專(zhuān)利名稱(chēng)：包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物的微膠囊及其作為反應(yīng)隔間進(jìn)行平行反應(yīng)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用微膠囊的受控通透性來(lái)包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物，并提供一個(gè)隔間來(lái)進(jìn)行核酸聚合和/或擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)。在核酸進(jìn)行聚合和/或擴(kuò)增期間，特別是聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)期間，高分子量的核酸產(chǎn)物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)被積聚在包含了聚合酶和合適的模板的膠囊內(nèi)層，同時(shí)在反應(yīng)期間低分子量的底物分子，特別是dNTP和/或ddNTP，會(huì)從膠囊外面滲入膠囊內(nèi)部。本發(fā)明也描述了將核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物包囊化入微膠囊內(nèi)和應(yīng)用這些膠囊來(lái)進(jìn)行多重核酸聚合和/或擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)。所述的膠囊產(chǎn)生了獨(dú)立的隔間來(lái)進(jìn)行各個(gè)分開(kāi)的核酸聚合和/或擴(kuò)增反應(yīng)，特別是聚合酶鏈反應(yīng)。此外本發(fā)明亦描述如何檢測(cè)、分離和分析一個(gè)包囊化了核酸產(chǎn)物的膠囊，特別是包囊化了聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊。本發(fā)明還提供了應(yīng)用多重核酸聚合和/或擴(kuò)增的例子，特別是用于分析目的的聚合酶鏈反應(yīng)。
在現(xiàn)有技術(shù)中，聚合酶鏈反應(yīng)是在反應(yīng)管或微滴定板或在玻璃毛細(xì)管里進(jìn)行。反應(yīng)管內(nèi)的反應(yīng)容量變化為50到200微升，而在微滴定板內(nèi)則為10到100微升，使用Roche(LightCycler)最新和最先進(jìn)的PCR cycler，玻璃毛細(xì)管里反應(yīng)容量則小于20微升。利用反應(yīng)管進(jìn)行平行的聚合酶鏈反應(yīng)被局限于大約48個(gè)反應(yīng)，而用高密度微滴定板為96至少于2000個(gè)反應(yīng)，玻璃毛細(xì)管利用儀器亦可進(jìn)行96個(gè)平行反應(yīng)。但這數(shù)目對(duì)于進(jìn)行篩選項(xiàng)目來(lái)說(shuō)仍然太小，例如在合理的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行藥物學(xué)研究。最新的PCR cycler型號(hào)(即Roche LightCycler)好處是它們能進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，在實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)中，可知道每一個(gè)實(shí)時(shí)反應(yīng)所生成的聚合酶鏈反應(yīng)混合物和序列的結(jié)果。在當(dāng)前的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)至，每個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)是由反應(yīng)管或板孔或毛細(xì)管分開(kāi)，這些毛細(xì)管或板孔是由塑料器皿(PS或PP)或玻璃制成。為進(jìn)行大量平行的反應(yīng)，整合密度必須增加并且反應(yīng)容量必須減少，以當(dāng)前的技術(shù)來(lái)增加聚合酶鏈反應(yīng)的數(shù)量難以有成功的機(jī)會(huì)。每塊標(biāo)準(zhǔn)格式的微滴定板最多已有1539個(gè)板孔。此外，裝入如此大量的板孔亦成為一個(gè)重要的問(wèn)題。
使用現(xiàn)有技術(shù)水平，聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)備每次只有大約48到1539聚合酶鏈反應(yīng)能平行的進(jìn)行。特別的儀器能夠處理超過(guò)一塊的聚合酶鏈反應(yīng)微滴定板，從而增加通量，但是，這種增加只能是大約一個(gè)數(shù)量級(jí)而且儀器需要更大的實(shí)驗(yàn)室空間。
T.Oberholzer等，在化學(xué)及生物(Chemistry & Biology)，2(1995)，677-682已描述在一個(gè)脂質(zhì)體(liposome)里進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，但是，脂質(zhì)體對(duì)于聚合酶鏈反應(yīng)混合物是非通透性的，所以所有的聚合酶鏈反應(yīng)混合物必須在最初存在脂質(zhì)體中，但這樣會(huì)大大地局限實(shí)際的用途。
所以，本發(fā)明的目標(biāo)是提供一個(gè)改進(jìn)的核酸擴(kuò)增的過(guò)程，特別是，提供一個(gè)能夠平行進(jìn)行大量平行核酸擴(kuò)增的過(guò)程。
此目標(biāo)可根據(jù)本發(fā)明通過(guò)一種核酸擴(kuò)增過(guò)程而實(shí)現(xiàn)，其步驟包括(a)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，
(b)將所述的反應(yīng)混合物包囊化入對(duì)低分子量分子具有高通透性和對(duì)高分子量分子無(wú)通透性的膠囊，且由此形成包含反應(yīng)混合物的成分的膠囊，和(c)進(jìn)行至少一個(gè)擴(kuò)增步驟，因而可在一個(gè)或更多膠囊之內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明描述了一種可實(shí)現(xiàn)多達(dá)105到1011倍的核酸擴(kuò)增的方法，特別是平行聚合酶鏈反應(yīng)。
本發(fā)明基于將核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物包囊化在膠囊中，特別是，將聚合酶鏈反應(yīng)混合物包囊化入擁有對(duì)低分子量分子具有高通透性和對(duì)高分子量分子無(wú)通透性的微膠囊中，所述膠囊產(chǎn)生了一個(gè)隔間來(lái)進(jìn)行各個(gè)核酸擴(kuò)增，特別是，獨(dú)立的各個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)。在核酸擴(kuò)增期間，高分子量的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，會(huì)被積存在包含了聚合酶、合適的模板和引物的膠囊之中，而低分子量的底物分子，特別是dNTP，會(huì)從外面滲入膠囊內(nèi)部。發(fā)明的低分子量的分子的分子量少于2000Da，特別是少于1500Da，而更好是少于1200Da，這包括dNTP、ddNTP和標(biāo)記的、特別是熒光標(biāo)記的核苷酸。高分子量的分子的分子量相應(yīng)大于2000Da，特別是大于2500Da，更好大于3000Da，這些分子包括聚合酶、引物、模板和擴(kuò)增產(chǎn)物。
