四個基序(A-D)被確定，示于附圖2a-2c中，其中基序A-D被列舉。這些基序被表示為SEQIDNO12-15。萼距花的序列從基序D中被去除，因為該序列朝向3’端具有多個錯誤，會產(chǎn)生明顯的移框誤差。采用HiddenMarkov模型(HMM)來證明這些基序的特異性，該模型采用HMMER(版本2.2g)軟件包(Eddy，Bioinformatics，14755-763(1998))建立。HMM檢索在含有來自不同植物品種的全長插入序列的cDNA序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行。除了幾個部分的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列，這種檢索確定兩種新的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列(SEQIDNO9-10)。所確定的這兩條新的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列來自韭和小麥。該檢索還正確地確定完整的萼距花序列(SEQIDNO11)。采用前面提及的多重比較工具來產(chǎn)生第二種比較，如附圖3a-3c所示。該比較包括了韭、小麥和全長的萼距花序列?；騃-IV(SEQIDNO39-42)被顯示。還采用各種基序序列檢索從NCBI的Genbank下載的非冗余(non-redundant)的氨基酸數(shù)據(jù)庫來檢測特異性。全部四種基序確定三種存在于前述的非冗余的氨基酸數(shù)據(jù)庫的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，如下點型念珠藍(lán)細(xì)菌、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、擬南芥(Arabidopsis)，基序II和IV也確定了未表征的擬南芥蛋白質(zhì)的一些基因組變體?；騃和III在0.001或更小的E值下，僅確定已知的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。實施例2制備表達(dá)構(gòu)建體含有來自pCGN3223的napin表達(dá)盒的質(zhì)粒(在美國專利US5,639,790描述，其全文在此被引入作為參考)被改進(jìn)，使其更適合用于克隆含有多個限制性位點的大DNA片段，以可以將多個napin融合基因克隆到植物雙元轉(zhuǎn)化載體中。一個由自退火的寡核苷酸序列CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT(SEQIDNO16)組成的連接物(adapter)在用限制性核酸內(nèi)切酶BssHII消化后，被連接到克隆載體pBCSK+(Stratagene)上來構(gòu)建載體pCGN7765。質(zhì)粒pCGN3223和pCGN7765用Not1消化并連接到一起。生成的載體pCGN7770含有具有來自pCGN3223的napin種子特異性表達(dá)盒的pCGN7765主鏈?？寺”磉_(dá)盒pCGN7787基本包含與pCGN7770相同的調(diào)控元件，除了雙CAMV35S啟動子和多聚腺苷酸和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域替代pCGN7770的napin調(diào)控區(qū)域。植物轉(zhuǎn)化的雙元載體pCGN5139從pCGN1558構(gòu)建得到(McBrideandSummerfelt，PlantMolecularBiology，14269-276(1990))。pCGN1558的多接頭替換為具有含有獨特的限制性核酸內(nèi)切酶位點AscI、PacI、XbaI、SwaI、BamHI和NotI的多接頭的HindIII/Asp718片段。Asp718和HindIII限制性核酸內(nèi)切酶位點被保留在pCGN5139中。一系列雙元載體被構(gòu)建，使得可以快速將DNA序列克隆到含有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(啟動子)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的雙元載體上。通過將寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3′(SEQIDNO17)和5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′(SEQIDNO18)連接到用SalIl/XhoI消化的pCGN7770上來構(gòu)建質(zhì)粒pCGN8618。用Asp718I消化，從pCGN8618切除含有napin啟動子、接頭和napin3′區(qū)的片段；通過用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端，然后連接到pCGN5139中，pCGN5139已經(jīng)用Asp718I和HindIII消化并用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端。質(zhì)粒具有定向插入，使得napin啟動子與平頭的pCGN5139的Asp718I位點最近，而napin3′與平頭HindIII位點最接近，質(zhì)粒進(jìn)行序列分析來確定克隆連接的插入方向和完整性。生成的質(zhì)粒命名為pCGN8622。通過將寡核苷酸5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′(SEQIDNO19)和5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3′(SEQIDNO20)連接到用SalIl/XhoI消化的pCGN7770)上來構(gòu)建質(zhì)粒pCGN8619。用Asp7181消化，從pCGN8619切除含有napin啟動子、接頭和napin3′區(qū)的片段；通過用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端，然后連接到pCGN5139中，pCGN5139已經(jīng)用Asp718I和HindIII消化并用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端。質(zhì)粒具有定向插入，使得napin啟動子與平頭的pCGN5139的Asp718I位點最近，而napin3′與平頭HindIII位點最接近，質(zhì)粒進(jìn)行序列分析來確定克隆連接的插入方向和完整性。生成的質(zhì)粒命名為pCGN8623。通過將寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3′(SEQIDNO21)和5′-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′(SEQIDNO22)連接到用SalI/SacI消化的pCGN7787上來構(gòu)建質(zhì)粒pCGNS620。用Asp718I完全消化和用NotI部分消化，從pCGN8620去除含有d35S啟動子、接頭和試驗性3′區(qū)的片段；通過用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端，然后連接到pCGN5139中，pCGN5139已經(jīng)用Asp718I和HindIII消化并用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端。質(zhì)粒具有定向插入，使得d35S啟動子與平頭的pCGN5139的Asp718I位點最近，而tml3′與平頭的HindIII位點最接近，質(zhì)粒進(jìn)行序列分析來確定克隆連接的插入方向和完整性。生成的質(zhì)粒命名為pCGN8624。通過將寡核苷酸5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3′(SEQBDNO23)和5′-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3′(SEQIDNO24)連接到用SalI/SacI消化的pCGN7787上來構(gòu)建質(zhì)粒pCGNS620。用Asp718I完全消化和用NotI部分消化，從pCGN8620去除含有d35S啟動子、接頭和試驗性3′區(qū)的片段.通過用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端，然后連接到pCGN5139中，pCGN5139已經(jīng)用Asp718I和HindIII消化并用Klenow片段添補5′突出端來使片段平頭末端。質(zhì)粒具有定向插入，使得d35S啟動子與平頭的pCGN5139的Asp718I位點最近，而tml3′與平頭的HindIII位點最接近，質(zhì)粒進(jìn)行序列分析來確定克隆連接的插入方向和完整性。生成的質(zhì)粒命名為pCGN8625。