典型的膠囊直徑是在50納米至1000微米的范圍以?xún)?nèi)，優(yōu)選地是在500納米至100微米的范圍內(nèi)，而最優(yōu)選地是在40微米至60微米的范圍。膠囊最佳是分散在緩沖液中，即聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液中(包含核苷酸-dNTP)，當(dāng)中的密度是大約每毫升有105個(gè)到1011個(gè)膠囊。使用微膠囊來(lái)包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物就可能在細(xì)小的容器中進(jìn)行大量的平行反應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)水平比較，微膠囊是用作分開(kāi)各自的核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)，而不再是用塑料器皿或玻璃做成的反應(yīng)管和板孔。使用本發(fā)明，每次可有高達(dá)105到1011個(gè)平行的核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)(根據(jù)膠囊的大小和密度)，可在一個(gè)核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行。其中一個(gè)優(yōu)選的用途是從一個(gè)復(fù)雜DNA混合物中分離單鏈的DNA分子，并且篩選，測(cè)序，和建造DNA文庫(kù)。流式細(xì)胞儀(Flow cytometry)是一個(gè)有效力的方法來(lái)分析和分離一些包含核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的膠囊，特別是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊，當(dāng)前發(fā)明提供了一個(gè)方法用作大量的篩選而這些是目前技術(shù)未能做到的。
本發(fā)明是提及包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物在膠囊中，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物，從而產(chǎn)生了一個(gè)隔間來(lái)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)。第一步是提供一個(gè)核酸擴(kuò)增混合物，混合物包含所有或一些必需的反應(yīng)伙伴或成分用作進(jìn)行核酸擴(kuò)增混合物。另外的成分是在膠囊形成以后才加入。更好地，聚合酶鏈反應(yīng)混合物包括聚合酶和/或引物和/或模板和/或緩沖液物質(zhì)和/或各種dNTP和/或增強(qiáng)子(enhancers)和/或DNA探針，更好地，混合形成基質(zhì)材料的微顆粒材料(即瓊脂糖)?；|(zhì)材料結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)混合物形成微顆粒(microparticles)(如，通過(guò)形成離子化藻酸鹽或瓊脂糖凝膠)(圖1/23)。另一個(gè)方法是將反應(yīng)混合物混合多孔的微顆粒(porous microparticle)作為基質(zhì)材料。該方法的描述詳細(xì)的見(jiàn)實(shí)施例部分。
第二步是將核酸擴(kuò)增混合物包囊化。在這步，裝有反應(yīng)伙伴或反應(yīng)混合物成分的膠囊會(huì)被形成。反應(yīng)混合物不會(huì)獨(dú)自被包囊化，反應(yīng)混合物首先混合基質(zhì)材料，然后再將微顆粒包囊化。在這個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行包囊化過(guò)程(encapsulation)之前，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物成分先混入基質(zhì)材料。合適的基質(zhì)材料材料是，例如，多孔的微顆粒、蠟樣物質(zhì)(wax-like substances)，瓊脂糖、藻酸鹽、多糖、多肽、脂肪酸，脂肪酸鹽，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或冰，或其混合物作基質(zhì)材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基質(zhì)材料材料(如，瓊脂糖、藻酸鹽、微顆粒)混合核酸擴(kuò)增混合物，然后被包囊化(圖1/24)。有很多的方法能夠進(jìn)行包囊化過(guò)程，例如，續(xù)層生長(zhǎng)(layer-by-layer)技術(shù)或界面的聚合或空化(cavitation)技術(shù)。膠囊的通透性是可被控制的，因此小分子(如dNTP、ddNTP、短的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(primers))可通過(guò)膠囊的壁滲入膠囊之內(nèi)，但較大的分子(如，DNA模板、聚合酶鏈反應(yīng)引物、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物、聚合酶)則無(wú)法通過(guò)膠囊。
進(jìn)行續(xù)層生長(zhǎng)技術(shù)的一個(gè)基本要求是帶電的模板(被包囊化的材料)。瓊脂糖和藻酸鹽微顆粒是帶負(fù)電的，所以是一塊適合的模板。多孔微顆粒可帶有負(fù)電或正電表面電荷。利用續(xù)層生長(zhǎng)的包囊化技術(shù)，膠囊的通透性可從聚合電解質(zhì)(polyelectrolytes)的層數(shù)，聚合電解質(zhì)的物料，聚合電解質(zhì)的分子量和交聯(lián)作用(crosslinking)方面來(lái)控制。
任意地，在進(jìn)行包囊化過(guò)程之后，基質(zhì)材料將自膠囊中被溶解或去除(圖1/25)，例如，將藻酸鹽制成的基質(zhì)材料放進(jìn)無(wú)鈣緩沖液作交換。溶解或去除基質(zhì)材料是可行的，例如由溶劑溶解，或通過(guò)化學(xué)方如氧化作用，或在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)期間用高溫溶解，在聚合酶鏈反應(yīng)的溫度下，瓊脂糖基質(zhì)材料將被熔化，因此對(duì)膠囊之內(nèi)的分子是高通透性的。
下一步，至少進(jìn)行一擴(kuò)增步驟，即聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)，擴(kuò)增一個(gè)或更多膠囊之內(nèi)的核酸。在進(jìn)行擴(kuò)增步驟之前，先將未包囊化的反應(yīng)混合物與膠囊分開(kāi)，如用離心法，過(guò)濾法，透析法或用核酸酶()和/或蛋白酶作破壞。微膠囊將被分散在緩沖液中，進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，則使用聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液。將分散在反應(yīng)管(或微滴定板)的微膠囊放進(jìn)常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)儀(PCR cycler)，按標(biāo)準(zhǔn)的溫度作聚合酶鏈反應(yīng)的循環(huán)。
本發(fā)明在過(guò)程中的特殊好處是在擴(kuò)增進(jìn)行過(guò)程中和/或較早期間可以連續(xù)或分批(batchwise)方式將核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的組分、成分、或反應(yīng)物能選擇性進(jìn)入膠囊。優(yōu)選地，膠囊的通透性能選擇性地允許部分原料滲入膠囊內(nèi)，譬如各種dNTP。但卻限制反應(yīng)產(chǎn)物或模板向外滲。這允許連續(xù)或分批地補(bǔ)充一種或幾種原料進(jìn)入膠囊，進(jìn)一步充實(shí)需要的產(chǎn)物，因而，它的表現(xiàn)是不會(huì)被開(kāi)始的反應(yīng)物限制。
例如，在擴(kuò)增期間，會(huì)作連續(xù)選擇性的交換。以續(xù)層生長(zhǎng)技術(shù)包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物與膠囊外的介質(zhì)能交換低分子量的反應(yīng)物，特別是各種dNTP。各種dNTP能容易地滲過(guò)膠囊的壁。因而，各種dNTP能加入反應(yīng)混合物中。膠囊內(nèi)最理想的核苷酸(dNTP)濃度將能保持一段長(zhǎng)時(shí)期的不變。核酸擴(kuò)增或聚合反應(yīng)，特別是聚合酶鏈反應(yīng)因此不被膠囊內(nèi)的基礎(chǔ)單元的材料(例如各種dNTP)所限制。
如果更好地使用熒光標(biāo)記的各種dNTP，擴(kuò)增的產(chǎn)物將被標(biāo)記并且包含擴(kuò)增產(chǎn)物的膠囊將可容易地被確認(rèn)。如果使用4種熒光的ddNTP作標(biāo)記物，聚合作用的產(chǎn)物的3′末端基部將被熒光標(biāo)記。
例如，分批選擇性的交換可在擴(kuò)增之前或期間發(fā)生，當(dāng)有一個(gè)觸發(fā)的變化從而改變膠囊壁的通透性，成分(constituents)、組分(components)或反應(yīng)物(reactants)便能轉(zhuǎn)移入膠囊內(nèi)。膠囊壁的通透性，例如，能被酸堿度值的變化而改變，例如根據(jù)酸堿度而膨脹或收縮水凝膠膠囊材料，或改變反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度。在一個(gè)較好的過(guò)程中，利用續(xù)層生長(zhǎng)技術(shù)將3到6層的巰基化的聚合電解質(zhì)構(gòu)建在膠囊上而最外層則是非巰基化的層。有氧氣的存在，巰基將形成二硫鍵，導(dǎo)致聚合電解質(zhì)層發(fā)生交聯(lián)作用，從而減低通透性，但加入還原劑(reducetive agent)(如DTT)，將二硫鍵還原至巰基，而增加膠囊的通透性。另外，這項(xiàng)原則能被應(yīng)用于產(chǎn)生穩(wěn)定交叉的膠囊來(lái)用作進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的循環(huán)和故意地打開(kāi)這樣的膠囊，例如，釋放DNA的產(chǎn)物，從而進(jìn)行電泳法實(shí)驗(yàn)。
在擴(kuò)增期間，連續(xù)選擇性地交換和分批的加入反應(yīng)物程序能被結(jié)合，例如當(dāng)DNA序列由聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，各種dNTP能連續(xù)的流入，而被熒光標(biāo)記的ddNTP則分批的加入，刑成3′末端熒光標(biāo)記的產(chǎn)物。
優(yōu)選地，根據(jù)發(fā)明過(guò)程包括進(jìn)一步的步驟(d)檢測(cè)膠囊內(nèi)包含的核酸產(chǎn)物。這步可使用例如流式細(xì)胞儀或顯微鏡進(jìn)行。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)構(gòu)成核酸擴(kuò)增反應(yīng)的混合物和/或膠囊材料中載有一個(gè)標(biāo)記物。合適的標(biāo)記物包括如熒光團(tuán)、量子小點(diǎn)(quantum)、放射性同位素(radioisotopes)、染料或核磁共振活性同位素(NMR active isotopes)或納米粒子(nanoparticles)。特別地，選擇標(biāo)記物能將各膠囊編碼和/或?qū)⒉煌姆磻?yīng)產(chǎn)物編碼。
陽(yáng)性膠囊，即膠囊裝有核酸產(chǎn)物，優(yōu)選地，從反應(yīng)混合物中被分開(kāi)。例如，包含核酸產(chǎn)物的膠囊能從一些物理性的特征如標(biāo)記物或?qū)NA染色的染料或測(cè)定DNA所吸收的紫外線(xiàn)(UV)而檢測(cè)，然后從膠囊懸液中分開(kāi)和分離。核酸產(chǎn)物在所說(shuō)的膠囊中將被分析或提取作進(jìn)一步的用途。聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物是從很多分開(kāi)的或一個(gè)的膠囊中提取出來(lái)。
Oberholzer et al.調(diào)查生命的起源和在脂質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Chemistry & Biology，2677 682，1995)。用脂質(zhì)體來(lái)包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，然而DNA，引物，染色染料或核苷酸(dNTP)，這些材料無(wú)法與外在的介質(zhì)交換。脂質(zhì)體中的雙分子脂膜(lipid bilayers)不允許帶電分子穿過(guò)(所有聚合酶鏈反應(yīng)的混合物都是帶電和/或是大分子)。所以當(dāng)所各種dNTP用完后，聚合酶鏈反應(yīng)將會(huì)停止，并且無(wú)法區(qū)別膠囊內(nèi)是否含有聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物。
本發(fā)明是標(biāo)記起始原料，即使用標(biāo)記的各種dNTP或被標(biāo)記的ddNTP來(lái)產(chǎn)生被標(biāo)記的核酸，如被熒光標(biāo)記的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，將被積存在聚合酶鏈反應(yīng)的膠囊中，這樣膠囊將可容易地檢測(cè)，如基于它們的熒光強(qiáng)度，和分離，如基于紫外線(xiàn)(UV)或熒光的檢測(cè)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶鏈反應(yīng)只在存有模板和互補(bǔ)的引物的膠囊內(nèi)進(jìn)行(圖2/22和2b)，而其它的膠囊(圖2/21和3)是不會(huì)產(chǎn)生出聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物。由于在聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，使用了被熒光標(biāo)記的各種dNTP，因此聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物將被熒光分子標(biāo)記。