質(zhì)粒構(gòu)建體pCGN8640是對上述pCGN8624的改進(jìn)。938bp的PstI片段從轉(zhuǎn)座子Tn7分離得到，Tn7編碼細(xì)菌壯觀霉素和鏈霉素抗性(Flingetal.，NucleicAcidsResearch，13(19)7095-7106(1985))，是大腸桿菌和農(nóng)桿菌選擇的決定區(qū)，用Pfu聚合酶來平頭化末端。平頭末端的片段被連接到pCGN8624，其已經(jīng)用SpeI消化并用Pfu聚合酶平頭末端。含有PstI片段的區(qū)域被測序來確定克隆連接的插入方向和完整性。壯觀霉素抗性標(biāo)記如下被導(dǎo)入pCGN8622和pCGN8623中。如上所述，來自pCGN8640的7.7Kbp的片段被連接到來自pCGN8623或pCGN8622的10.9Kbp的AvrII-SnaBI片段上。得到的質(zhì)粒分別是pCGN8641和pCGN8643。通過將寡核苷酸5′-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3′(SEQIDNO25)和5′TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3′(SEQIDNO26)連接到BamHI-PstI消化的pCGN8640上來構(gòu)建質(zhì)粒pCGN8644。合成的寡核苷酸被消化，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴增各種核苷酸的編碼序列以制備表達(dá)構(gòu)建體，這些核酸編碼SEQIDNO1-7、9-11、43-44、57-58和90的多肽。各種編碼SEQIDNO1-7、9-11、43-44、57-58和90的多肽的核酸的表編碼序列都被擴增并克隆到TopoTA載體(Invitrogen)中。含有各種尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列的構(gòu)建體用NotI和Sse8387I消化，并如上所述被克隆到turbobinary載體上。合成的寡核苷酸被消化，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴增SEQIDNO33，以制備表達(dá)構(gòu)建體，寡核苷酸被提供在下表中SEQIDNO33用示于上表的各種PCR引物擴增，并被克隆到TopoTA載體(Invitrogen)中。含有各種尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列的構(gòu)建體用NotI和Sse8387I消化，并如上所述被克隆到turbobinary載體上.SEQIDNO33以有義方向被克隆到pCGN8640中來制備植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pCGN10800(附圖4)。SEQIDNO33受增強的35S啟動子調(diào)控。SEQIDNO33還以反義方向被克隆到構(gòu)建pCGN8641中來建立pCGN10801(附圖5)。這種構(gòu)建體提供來自napin啟動子的SEQIDNO33的反義表達(dá)。SEQIDNO33還以有義方向被克隆到載體pCGN8643來建立植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pCGN10822(附圖7)。這種構(gòu)建體提供來自napin啟動子的SEQIDNO33的有義表達(dá)。SEQIDNO33還以反義方向被克隆到載體pCGN8644中來建立植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體pCGN10803(附圖6)。這種構(gòu)建體提供來自增強的35S啟動子的SEQIDNO33的反義表達(dá)。實施例3植物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因的蕓苔屬植物可以通過如Radkeetal.，Theor.Appl.Genet.，75685-694(1988)；PlantCellReports，11499-505(1992)中描述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來獲得。轉(zhuǎn)基因的擬南芥植物可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來獲得，如被描述在Valverkensetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，855536-5540(1988)，或被描述在Bentetal.，Science，2651856-1860(1994)，或Bechtoldetal.，C.R.Acad.Sci.LifeSciences，3161194-1199(1993)。其他植物種類可以采用相關(guān)技術(shù)被類似地轉(zhuǎn)化?？蛇x擇地，如被描述在Kleinetal.，Bio/Technology，10286-291中的微粒轟擊方法也可以被用于獲得核酸轉(zhuǎn)化的植物。實施例4確定其他尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶為了確定其他尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，通過序列同源性確定的基序被用于檢索含有全長插入序列的cDNA序列數(shù)據(jù)庫。首先將cDNA數(shù)據(jù)庫翻譯為6個部分(frame)，然后采用根據(jù)基序建立的HMM模型進(jìn)行HMN檢索。所有HMM選中(hit)的序列通過針對非冗余的氨基酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast檢索來評注。所有基序都是靈敏的，并鑒定存在于數(shù)據(jù)庫中的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。由此，發(fā)現(xiàn)了新的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。實施例5轉(zhuǎn)基因植物分析用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化有義或反義表達(dá)尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的擬南芥植物，通過高效液相層析(HPLC)來分析總生育酚和三烯生育酚水平的變化，以及特定的生育酚和三烯生育酚水平的變化(如，α、β、γ和δ-生育酚/三烯生育酚)。如下制備葉子和種子提取物用于HPLC。對于種子提取物，10mg種子被加到無菌microfuge管中的1g微珠(Biospec)中，往管中加入500ul1％鄰苯三酚(SigmaChem)/乙醇。在小型Beadbeater(Biospec)“高”速搖晃混合物3min。提取物用0.2um濾器過濾到autosampler管中。然后過濾后的提取物被用于下文描述的HPLC分析。葉子提取物通過混合30-50mg葉組織與1g微珠，在液氮中冷凍直到提取。對于提取，500ul溶于乙醇的1％鄰苯三酚被加入到葉子/珠混合物中，在Beadbeater(Biospec)“高”速搖晃混合物1min。得到的混合物以14,000rpm離心4min，在進(jìn)行HPLC分析前如上述被過濾。在Zorbax硅HPLC柱(4.6mm×250mm)上進(jìn)行HPLC，激發(fā)和發(fā)射光譜分別設(shè)定在290nm和336nm。溶劑A為己烷，溶劑B為甲基-t-丁基醚。注入體積為20ul，流速為1.5ml/min，跑柱時間為12min(40℃)，使用下表1％鄰苯三酚/乙醇中的生育酚標(biāo)準(zhǔn)物也跑柱來用于比較(α-生育酚、γ-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚和生育酚(母育酚)(都來自Matreya，StateCollege，PA，或Calbiochem，LaJolla，CA.))。采用Chemstation軟件來計算α、β、δ、γ生育酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。成分x的吸收量為x的吸收量＝反應(yīng)xxRFxx稀釋倍數(shù)，其中反應(yīng)x是峰值x的面積，RFx是成分x的反應(yīng)因子(總量x/反應(yīng)x)，而稀釋因子為500ul。ng/mg組織是通過總ng成分/mg植物組織建立。轉(zhuǎn)基因擬南芥品種的種子提取物的HPLC分析結(jié)果提供在附圖8中，該品種含有用于從napin啟動子表達(dá)SEQIDNO33的pMON10822。從napin啟動子表達(dá)SEQIDNO33的擬南芥種子組織(pMON10822)的HPLC分析結(jié)果證明，種子中生育酚的水平升高了?？偵铀奖任崔D(zhuǎn)化(野生型)擬南芥植物的總生育酚水平提高了50-60％(附圖8)。轉(zhuǎn)基因擬南芥品系1387-1624的種子提取物的HPLC分析結(jié)果被提供在附圖9中，這些品系含有用于從增強35S啟動子反義表達(dá)SEQIDNO33的pMON10803。兩個品系1393和1401表現(xiàn)為總體生育酚水平基本下降，證明HPT是參與生育酚合成的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。獲得了含有用于表達(dá)SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的構(gòu)建體轉(zhuǎn)基因擬南芥品系的種子提取物的HPLC分析結(jié)果。獲得了含有用于從增強的35S啟動子表達(dá)SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58和90的構(gòu)建體轉(zhuǎn)基因擬南芥品系的種子提取物的HPLC分析結(jié)果。實施例6尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶作為單一基因與HPPD及tyrA在大豆中表達(dá)擬南芥尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(ATPT2)(SEQIDNO33)被克隆到具有Arcelin5表達(dá)盒的大豆雙元載體上。該表達(dá)盒由Arcelin5-啟動子、多克隆位點、Arcelin53′-非翻譯序列按所描述的順序組成。用于該構(gòu)建體的載體構(gòu)建和如下的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)，這些技術(shù)已經(jīng)在本領(lǐng)域徹底建立并被描述在實驗室手冊中如(Sambrooketal.2001)。生成的用于大豆種子特異表達(dá)ATPT2的雙元載體被命名為pMON36581(附圖10)。類似地，Synechocystis尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(slrl736)(SEQIDNO29)與葉綠體目標(biāo)肽(CTP1)融合，被克隆到Arcelin5大豆種子特異表達(dá)盒中。生成的雙元質(zhì)粒被命名為pMON69933(附圖11)。通過將HPPDAt基因和tyrAEh基因分別融合到葉綠體靶肽CTP2和CTP1上來，來構(gòu)建用于種子特異性共表達(dá)擬南芥p-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPDAt)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)的雙功能預(yù)苯酸脫氫酶(tyrAEh)(參見WO02/089561)的其他雙元質(zhì)粒。這些融合基因接著被克隆到由7Sα′-啟動子、多克隆位點和E93′-非翻譯區(qū)組成的大豆種子特異性表達(dá)盒的多克隆位點上。HPPDAt表達(dá)盒被克隆到tyrAEh表達(dá)盒的下游的雙元載體中，形成了pMON69924(附圖12)。第四種質(zhì)粒通過克隆slr1736的Arcelin5表達(dá)盒(SEQIDNO29)、HPPDAt的下游、tyrAEh表達(dá)盒來構(gòu)建，構(gòu)成了pMON69943(附圖13)。各種這些雙元載體被轉(zhuǎn)化到大豆中。從含有這些構(gòu)建體的植物收集的R1種子被用于分析生育酚含量和組成。對于構(gòu)建體pMON36581和pMON69933，隨機選擇用于分析的種子。來自用pMON69924和pMON69943轉(zhuǎn)化的植物的種子具有分離的黑色表型。這種表型與由于轉(zhuǎn)基因HPPD和tyrA的表達(dá)尿黑酸含量升高相關(guān)。未顯黑色的種子確實具有野生型的生育酚水平，不是轉(zhuǎn)基因的。因此，顯黑色的種子被選擇用于分析用pMON69924或pMON69943轉(zhuǎn)化的植物。為了研究HPT表達(dá)對在單基因載體或在多基因載體中的總生育酚沉積的影向，來自未轉(zhuǎn)化的大豆的種子或者用pMON69924轉(zhuǎn)化的種子分別作為對照。附圖14總結(jié)了從這些試驗中獲得的生育酚數(shù)據(jù)。雖然ATPT2或slrl736的表達(dá)適度地提高了大豆中的總生育酚和三烯生育酚的水平，多基因載體中HPT表達(dá)的影響是更加明顯的。附圖14表明與pMON69924系相比，pMON69943中生育酚和三烯生育酚的沉積水平顯著升高。這些數(shù)據(jù)表明HPT與tyrA，以及HPPD的組合能夠真正地提高大豆中的生育酚生物合成。采用目標(biāo)基因(GOI)蛋白質(zhì)特異性抗體進(jìn)行Western分析，檢測具有目標(biāo)基因(GOI)表達(dá)盒的組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。采用GOI序列特異性放射性標(biāo)記探針進(jìn)行Northern分析，檢測轉(zhuǎn)基因的mRNA水平。實施例7確定其他尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列在對非冗余的氨基酸數(shù)據(jù)庫的分析中，除了HPT序列還確定了基序II和IV(SEQIDNO40和42)，兩條與HPT相關(guān)的擬南芥序列基因組變體(SEQIDNOs61-62)。這些序列通過基因預(yù)測算法從基因組序列中insillico預(yù)測得到。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明這些序列編碼其他與HPT相關(guān)的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。兩條序列(SEQIDNOs61-62)都被用于檢索非冗余氨基酸數(shù)據(jù)庫。BLAST檢索結(jié)果表明這些序列與藍(lán)細(xì)菌屬(SEQIDNOs1-3)和擬南芥(SEQIDNO7)的HPT序列十分相關(guān)。比較gi15229898(970aa)(SEQIDNO61)與gil0998133(441aa)(SEQIDNO62)，表明gi15229898(SEQIDNO61)的C末端的那一半與gi10998133(SEQIDNO62)重疊；這兩種蛋白質(zhì)的C末端部分的最后40-50aa不一致；和gi15229898的N末端也不與HPT(SEQIDNO1-7和9-11)序列對比。這些結(jié)果表明，Genbank中報道的編碼序列的預(yù)測是矛盾的。為了證實被預(yù)測的序列，從Genbank下載對應(yīng)于該區(qū)域的擬南芥基因組的BAC序列(gi|124087421|gb|AC016795.6|ATAC016795，100835bp)。從該BAC克隆中預(yù)測編碼序列，采用FGENESH(SolovyevV.V.(2001)StatisticalapproachesinEukaryoticgenepredictioninHandbookofStatisticalgenetics(eds.BaldingD.etal.)，JohnWiley&Sons，Ltd.，p.83-127)基因預(yù)測程序。FGENESH從該BAC克隆中預(yù)測出28種蛋白質(zhì)。為了驗證這28種FGENESH預(yù)測的蛋白質(zhì)中的新尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，所有28種被預(yù)測的蛋白質(zhì)在非冗余的氨基酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast檢索。FGENESH預(yù)測的蛋白質(zhì)No.25(402aa)(SEQIDNO45)與gi10998133(441aa)(SEQIDNO62)、gi15229898(970aa)(SEQIDNO61)和HPT(SEQIDNO1-7、9-11)C末端的那一半最相似。為了提供功能性和轉(zhuǎn)錄證據(jù)和確認(rèn)該基因的編碼序列，對包含專有和公共序列的植物EST序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。發(fā)現(xiàn)一些EST(SEQIDNO63-72)與該基因的N末端和C末端部分匹配。該新基因命名為擬南芥HPT2(SEQIDNO59)。HPT2(SEQIDNO57)序列明顯區(qū)別于HPT1(SEQIDNO7)。擬南芥HPT2(SEQIDNO57)也稱作為生育酚合成酶(TS)。當(dāng)前的數(shù)據(jù)表明TS過度表達(dá)導(dǎo)致總生育酚含量類似HPT1(SEQIDNO33)的相對于野生型的升高。但是，該酶具有不同的生物化學(xué)特征，由于TS的過度表達(dá)導(dǎo)致的δ生育酚的產(chǎn)量低于HPT1(SEQIDNO33)的過度表達(dá)。