在聚合酶鏈反應(yīng)的循環(huán)期間，發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)的膠囊(″陽(yáng)性膠囊″)內(nèi)熒光強(qiáng)度會(huì)不斷增加。另一方式是把報(bào)告染料(reporter dyes)插入聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)些染料(如，溴化乙啶，SYBR Green I)插入雙鏈的DNA內(nèi)(即聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物)將增強(qiáng)熒光的程度。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的序列資料，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物，能由使用雜交探針獲得(如，Tag Man system或分子信號(hào))。
通過(guò)流式細(xì)胞儀的分選步驟，陽(yáng)性膠囊能從大量膠囊中被檢測(cè)和分離，現(xiàn)代的流式細(xì)胞儀能每秒以高準(zhǔn)確性地分析70 000個(gè)微顆粒。微膠囊的懸液約有109個(gè)膠囊大約需要4個(gè)小時(shí)來(lái)分析，現(xiàn)代儀器更裝備多色分析功能，這個(gè)方法能辨認(rèn)出編碼的膠囊或在復(fù)雜的混合物中跟蹤單一的膠囊。因此流式細(xì)胞儀能提供一個(gè)作高效能的大量篩選方法。
另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物的微膠囊，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的混合物被固定在二維的表面上。各個(gè)膠囊位置能由攝像機(jī)確定，用激光將固定的膠囊照亮從而提供能量，將各個(gè)膠囊加熱至合適的聚合酶鏈反應(yīng)的循環(huán)溫度。
激光在表面上掃描(如，使用可移動(dòng)的電子性反射鏡(mirror)和鏡片(optic))并且找出單一膠囊或有些表面的位置。不同的聚合酶鏈反應(yīng)溫度曲線(xiàn)圖適用于單一的膠囊或特定的表面，膠囊的溫度是受控于激光的能量和照明的時(shí)間，膠囊壁混合染料能增加激光能量的吸收，另外染料更可用作找出膠囊的位置。使用了被熒光標(biāo)記的各種dNTP，膠囊內(nèi)的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的增加就能從熒光的強(qiáng)度作在線(xiàn)式測(cè)定，這允許對(duì)各個(gè)膠囊進(jìn)行實(shí)時(shí)(real time)的聚合酶鏈反應(yīng)。利用實(shí)時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度的增加和連續(xù)應(yīng)用不同的聚合酶鏈反應(yīng)溫度曲線(xiàn)圖來(lái)擬出每個(gè)膠囊的合適聚合酶鏈反應(yīng)溫度曲線(xiàn)圖，使用智能反饋環(huán)路(feedback loop)能選擇優(yōu)化的溫度曲線(xiàn)圖和擬出最大效能的擴(kuò)增或特異性(specificity)。
根據(jù)發(fā)明在過(guò)程中，核酸擴(kuò)增的反應(yīng)就是聚合酶鏈反應(yīng)。在這種情況下過(guò)程優(yōu)選地包括的步驟
(i)提供聚合酶鏈反應(yīng)混合物，包括聚合酶和/或各種dNTP和/或緩沖液的物質(zhì)和/或增強(qiáng)子和/或引物和/或模板和/或DNA探針和/或基質(zhì)材料的材料，(ii)將所述的聚合酶鏈反應(yīng)混合物包囊化入對(duì)低分子量分子具有高通透性和對(duì)高分子量分子無(wú)通透性的微膠囊，由此制成包含了反應(yīng)混合物的成分的膠囊，和(iii)在聚合酶鏈反應(yīng)的溫度循環(huán)下，進(jìn)行至少一次核酸擴(kuò)增，由此在一個(gè)或更多膠囊之內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種膠囊，其包囊化核酸聚合作用和/或擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)混合物和/或核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物。這些膠囊有利地用作各種各樣的用途，除了作為反應(yīng)隔間(reaction compartment)進(jìn)行平行核酸擴(kuò)增和/或聚合反應(yīng)，它們還能應(yīng)用于分析和/或篩選核酸或人工合成的核酸衍生物，產(chǎn)生核酸文庫(kù)，核酸測(cè)序，用于生物鑒定(bioassays)或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物的微膠囊內(nèi)可用作建造一個(gè)基因組文庫(kù)(genomic DNAlibrary)，包括如下步驟(i)分離基因組的脫氧核糖核酸(genomic DNA)，(ii)用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行部分消化產(chǎn)生有粘性末端(如與Sau3.A)的大約500到50kb的片段，(iii)然后由雜交作用和連接作用，使用已知的DNA將基因組的DNA的片段的兩個(gè)末端延長(zhǎng)，以產(chǎn)生重組的DNA，(例如利用BamHI核酸酶將λphage的脫氧核糖核酸(DNA)做成粘性末端以互補(bǔ)于基因組的DNA的片段。將λphage的中間部分切除(＝可替代的部分)。將λphage的DNA片段和基因組的DNA的片段雜交。將片段連接來(lái)產(chǎn)生重組的DNA，(iv)準(zhǔn)備聚合酶鏈反應(yīng)混合物，其包含作為模板的重組的DNA和一對(duì)用作互補(bǔ)于某個(gè)區(qū)域來(lái)作擴(kuò)增基因組的DNA的片段的引物，(v)將前述的混合物包囊化入微膠囊，使得每個(gè)膠囊統(tǒng)計(jì)性地?cái)y帶一個(gè)拷貝，和(vi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
在另一本發(fā)明的實(shí)施方案中，包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物的微膠囊可用于構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)，其包括如下步驟(i)將mRNA分離，(ii)將poly(T)寡核苷酸和mRNA雜交，(iii)用逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)延長(zhǎng)poly(T)的引物，(iv)用堿將mRNA水解，從而產(chǎn)生單鏈的cDNA，(v)用末端轉(zhuǎn)移酶將寡核苷酸的尾部，如poly(G)，加入3′末端，(vi)準(zhǔn)備聚合酶鏈反應(yīng)混合物，用cDNA作為模板和一對(duì)能將編碼區(qū)域用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的引物，如，poly(T)和poly(C)，(vii)將所述的混合物包囊化，使得每個(gè)膠囊統(tǒng)計(jì)性地?cái)y帶一個(gè)拷貝，和(viii)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