在擬南芥HPT2序列(SEQIDNO45和57)中存在葉綠體轉(zhuǎn)運蛋白，這采用ChloroP程序(OlofEmanuelssonl，HenrikNielsenl，2，andGunnarvonHeijnelChloroP，aneuralnetwork-basedmethodforpredictingchloroplasttransitpeptidesandtheircleavagesites.ProteinScience8978-984，1999)證明。除了SEQIDNO1、7和9-11(HPT)，SEQIDNO57-58和90(HPT2)也被用于比較，參見附圖24-25以及被分析的所得基序。基序V(SEQIDNO46)、VII(SEQIDNO48)和VIII(SEQIDNO49特異于HPT和HPT2序列。采用這些基序?qū)Ψ侨哂喟被釘?shù)據(jù)庫進(jìn)行AHMM檢索，僅確定藍(lán)綠藻(SEQIDNO1-3和43)、光合細(xì)菌(SEQIDNO44)和植物HPT(SEQIDNO7和61-62)。除了尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，基序VII(SEQIDNO48)從細(xì)菌確定了遠(yuǎn)源相關(guān)ubiA異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。但是基序VII對尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的靈敏度更高。尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶具有較低的e-值，和較高的比較值(大于30)。HPT2序列區(qū)別于HPT和cyanobacterialHPT，這由附圖26中的序列dendogram證明。增加SEQIDNO43-44，用于與SEQIDNO1-4、6-7、9-11、57-58和91比較，參見附圖33-34，得到的基序(SEQIDNO92-95，基序IV-VII)被分析。這些基序?qū)δ蚝谒岙愇於┗D(zhuǎn)移酶的特異性通過HMM檢索證實。采用根據(jù)附圖34所示基序IX-XII比較建立的HMM模型，對含有超過1.34M序列的非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。限制檢索的E值被設(shè)定為1.0。所有四種基序從cyanobacterial、光合細(xì)菌和擬南芥中僅確定到尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶。限定基序IX、X、XI和XII的上限E值分別為0.9、11E10-11、0.03、8E10-8。在基序IX和XI中，較小的基序產(chǎn)生較高的E值。實施例8野生型擬南芥HPT2基因以相對于種子特異性的和組成型啟動子的有義和反義方向在擬南芥中轉(zhuǎn)化和表達(dá)用SalI和NotI酶從EST克隆CPR230005(pMON69960-附圖15)上切取HPT2全長cDNA(SEQIDNO59)，平頭末端并以相對于pMON36525(圖16)中的napin啟動子以有義和反義方向克隆到napin啟動子和napin3′末端的平頭末端的SalI位點上，分別生成重組雙元載體pMON69963(附圖17)和pMON69965(附圖18)。采用標(biāo)準(zhǔn)的測序方法，用napin5′-有義(5′-GTGGCTCGGCTTCACTTTTTAC-3′)(SEQIDNO50)和napin3′-反義(5′-CCACACTCATATCACCGTGG-3′)(SEQIDNO51)引物測序來確定HPT2cDNA。用于產(chǎn)生pMON69963和pMON69965的HPT2cDNA還以相對于增強35S啟動子的有義和反義方向，被克隆到pMON10098的增強35S啟動子和E9-3′末端之間的平頭末端的BglII和BamHI的位點上(附圖19)來分別制備pMON69964(附圖20)和pMON69966(附圖21)。被合成來完整測序整條HPT2cDNA的其他HPT2內(nèi)在引物被列舉在下表中用于確定HPT2cDNA序列的引物的列表植物雙元載體pMON69963和pMON69965被用于擬南芥植物轉(zhuǎn)化中來引導(dǎo)在胚中有義或反義表達(dá)。雙元載體pMON69964和pMON69966被用于擬南芥植物轉(zhuǎn)化中來在整個植物中有義或反義表達(dá)HPT2。雙元載體通過電穿孔被轉(zhuǎn)化到ABI系的農(nóng)桿菌細(xì)胞中(Bio-RadElectroprotocolManual，Doweretal.，NucleicAcidsRes.，166127-6145(1988))。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，如Valverkensetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，855536-5540(1988)，Bentetal.，Science，2651856-1860(1994)和Bechtoldetal.，CR.Acad.Sci.，LifeSciences，3161194-1199(1993)中所描述。將被轉(zhuǎn)化的T1種子撒到選擇性平板上來篩選轉(zhuǎn)基因植物，平板含有MS基礎(chǔ)(basal)鹽(4.3g/L)、Gamborg′aB-5,500X(2.0g/L)、蔗糖(10g/L)、MES(0.5g/L)、phytagar(8g/L)羧卡青霉素(250mg/L)、頭孢噻肟(100mg/L)、植物保護(hù)液(2ml/L)和卡那霉素(60mg/L)，然后在4℃下黑暗中春化2-4天。種子被轉(zhuǎn)移到23℃下，進(jìn)行16/8小時光照/黑暗循環(huán)5-10天，直到生成秧苗。一旦在卡那霉素抗性的秧苗上長出一組真葉，將秧苗移植到土壤中，并種植到成熟。通過卡那霉素選擇獲得的轉(zhuǎn)基因系種植在兩種不同光照條件下。一組轉(zhuǎn)基因系種植在16h光照和8h黑暗中，而另一組種植在24h光照條件下，來研究不同光照對種子生育酚水平的影響。從轉(zhuǎn)化體中收獲的T2種子用于分析生育酚含量。來自種植在正常光照和強光照條件下的品系的種子總生育酚分析的結(jié)果顯示在附圖22和23中。在正常光照和強光照條件下HPT2的種子特異性過度表達(dá)導(dǎo)致總生育酚水平顯著升高1.6和1.5倍(α＝0.05；Tukey-KramerHSD)(SASinstitute，2002，JPMversion5.0)。在兩種光照條件下，與對照相比，采用組成型啟動子e35S表達(dá)HPT2導(dǎo)致種子總生育酚水平上升約20％。在具有增強的35S::HPT2反義構(gòu)建體中生育酚水平下降最大，為20％。在具有受napin啟動子起始的HPT2的擬南芥中，種子總生育酚水平顯著升高，表明HPT2在生育酚生物合成中起重要作用。采用GOI蛋白特異性抗體進(jìn)行Western分析，檢測具有目標(biāo)基因(GOI)表達(dá)盒的組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。采用GOI序列特異放射性標(biāo)記探針進(jìn)行Northern分析，檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)的mRNA水平。實施例9制備用于表達(dá)擬南芥HPT2和生育酚路徑基因的植物雙元載體為了研究HPT2與路徑中的其他關(guān)鍵酶的組合效果，制備含有種子特異性表達(dá)的羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)、雙功能預(yù)苯酸脫氫酶tyrA和HPT2的植物雙元載體(pMON81028-附圖27)。通過用Bsp120I和NotI酶從pMON81023(附圖28)上切取pNapin::HPT2::Napin3′表達(dá)盒，并連接到pMON36596(附圖29)的NotI位點上來制備pMON81028。pMON36596含有pNapin::CTP2::HPPD::Napin3′和pNapin::CTP1::TyrA::Napin3′表達(dá)盒。采用實施例8中描述的方法將pMON81028轉(zhuǎn)化到擬南芥植物中。實施例10制備細(xì)菌性表達(dá)擬南芥HPT2的構(gòu)建體含有HPT2全長cDNA的EST克隆CPR23005被用作模板來PCR擴增編碼成熟形式的HPT2蛋白質(zhì)的HPT2cDNA片段。兩組PCR產(chǎn)物生成，克隆在pET30a(+)載體(Novagen，Inc.)上(附圖30)來制備HPT2蛋白，含有或不含his標(biāo)記。引物組BXK174(5′-CACATATGGCATGTTCTCAGGTTGGTGCTGC-3′)(SEQIDNO84)和BXK176(5′-GCGTCGACCTAGAGGAAGGGGAATAACAG-3′)(SEQIDNO85)被用于將HPT2克隆到T7啟動子后的pET30a(+)的NdeI和SalI位點上，生成無his標(biāo)記的成熟HPT2。生成的重組載體命名為pMON69993(附圖31)。