在另一實(shí)施方案的發(fā)明，核酸產(chǎn)物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，用凝膠過(guò)濾色譜技術(shù)來(lái)平行的分析多個(gè)膠囊，其步驟包括(i)將填充了核酸產(chǎn)物膠囊包埋在一層稀薄的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中，
(ii)通過(guò)化學(xué)或物理方法，使得膠囊壁對(duì)核酸產(chǎn)物具通透性，使得核酸由膠囊中釋放，(iii)提供電壓進(jìn)行凝膠電泳，(iv)檢測(cè)從各個(gè)膠囊產(chǎn)生的帶型，和(v)由裝了DNA ladder的膠囊制作標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算出DNA片段的長(zhǎng)度。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，包囊化了核酸反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物的微膠囊被用于DNA或基因組的DNA或cDNA的測(cè)序，包括的步驟(i)進(jìn)行所述構(gòu)建DNA文庫(kù)的步驟(i)至(v)或進(jìn)行所述構(gòu)建cDNA文庫(kù)的步驟(i)至(vii)，以產(chǎn)生長(zhǎng)度大約500bp的DNA片段，但使用一對(duì)引物，而其中的一個(gè)引物的數(shù)量要超出另一個(gè)，如比率2∶1到1000∶1。
(ii)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)直到最低濃度的引物被用完，(iii)在微膠囊懸液中加入分別標(biāo)記了4種熒光的ddNTP，其與dNTP的濃度比為大約1/500，如1/100到1/1000，并以多余的引物進(jìn)行延長(zhǎng)，(iv)進(jìn)行所述用凝膠電泳來(lái)分析核酸膠囊內(nèi)容的步驟(i)到(iii)，(v)用與四種染料對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)從各個(gè)膠囊產(chǎn)生的帶型，和(vi)計(jì)算出DNA的片段(DNA fragments)和整個(gè)基因組的序列。
除所述的產(chǎn)生DNA文庫(kù)、電泳和測(cè)序的程序之外，還可有以下的改進(jìn)。產(chǎn)生DNA或基因組文庫(kù)可由不同的核酸酶作消化作用來(lái)產(chǎn)生出粘性末端，以便用雙鏈DNA尾來(lái)延長(zhǎng)dsDNA的末端。如使用BamHI核酸酶來(lái)在5′-G^GATC-NNN-3′//3′-NNN-CTAG^G-5′切開(kāi)，然后造出粘性末端序列為5′GATC NNN 3′，能由雜交作用和連結(jié)作用來(lái)伸展有粘性末端5′-GATC-Nn-3′(N＝CGAT，n＝1-25)的dsDNA。這個(gè)做法將產(chǎn)生出相同序列的3′-端的DNA分子。一個(gè)引物在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)中可用來(lái)擴(kuò)增兩條鏈。
進(jìn)行電泳的分析如前所述，核酸產(chǎn)物能被從微膠囊釋放出來(lái)，例如，用二硫鍵連接的膠囊。在凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)膠囊需要至少有50微米×5厘米的凝膠區(qū)域，一張A4大小的凝膠大約可進(jìn)行24000個(gè)凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)，大約有107個(gè)堿基序列的資料。而質(zhì)粒，病毒和細(xì)菌染色體(bacterium chromosome)則大約需要1張A4大小的凝膠，但是人類(lèi)的基因組含3×109bp大約需要250張A4大小的凝膠，而一條人的染色體則需要6張凝膠。如根據(jù)發(fā)明的過(guò)程則有潛力在大約1天內(nèi)完成基因組的測(cè)序。
進(jìn)行測(cè)序?yàn)檫M(jìn)行DNA文庫(kù)測(cè)序，DNA的片段首先要在它們的3′末端有兩個(gè)不同的序列，這通過(guò)與質(zhì)粒進(jìn)行雜交作用和連結(jié)作用而實(shí)現(xiàn)。這允許不同的引物雜交在3′末端。使用一種過(guò)剩的引物將編碼鏈或非編碼鏈的其中一股制成具有熒光標(biāo)記的3′末端的片段。為此，加入兩種引物的比例為1∶2到1∶1000，聚合酶鏈反應(yīng)可進(jìn)行直到低濃度的引物用完。然后，在有ddNTP的情況下，過(guò)量的引物將被延長(zhǎng)。這方法能在過(guò)量的正向或反向的引物下進(jìn)行。進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，一個(gè)使用過(guò)量的正向引物而另一個(gè)使向過(guò)量的反向引物，得出兩組互補(bǔ)序列的資料。用與聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)相似的形式，能重復(fù)多次延長(zhǎng)過(guò)量的引物。
進(jìn)一步，發(fā)明包括用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的膠囊或進(jìn)行本發(fā)明的方法所用的試劑盒(kit)，其中包含至少一種進(jìn)行所述方法所必需的起始原料。
本發(fā)明進(jìn)一步在以下圖和實(shí)施例中說(shuō)明。


圖1顯示制備包囊化聚合酶鏈反應(yīng)混合物的膠囊的過(guò)程。反應(yīng)混合物(圖1/21)包括各種dNTP和/或緩沖液物質(zhì)和/或增強(qiáng)子和/或引物和/或模板和/或聚合酶。反應(yīng)混合物在包囊化入膠囊內(nèi)之前先混入基質(zhì)材料(圖1/22)產(chǎn)生混入了反應(yīng)混合物的基質(zhì)材料微顆粒(圖1/23)。使用續(xù)層生長(zhǎng)技術(shù)來(lái)進(jìn)行包囊化過(guò)程(圖1/24)。最終，將基質(zhì)材料從膠囊中除去，而包囊化的反應(yīng)混合物保留在膠囊中(圖1/25)。
圖2顯示包囊化了聚合酶鏈反應(yīng)混合物的膠囊的的應(yīng)用。膠囊包含了模板和/或引物(圖2/21-3)。聚合酶鏈反應(yīng)只發(fā)生在包含了互補(bǔ)的模板和引物的膠囊(圖2/2 2b)。膠囊不包含模板或包含非互補(bǔ)的模板和引物無(wú)法產(chǎn)生聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物(圖2/21b和3b)。包含了聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊由例如熒光或紫外光鑒別和分離(圖2/22c)。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物和模板從單個(gè)膠囊中被提取作進(jìn)一步研究(圖2/22d)。
圖3表示，聚合酶鏈反應(yīng)能夠成功地進(jìn)行在瓊脂糖的基質(zhì)材料中。條帶1＝Ladder(100bp)，2＝陽(yáng)性對(duì)照，3＝陰性對(duì)照，4＝陽(yáng)性對(duì)照+0.1％瓊脂糖，5＝陽(yáng)性對(duì)照+0.2％瓊脂糖，6＝陽(yáng)性對(duì)照+0.5％瓊脂糖，7＝陽(yáng)性對(duì)照+0.6％瓊脂糖，8＝陽(yáng)性對(duì)照+0.7％瓊脂糖，9＝陽(yáng)性對(duì)照+0.8％瓊脂糖，10＝陽(yáng)性對(duì)照+1.0％瓊脂糖，所有實(shí)驗(yàn)環(huán)境加入了濃度為1.5mM的鎂。
圖4展示由瓊脂糖產(chǎn)生的微顆粒(直徑大約50μm)。4a)相差顯微圖片顯示瓊脂糖微球(microbeads)的形態(tài)。4b)熒光顯微圖片(FITC-過(guò)濾器)顯示以FITC標(biāo)記的PAH制備的微膠囊微球。4c)熒光顯微圖片(乙啶(Ethidium)過(guò)濾器)顯示微球內(nèi)部的dsDNA被溴化乙啶染色。
圖5顯示了(PAH/PSS)6包囊化的瓊脂糖微球(直徑大約50μm)在聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)的情況下(0.5分鐘在95度、1分鐘在60度和2分鐘在72度)的穩(wěn)定性。5a到5d)顯微圖片顯示包囊化的珠在1個(gè)，5個(gè)，20個(gè)和30個(gè)循環(huán)以后的形態(tài)。5e)穩(wěn)定的膠囊的百分比對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)的周期作圖。
實(shí)施例材料聚陽(yáng)離子，聚烯丙基氯化銨(poly(allylamine hydrochloride)，PAH)，Mw 15,000，和聚陰離子，聚苯乙烯磺酸鈉(poly(sodium4-styrenesulfonate，PSS)，Mw 70,000購(gòu)自Aldrich。藻酸鈉購(gòu)自(Manugel)Alginate Industry GmbH。聚合酶鏈反應(yīng)試劑和聚合酶購(gòu)自Promega。引物和模板購(gòu)自synthetic genetics。
實(shí)施例1制備包囊化聚合酶鏈反應(yīng)混合物的膠囊DNA模板稀釋液(1ml的1xPCR緩沖液)稀釋DNA模板至每毫升含有的模板密度在103到1012之間。將Taq DNA(25U/ml)，0.8μM引物(或被熒光標(biāo)記的引物)和200μg/ml BSA加入模板溶液中。
A)使用多孔的微顆粒將100μL含有103個(gè)到1012個(gè)多孔微顆粒懸液(直徑由0.5到10μm，孔徑大小由0.5到200nm)與前述的溶液混合。將此混合物過(guò)夜培育允許聚合酶鏈反應(yīng)混合物滲入微粒的孔(一些物料也許會(huì)吸附在微粒表面)。利用離心機(jī)將多孔微粒由微粒懸液中分離。被分離的多孔微粒立刻用高分子電解質(zhì)在微顆粒包埋(5mg PAH在1mL1xPCR緩沖液)。然后用離心機(jī)去除剩余而不被吸附的高分子電解質(zhì)，隨后以1xPCR緩沖液作三個(gè)周期洗滌多孔微顆粒上多余的高分子電解質(zhì)。然后，加入1mL帶有相反電荷的高分子電解質(zhì)(5mg PSS在1mL 1xPCR緩沖液)在微顆粒的表面形成連貫層。重復(fù)上述的離心，洗滌和隨后吸附帶有相反電荷的高分子電解質(zhì)步驟，直到形成所期望的層數(shù)。
B)使用基質(zhì)材料I)藻酸鹽在前述的模板溶液中加入60mg藻酸鈉。將此混合溶液轉(zhuǎn)移入分散器。使用分散器產(chǎn)生氣溶膠，并將其噴灑在2％氯化鈣溶液中。經(jīng)過(guò)10分鐘的培育，藻酸鹽微顆粒用離心機(jī)從微粒懸液中分離。步驟如實(shí)施例(1A)所述，但涂層緩沖液中增加0.5％氯化鈣，將表面附帶有負(fù)電的藻酸鹽微顆粒以高分子電解質(zhì)包被。在最后的步驟中，使用無(wú)鈣而含高鈉的緩沖液將固相的藻酸鹽微顆粒核心溶解。膠囊經(jīng)過(guò)同雙功能(homo-bis-functional)交聯(lián)劑的處理來(lái)增加膠囊壁的穩(wěn)定性。
II)瓊脂糖在前述的模板溶液中加入1％低熔化性(low melting)的瓊脂糖(熔點(diǎn)40℃)并加溫至45℃。將100μL上述的混合物加入到2mL加溫至45℃的油中?；旌衔锉蝗榛纬芍睆酱蠹s50μm成乳化液小滴。乳化液小滴傾倒在10mL4℃的PAH溶液中(5mg/mL)并且攪動(dòng)數(shù)分鐘(1到20分鐘)直到形成瓊脂糖微顆粒。使用離心機(jī)(1200g，10分鐘)將瓊脂糖微顆粒分離。乳化液的油相被去除，而且分離的瓊脂糖微顆粒以冷的緩沖液洗滌。將這些珠以多層PSS和PAH連續(xù)包被。
實(shí)施例2進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)和鑒別包含聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊將含有103個(gè)到1012個(gè)多孔微粒的懸液稀釋于9份聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液中，緩沖液中包含2mM氯化鎂，0.2mM核苷酸(dNTP)(熒光標(biāo)記的)，1xTaq緩沖液。使用常規(guī)的PCR cycler，聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)在微試管(每試管50-200μL)或在微滴定板(每板孔10-100μL)中進(jìn)行。聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)的溫度設(shè)置如下最初變性為90℃ 300秒，(變性為92℃60秒；退火為50℃ 60秒；延伸為65℃ 60秒)×15至35個(gè)循環(huán)。
使用能夠進(jìn)行熒光檢測(cè)和細(xì)胞分選的流式細(xì)胞儀鑒別和分離包含了聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊。對(duì)包含了聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊懸液作進(jìn)行一步分析。例如懸液的容量是1mL和包含了1000個(gè)膠囊。懸液被稀釋至每毫升含有750個(gè)膠囊，按照每孔10μL將懸液被分配在一塊有1536板孔的微滴定板(Greiner)的板孔內(nèi)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上每板孔內(nèi)的膠囊密度大約在0.5個(gè)膠囊(統(tǒng)計(jì)學(xué)上每板孔內(nèi)不超過(guò)1個(gè)膠囊的機(jī)會(huì)率是能夠達(dá)到的)。在膠囊破壞后(加入大約100μL 1M NaOH，培育1分鐘，加入同樣容量1M HCL)，源于模板的一條單鏈的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物存在于各個(gè)板孔內(nèi)。包含DNA的板孔(熒光被標(biāo)記的DNA產(chǎn)物)容易由熒光分光光度計(jì)鑒別。