引物組BXK175(5′-CAACCATGGCATGTTCTCAGGTTGGTGCTGC-3′)(SEQIDNO86)和BXK176(5′-GCGTCGACCTAGAGGAAGGGGAATAACAG-3′)(SEQIDNO87)被用于生成克隆在pET30a(+)的Ncol和SalI位點上的HPT2PCR產(chǎn)物，來制備具有his標(biāo)簽的成熟HPT2。重組載體被命名為pMON69992(附圖32)。pMON69993和pMON69992被用于制備細(xì)菌表達(dá)的HPT2，進(jìn)行酶分析來確定其尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性和對香葉基香葉基焦磷酸、葉綠基焦磷酸和茄基焦磷酸底物的特異性。序列表<110>孟山都技術(shù)公司(MonsantoTechnologyLLC)Valentin，HenryEVenkatesh，TyamagondluVKarunanandaa，Balasulojini<120>尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(″HPT″)核酸和多肽，以及它們的用途<130>REN-02-052MON-52933<150>60/365,202<151>2002-03-19<160>95<170>PatentInversion3.1<210>1<211>322<212>PRT<213>點型念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocpunctiforme)<400>1MetSerGlnSerSerGlnAsnSerProLeuProArgLysProValGln151015SerTyrPheHisTrpLeuTyrAlaPheTrpLysPheSerArgProHis202530ThrIleIleGlyThrSerLeuSerValLeuSerLeuTyrLeuIleAla354045IleAlaIleSerAsnAsnThrAlaSerLeuPheThrThrProGlySer505560LeuSerProLeuPheGlyAlaTrpIleAlaCysLeuCysGlyAsnVal65707580TyrIleValGlyLeuAsnGlnLeuGluAspValAspIleAspLysIle859095AsnLysProHisLeuProLeuAlaSerGlyGluPheSerGlnGlnThr100105110GlyGlnLeuIleValAlaSerThrGlyIleLeuAlaLeuValMetAla115120125TrpLeuThrGlyProPheLeuPheGlyMetValThrIleSerLeuAla130135140IleGlyThrAlaTyrSerLeuProProIleArgLeuLysGlnPhePro145150155160PheTrpAlaAlaLeuCysIlePheSerValArgGlyThrIleValAsn165170175LeuGlyLeuTyrLeuHisTyrSerTrpAlaLeuLysGlnSerGlnThr180185190IleProProValValTrpValLeuThrLeuPheIleLeuValPheThr195200205PheAlaIleAlaIlePheLysAspIleProAspIleGluGlyAspArg210215220LeuTyrAsnIleThrThrPheThrIleLysLeuGlySerGlnAlaVal225230235240PheAsnLeuAlaLeuTrpValIleThrValCysTyrLeuGlyIleIle245250255LeuValGlyValLeuArgIleAlaSerValAsnProIlePheLeuIle260265270ThrAlaHisLeuAlaLeuLeuValTrpMetTrpTrpArgSerLeuAla275280285ValAspLeuGlnAspLysSerAlaIleAlaGlnPheTyrGlnPheIle290295300TrpLysLeuPhePheIleGluTyrLeuIlePheProIleAlaCysPhe305310315320LeuAla<210>2<211>318<212>PRT<213>魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaenasp.)<400>2MetAsnGlnSerSerGlnAspArgProLeuArgProLysProLeuGln151015SerSerPheGlnTrpLeuTyrAlaPheTrpLysPheSerArgProHis202530ThrIleIleGlyThrSerLeuSerValLeuGlyLeuTyrLeuIleSer354045IleAlaValSerSerThrGlyPheAlaLeuThrGlnIleAsnSerVal505560LeuGlyAlaTrpLeuAlaCysLeuCysGlyAsnValTyrIleValGly65707580LeuAsnGlnLeuGluAspIleGluIleAspLysValAsnLysProHis859095LeuProLeuAlaSerGlyGluPheSerArgLysGlnGlyArgIleIle100105110ValIleLeuThrGlyIleThrAlaIleValLeuAlaTrpLeuAsnGly115120125ProTyrLeuPheGlyMetValAlaValSerLeuAlaIleGlyThrAla130135140TyrSerLeuProProIleArgLeuLysGlnPheProPheTrpAlaAla145150155160LeuCysIlePheSerValArgGlyThrIleValAsnLeuGlyLeuTyr165170175LeuHisPheSerTrpLeuLeuGlnAsnLysGlnSerIleProLeuPro180185190ValTrpIleLeuThrValPheIleLeuIlePheThrPheAlaIleAla195200205IlePheLysAspIleProAspMetGluGlyAspArgLeuTyrAsnIle210215220ThrThrLeuThrIleGlnLeuGlyProGlnAlaValPheAsnLeuAla225230235240MetTrpValLeuThrValCysTyrLeuGlyMetValIleIleGlyVal245250255LeuArgLeuGlyThrIleAsnSerValPheLeuValValThrHisLeu260265270ValIleLeuCysTrpMetTrpMetGlnSerLeuAlaValAspIleHis275280285AspLysThrAlaIleAlaGlnPheTyrGlnPheIleTrpLysLeuPhe290295300PheLeuGluTyrLeuMetPheProIleAlaCysLeuLeuAla305310315<210>3<211>308<212>PRT<213>集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystissp.)<400>3MetAlaThrIleGlnAlaPheTrpArgPheSerArgProHisThrIle151015lleGlyThrThrLeuSerValTrpAlaValTyrLeuLeuThrIleLeu202530GlyAspGlyAsnSerValAsnSerProAlaSerLeuAspLeuValPhe354045GlyAlaTrpLeuAlaCysLeuLeuGlyAsnValTyrIleValGlyLeu505560AsnGlnLeuTrpAspValAspIleAspArgIleAsnLysProAsnLeu65707580ProLeuAlaAsnGlyAspPheSerIleAlaGlnGlyArgTrpIleVal859095GlyLeuCysGlyValAlaSerLeuAlaIleAlaTrpGlyLeuGlyLeu100105110TrpLeuGlyLeuThrValGlyIleSerLeuIleIleGlyThrAlaTyr115120125SerValProProValArgLeuLysArgPheSerLeuLeuAlaAlaLeu130135140CysIleLeuThrValArgGlyIleValValAsnLeuGlyLeuPheLeu145150155160PhePheArgIleGlyLeuGlyTyrProProThrLeuIleThrProIle165170175TrpValLeuThrLeuPheIleLeuValPheThrValAlaIleAlaIle180185190PheLysAspValProAspMetGluGlyAspArgGlnPheLysIleGln195200205ThrLeuThrLeuGlnIleGlyLysGlnAsnValPheArgGlyThrLeu210215220IleLeuLeuThrGlyCysTyrLeuAlaMetAlaIleTrpGlyLeuTrp225230235240AlaAlaMetProLeuAsnThrAlaPheLeuIleValSerHisLeuCys245250255LeuLeuAlaLeuLeuTrpTrpArgSerArgAspValHisLeuGluSer260265270LysThrGluIleAlaSerPheTyrGlnPheI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ggaaatagta60tcacatttatatacaacaatactcattttaaaaaaataatgatagctagtttaccaattg120acacttgataaacaaagatctctctaactatgcacgtatgcaccttttcccaagaaaaaa180gtagcaaggtttgctatatgaaaggaaatattgcatactcagcatagaacagattccata240tgaatcgatagaatcctgatattgcatccttggtataatttgcttgttctaatattcgtg300cctggtaaatcaagcttattgcaaaaattgtatgagctggtatgagtaaccaacgcctga360aagcctgaggcatataaattgctgccaaaacagaaacaatataattcaccagcaaaattc420cagaaccaaggaaagcaatgttccgaactcctaattttgtagcaaaggttgatatctgat480acttgcgatcaccttcaacatcaggaagatcttttgttatagcaattaccagtgcgaaaa540atgttacaaatgttgtgataaaaaccacaggagagctccattcaaatgcaagcccaaggg600aagctctagtggcatagtacacaccaaagttaaggagaaaaccacgtaccgtggcaatta660taagaaatgctgcaacaggaaagcgtttcatcctcaatggaggaacagaatagatggttc720ccaagaaaaggccaagtgtgtaaagagaaaaaatgaaaggcccaaagttcaaccctgcaa780tcgacaggccagctgctgcaaaaaatataaccaagaaccatgcagattggacagaaagat840ctccagcagctataggtaaataaggtttgtttaccttgtcaatgctaatgtcatagattt900gattgatgccaactatataaccattcccacaaatcagggcaaaaagaccacagaaagctt960tgaaaaaaagagaccactttatcaaattcgtgttctcaatcaatgctcttgccaccaaag1020caaatgaacctagtgctgtaccacgtatagtatgtggccttaaaaatctccaacaagcat1080ctttcaaatctaaaagtctttcagctaatggacgatcagatccagaagctccaactccag1140tgcaagcccttatggaactgggtctttggggtctctcgggaacagcatttgagcagcatc1200tgtaactgtgatggtgcaacccaattgagttgaagtgtttggaaaatcctaagaacaaag1260gttgttgtgacttggtggccttagtggatgatagtttagcggaattcaaagtgggaattg1320tggaaggaacacgatgtgaagttggagagagtgagagctccataaggagctgagcacagc1380aaacgagaaaacactccaaatttcagacgcaacgcaaggcaaaaacc1427<210>92<211>12<212>PRT<213>人工的<220><223>保守基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>x＝w，i，或y<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>x＝r，e，或k<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>x＝l，a，或s<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>x＝l，a，或s<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>x＝i或v<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>x＝i或r<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>x＝g或a<400>92XaaXaaPheXaaArgProHisThrXaaXaaXaaThr1510<210>93<211>26<212>PRT<213>人工的<220><223>保守基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>x＝v，i，l，或g<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>x＝i，l，或v<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>x＝i或1<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>x＝s，f，y，e，w，或t<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>x＝v或i<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>x＝r，s，g，e，d，或a<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>x＝k或r<220><221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>x＝v或i<220><221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>x＝y(tǒng)，d，t，w，n，或h<220><221>MISC_FEATURE<222>(25)..(25)<223>x＝i，v，或l<400>93AsnXaaTyrIleValGlyXaaAsnGlnXaaXaaAspXaaXaaIleAsp151015XaaXaaAsnLysProXaaLeuProXaaAla2025<210>94<211>14<212>PRT<213>人工的<220><223>保守基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>x＝l或i<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>x＝f，t，或y<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>x＝l，i，或v<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>x＝i，v，m，或d<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>x＝e，d，或r<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>x＝r或k<400>94IleAlaXaaXaaLysAspXaaProAspXaaXaaGlyAspXaa1510<210>95<211>23<212>PRT<213>人工的<220><223>保守基序<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>x＝k或r<220><221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<223>x＝d，e，q，t，a，k，或s<220><221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>x＝a，e，s，或t<220><221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>x＝i或l<220><221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>x＝s，t，或a<220><221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>x＝q，g，d，或s<220><221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>x＝f，y，或c<220><221>MISC_FEATURE<222>(9)..(9)<223>x＝q，m，或r<220><221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>x＝f或l<220><221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>i，v，或1<220><221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>x＝n，k，或g<220><221>MISC_FEATURE<222>(14)..(14)<223>x＝l或i<220><221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>x＝y(tǒng)或f<220><221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>x＝a，l，i，或t<220><221>MISC_FEATURE<222>(19)..(19)<223>x＝y(tǒng)或f<220><221>MISC_FEATURE<222>(20)..(20)<223>x＝a，i，或l<220><221>MISC_FEATURE<222>(21)..(21)<223>x＝f，i，l，或m<220><221>MISC_FEATURE<222>(22)..(22)<223>x＝f，l，i，或y<220><221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>x＝p或s<400>95XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaTyrXaaXaaXaaTrpXaaXaaPheXaa151015XaaGluXaaXaaXaaXaaXaa20權(quán)利要求1.一種基本上純的核酸分子，其編碼選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90的氨基酸序列。2.一種包含選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90的氨基酸序列的基本上純的多肽分子。3.一種能夠特異結(jié)合包含選自SEQIDNO5、9-11、57-58或90的氨基酸序列的多肽的抗體。4.一種包含被導(dǎo)入的核酸分子的轉(zhuǎn)化植物，該核酸分子編碼包含選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽。5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、歐洲油菜、蕓苔、甘藍(lán)型油菜、嫩莖花椰菜、甘藍(lán)、柑桔、canola、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、高梁、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果樹、萵苣、豆科、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、chickpeas、玉米、菜豆屬、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花或油棕櫚。6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自甘藍(lán)型油菜、大豆或canola。7.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化植物包含具有至少相對于缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物其總生育酚水平和三烯生育酚水平之一升高的組織。8.權(quán)利要求4的被轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生具有至少相對于缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物其總生育酚水平和總?cè)┥铀街簧叩姆N子。9.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子被可操作地連接到啟動子上。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動子是種子特異性啟動子。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動子選自napin，7Sα、7Sα′、USP88、增強的USP88、Arcelin5或Oleosin。12.一種轉(zhuǎn)化植物，其包括被導(dǎo)入的編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽的第一核酸分子，及其互補體，和被導(dǎo)入的編碼選自tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、IDI、GGH、GMT、tMT2、MT1、GCPE的酶的第二核酸分子，及其互補體。13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、歐洲油菜、蕓苔、甘藍(lán)型油菜、嫩莖花椰菜、甘藍(lán)、柑桔、canola、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、高梁、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果樹、萵苣、豆科、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、chickpeas、玉米、菜豆屬、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花或油棕櫚。14.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中所述植物選自canola、甘藍(lán)型油菜或大豆。15.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化植物包括具有相對于缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物其α-生育酚水平升高的組織。16.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生具有至少相對于缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物其總生育酚水平和三烯生育酚水平之一升高的種子。17.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化植物，其中至少所述第一和第二核酸分子之一被可操作地連接到啟動子上。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動子是種子特異性啟動子。19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)化植物，其中所述啟動子選自napin，7Sα、7Sα′、USP88、增強的USP88、Arcelin5或Oleosin。20.一種轉(zhuǎn)化植物，其包括含導(dǎo)入的啟動子區(qū)的核酸分子，啟動子區(qū)在植物細(xì)胞中的作用導(dǎo)致mRNA分子生成，其中所述被導(dǎo)入的啟動子區(qū)被連接到被轉(zhuǎn)錄的核酸分子上，該核酸分子具有轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈，其中所述轉(zhuǎn)錄鏈與編碼多肽的核酸分子互補，該多肽選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90，其中所述被轉(zhuǎn)錄的核酸分子被連接到3’非翻譯序列上，該非翻譯序列在植物細(xì)胞中的作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止和添加聚腺苷酸化核苷酸到mRNA序列的3’末端。21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化植物，其中尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)相對于缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物下降。22.一種制備種子中總生育酚水平提高的植物的方法，包括(A)用導(dǎo)入的核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物，該核酸分子編碼包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽；和(B)培育所述轉(zhuǎn)化的植物。23.權(quán)利要求22的制備植物的方法，其中所述植物選自紫苜蓿、擬南芥、大麥、歐洲油菜、蕓苔、甘藍(lán)型油菜、嫩莖花椰菜、甘藍(lán)、柑桔、canola、棉花、大蒜、燕麥、蔥屬、亞麻、觀賞植物、花生、胡椒、馬鈴薯、油菜籽、稻、黑麥、高梁、草莓、甘蔗、甜菜、西紅柿、小麥、白楊、松樹、冷杉、桉樹、蘋果樹、萵苣、豆科、葡萄、香蕉、茶、草坪草、向日葵、大豆、玉米、菜豆屬、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花或油棕櫚。