實(shí)施例3在核酸分析和篩選中的應(yīng)用A)從一個(gè)復(fù)雜的DNA混合物中分離一目標(biāo)DNA分子將DNA分子(～1010分子)的復(fù)雜的混合物進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笈c上述的聚合酶鏈反應(yīng)混合物一同被包囊化，產(chǎn)生大約1020個(gè)懸浮膠囊。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)膠囊中應(yīng)存在0.5至1個(gè)分子。在包囊化過(guò)程之前，將一對(duì)設(shè)計(jì)為用作擴(kuò)增目標(biāo)序列的引物加入模板溶液內(nèi)(0.8μM)。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)并將包含聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的膠囊分離，這已在實(shí)施例2描述。包含聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的陽(yáng)性膠囊中也含有目標(biāo)DNA分子(最少一拷貝)，包含至少一拷貝目標(biāo)DNA的單個(gè)陽(yáng)性膠囊可用作進(jìn)一步的分析。經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，膠囊可被破壞，在分離出來(lái)的目標(biāo)DNA上可辨別其他的目標(biāo)序列。
權(quán)利要求
1.一種核酸擴(kuò)增方法，包括如下步驟(a)提供核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，(b)利用對(duì)低分子量分子具有高通透性和對(duì)高分子量分子無(wú)通透性的膠囊來(lái)包囊化所述反應(yīng)混合物，和由此形成包含所述反應(yīng)混合物的成分的膠囊，和(c)進(jìn)行至少一擴(kuò)增和/或聚合步驟，和由此在一個(gè)或更多的所述膠囊之內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(d)檢測(cè)包含核酸產(chǎn)物的膠囊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)一步包括步驟(e)自不包含核酸產(chǎn)物的膠囊中分離包含核酸產(chǎn)物的膠囊。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括步驟(f)分析或提取所述核酸產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物混入基質(zhì)材料中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基質(zhì)材料選自多孔的微顆粒、蠟樣物質(zhì)、瓊脂糖、藻酸鹽、多糖、多肽、脂肪酸、脂肪酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或冰、或其混合物。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述混入基質(zhì)材料的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物通過(guò)續(xù)層生長(zhǎng)技術(shù)、聚合技術(shù)和/或空化技術(shù)而進(jìn)行包囊化。(刪除此
權(quán)利要求
根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物溶解于液體并通過(guò)形成脂質(zhì)體進(jìn)行包囊化)
8.根據(jù)權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)化學(xué)方法或通過(guò)物理方法如加熱，用溶劑將所述基質(zhì)材料溶解和/或從膠囊中溶解和/或除去。
9.根據(jù)權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基質(zhì)材料在溫度循環(huán)中被熔化。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中形成的膠囊的直徑在50納米至1000微米的范圍，優(yōu)選的直徑在40微米至60微米的范圍。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)觸發(fā)膠囊壁通透性的改變將所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物的成分和/或反應(yīng)物轉(zhuǎn)移入膠囊內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過(guò)pH的變化或離子強(qiáng)度的變化或膠囊交聯(lián)的變化，觸發(fā)膠囊壁通透性的改變。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中控制膠囊的通透性以允許核酸擴(kuò)增反應(yīng)原料選擇性地滲透入膠囊內(nèi)，而限制膠囊內(nèi)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物和/或模板和/或引物向外滲透。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將非包囊化的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物的化合物在核酸擴(kuò)增步驟之前與膠囊分離或由酶破壞。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物和/或膠囊材料的一或多種成分?jǐn)y帶標(biāo)記物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述標(biāo)記物選自熒光團(tuán)、量子小點(diǎn)、放射性同位素、染料、納米粒子或NMR活性同位素。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述標(biāo)記物使得能夠?qū)Ω鱾€(gè)膠囊進(jìn)行編碼。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)標(biāo)記物的物理性特征或通過(guò)測(cè)定DNA所吸收的紫外線(xiàn)或通過(guò)以染料對(duì)DNA進(jìn)行染色來(lái)檢測(cè)含有核酸產(chǎn)物的膠囊，并將其從膠囊懸液中分開(kāi)和分離。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，用于對(duì)核酸或人造的核酸衍生物進(jìn)行分析和/或篩選。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，用于產(chǎn)生核酸文庫(kù)。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，用于進(jìn)行生物鑒定。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其包括以下步驟(i)提供PCR反應(yīng)混合物，包括聚合酶和/或各種dNTP和/或緩沖液物質(zhì)和/或增強(qiáng)子和/或引物和/或模板和/或DNA探針和/或基質(zhì)材料，(ii)包囊化所述的聚合酶鏈反應(yīng)混合物，和由此形成包含所述反應(yīng)混合物的成分的膠囊，和(iii)進(jìn)行包括聚合酶鏈反應(yīng)的溫度循環(huán)的至少一次的擴(kuò)增步驟，和由此在一個(gè)或更多膠囊之內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