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述植物選自canola、甘藍(lán)型油菜(oilseedrape)和大豆。25.權(quán)利要求22的方法，其中植物用編碼選自tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、IDI、GGH、tMT2、GMT、MT1、GCPE的酶，和他們的互補體的導(dǎo)入第二核酸分子轉(zhuǎn)化。26.一種來自轉(zhuǎn)化植物的種子，其包含被導(dǎo)入的編碼包含選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸的多肽的核酸分子。27.權(quán)利要求26的種子，其中所述種子至少總生育酚水平和三烯生育酚水平之一相對于來自缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物的種子升高。28.一種來自轉(zhuǎn)化植物的種子，該植物包括編碼被導(dǎo)入的包括選自SEQIDNO5、9-11、43-44、57-58或90的氨基酸序列的多肽的導(dǎo)入的第一核酸分子，和被導(dǎo)入的編碼選自tyrA、預(yù)苯酸脫氫酶、生育酚環(huán)化酶、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、AANT1、IDI、GGH、tMT2、MT1、GCPE、GMT的酶的第二核酸分子，及其互補體。29.權(quán)利要求28的種子，其中所述種子至少總生育酚水平和三烯生育酚水平之一相對于來自缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的具有類似遺傳背景的植物的種子升高。30.一種基本上純的多肽，其包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列不是來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、canola、棉花或西紅柿的核酸分子。31.權(quán)利要求30的多肽，其中一種以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。32.權(quán)利要求31的多肽，其中所述氨基酸不是來自衍生自Sulfolobus、Aeropyrum或高粱的核酸。33.一種基本上純的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不是來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、canola、棉花或西紅柿的核酸分子。34.權(quán)利要求33的核酸分子，其中該多肽包含一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。35.權(quán)利要求34的多肽，其中所述核酸分子不是來自衍生自Sulfolobus、Aeropyrum或高粱的核酸。36.一種用核酸分子轉(zhuǎn)化的植物，該核酸分子編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不是來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌、橙色綠屈撓菌、小麥、韭、canola、棉花或西紅柿的核酸分子。37.權(quán)利要求36的轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子不來自衍生自Sulfolobus、Aeropyrum或高粱的核酸。38.一種基本上純的核酸分子，其包含選自SEQIDNO31、34-36、59-60或91的核酸序列。39.一種基本上純的多肽，其包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列不包括任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060序列表中所示的氨基酸，和不包含本申請的SEQIDNO1-11、43-45、57-58、61-62或90。40.權(quán)利要求39的多肽，其中一種以上的氨基酸序列選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95。41.一種基本上純的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不包含任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060的序列表中的核酸序列，和不包含Genebank登錄號為AI897027或AW563431的核酸序列，和不包含本發(fā)明的SEQIDNO27-36、59-60、88-89和91。42.權(quán)利要求44的核酸分子，其中多肽還包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。43.一種用核酸分子轉(zhuǎn)化的植物，該核酸分子編碼包含選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列的多肽，其中所述核酸分子不包含任何示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060的序列表中的核酸序列，不包含具有Genebank登錄號為AI897027或AW563431的核酸序列，和不包含本發(fā)明的SEQIDNO27-36、59-60、88-89和91。44.權(quán)利要求43的核酸分子，其中該多肽包括一種以上選自SEQIDNO39-42、46-49或92-95的氨基酸序列。45.一種基本上純的具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其包含選自SEQIDNO43-44的氨基酸序列。46.一種基本上純的核酸分子，其編碼具有尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽并包含選自SEQIDNO43-44的氨基酸序列。47.權(quán)利要求28的種子，其中被導(dǎo)入的第二核酸是GMT。48.權(quán)利要求47的種子，其中所述種子至少總生育酚水平和總?cè)┥铀街幌鄬τ诰哂蓄愃七z傳背景但是缺乏所述導(dǎo)入核酸分子的種子升高，并且至少約90％的總生育酚是α-生育酚。49.權(quán)利要求48的基本上純的核酸分子，其中該核酸分子包含選自SEQIDNO88-89的序列。50.用任何以模式模型示于附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、和35a-35b中的比對所鑒定的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列，不包括示于WO00/68393；WO00/63391；WO01/62781或WO02/33060的序列表中的氨基酸序列，和不包含本發(fā)明的SEQIDNO1-11、43-45、57-58、61-62和91。51.用任何以模式模型示于附圖2a-2c、3a-3c、24a-24b、25a-25b、33a-33c、34a-34b、和35a-35b中的比對所鑒定的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶序列，其中所述氨基酸序列不是來自衍生自點型念珠藍(lán)細(xì)菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、集胞藍(lán)細(xì)菌屬、玉米、大豆、擬南芥、稻、小麥、韭、canola、棉花或西紅柿的核酸分子。52.權(quán)利要求50或51的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，其中基于模式模型是HMM模型。53.權(quán)利要求52的尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶，其中基于序列檢索方法的模式是采用HMMER包2.2g版本以默認(rèn)參數(shù)產(chǎn)生的HMM模型。全文摘要本發(fā)明屬于植物遺傳學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及與生育酚生物合成路徑相關(guān)的基因和多肽，也就是編碼尿黑酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶活性的那些，以及它們的用途。文檔編號C12N15/29GK1688697SQ03811448公開日2005年10月26日申請日期2003年3月18日優(yōu)先權(quán)日2002年3月19日發(fā)明者亨利·E·瓦倫丁,泰亞馬岡德魯·V·文卡蒂什,巴拉薩洛吉尼·卡魯納南達(dá)申請人:孟山都技術(shù)公司