24.根據(jù)權(quán)利要求11-13或22-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中利用觸發(fā)膠囊壁通透性的改變將模板和/或一種或更多引物轉(zhuǎn)移入膠囊內(nèi)。
25.根據(jù)權(quán)利要求11-13或22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中控制膠囊的通透性以便在聚合酶鏈反應(yīng)溫度循環(huán)期間允許dNTP和/或ddNTP和/或小引物選擇性地滲入膠囊，而限制聚合酶、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物、模板和大引物向外滲透。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述膠囊分散在聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液中。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液中包含嵌入性染料，例如溴化乙啶和/或SYBR Green I。
28.根據(jù)權(quán)利要求22-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用熱循環(huán)儀在反應(yīng)管、微滴定板或玻璃毛細(xì)管中進(jìn)行所述膠囊懸液的溫度循環(huán)。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中的dNTP和/或ddNTP和/或引物和/或模板和/或DNA探針和/或膠囊材料攜帶標(biāo)記物。
30.根據(jù)專(zhuān)利要15-16或29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的標(biāo)記物使得能夠?qū)σ锖?或模板和/或其混合物進(jìn)行編碼。
31.根據(jù)權(quán)利要求22-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中在包囊化的聚合酶鏈反應(yīng)混合物中加入其他的酶例如逆轉(zhuǎn)錄酶和/或核酸酶和/或連接酶。
32.對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的方法獲得的膠囊內(nèi)的核酸成分進(jìn)行測(cè)序的方法，其包括以下步驟(i)在一種引物過(guò)量的情況下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)直到較低濃度的引物被用盡，(ii)按照與dNTP之比為1∶100到1∶1000加入4種熒光顏色標(biāo)記的ddNTP，并是所述過(guò)量的引物延伸，和(iii)利用凝膠電泳分析各個(gè)膠囊內(nèi)的核酸膠囊成分。
33.對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的方法獲得的膠囊內(nèi)的核酸成分進(jìn)行分析的方法，其包括以下步驟(i)將膠囊埋置在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中，(ii)通過(guò)化學(xué)方法或物理方法從膠囊中釋放核酸，(iii)施加電壓進(jìn)行凝膠電泳，和(iv)檢測(cè)各個(gè)膠囊產(chǎn)生的帶型。
34.一種膠囊，其包囊化根據(jù)權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的方法獲得的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物和/或核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的膠囊，其包囊化聚合酶鏈反應(yīng)混合物和/或聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的膠囊在分析和/或篩選核酸或核酸的人造衍生物、在構(gòu)建核酸文庫(kù)、進(jìn)行核酸測(cè)序、在生物鑒定和/或在實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)中的用途。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的膠囊作為平行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)隔間的用途。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的用途，用作平行聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)隔間。
39.一種試劑盒，其用于制備前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的膠囊和/或用于進(jìn)行前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法和/或用于前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的膠囊的用途，所述試劑盒含有聚合酶和/或各種dNTP和/或ddNTP和/或緩沖液物質(zhì)和/或增強(qiáng)子和/或引物和/或模板和/或DNA探針和/或基質(zhì)材料和/或膠囊材料和/或標(biāo)記物和/或塑料器皿和/或用戶(hù)手冊(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)低分子量分子具有高通透性和對(duì)高分子量分子無(wú)通透性的微膠囊，微膠囊可用來(lái)包囊化核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物，特別是聚合酶鏈反應(yīng)混合物，微膠囊能提供隔間進(jìn)行核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈反應(yīng)。本發(fā)明還涉及用這樣的膠囊進(jìn)行平行的聚合酶鏈反應(yīng)，篩選，構(gòu)建DNA文庫(kù)和測(cè)序。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1656234SQ03811435
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月20日
發(fā)明者陶諦德, 任能博, 麥永昌 申請(qǐng)人:創(chuàng)新生物公司