專利名稱：誘變過程中的“比例調(diào)節(jié)”的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本專利申請(qǐng)擁有60/373,686號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利的權(quán)益，60/373,656號(hào)臨時(shí)專利申請(qǐng)于2002年4月17日提交，該專利申請(qǐng)的全文在此通過引證被并入本文。
背景技術(shù)：
在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能過程中，誘發(fā)突變是一項(xiàng)強(qiáng)有力的工具。在克隆基因的核苷酸序列上可以引發(fā)突變，編碼所感興趣的蛋白質(zhì)，被修飾后的基因可產(chǎn)生蛋白質(zhì)的突變異種。通過對(duì)原型蛋白質(zhì)的特性和所產(chǎn)生的突變異種的特性進(jìn)行比較，通?？梢宰R(shí)別出氨基酸個(gè)體或氨基酸域，而這些氨基酸個(gè)體或氨基酸域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)完整性和/或蛋白質(zhì)的生化功能而言是必需的；比如對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合和/或催化活性功能而言，這些氨基酸個(gè)體或氨基酸域是必需的。然而，單一蛋白質(zhì)所生成的突變異種數(shù)量致使研究人員很難選擇出能夠提供有用信息或具有所需特性的突變異種，既便所選擇的突變完全發(fā)生在蛋白質(zhì)的特異區(qū)域，這種選擇也是很困難的，其中的特異區(qū)域被假定為重要區(qū)域(既蛋白蛋的活性點(diǎn)區(qū)域或活性點(diǎn)附近的區(qū)域)。舉例而言，替換、刪除蛋白質(zhì)中某一特定氨基酸或在蛋白質(zhì)中插入某一特定的氨基酸會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的局部或整體產(chǎn)生影響。目前仍然需要一種對(duì)蛋白質(zhì)的誘變效果進(jìn)行系統(tǒng)分析評(píng)價(jià)的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明與引入式核酸誘變的方法有關(guān)，其中的核酸對(duì)研究所感興趣的多肽進(jìn)行編碼。在這些方法中，原型多肽中的一個(gè)或多個(gè)所感興趣的氨基酸目標(biāo)區(qū)域被選定，具有代表性的目標(biāo)區(qū)域例如包括多肽的功能區(qū)，比如抗體的超變區(qū)域。對(duì)于每個(gè)目標(biāo)區(qū)域而言，研究人員要選定一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的氨基酸，這些預(yù)定的氨基酸將取代原型氨基酸而進(jìn)入到目標(biāo)區(qū)域中。一組低核苷酸混合物被合成，其中低核苷酸含有每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列；并在目標(biāo)區(qū)域的每一序列位置上或含有合成多肽原型氨基酸所需的核苷酸(原型核苷酸)，或含有合成預(yù)定氨基酸所需的核苷酸(預(yù)定核苷酸)。在合成過程中，使用到了“比例調(diào)節(jié)”手段，“比例調(diào)節(jié)”意思是指在合成過程中原型核苷酸與進(jìn)入到低核苷酸中預(yù)定核苷酸的比例大于1∶1；優(yōu)選的比例為4∶1或大于4∶1；更合適的比例為7∶1或大于7∶1，更為適合的比例甚至可為9∶1或大于9∶1。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，原核苷酸與預(yù)定核苷酸的比例通過二項(xiàng)式分布加以確定，該二項(xiàng)式分布考慮到了目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度以及核苷酸合成的成功度；其中合成產(chǎn)生的核苷酸構(gòu)成了預(yù)定氨基酸的編碼。
本發(fā)明還與含有這些低核苷酸的核酸的表達(dá)庫有關(guān)，同時(shí)本發(fā)明也與這些核酸庫表達(dá)所生成的多肽庫有關(guān)。
本發(fā)明中的方法可產(chǎn)生出突變的多肽，在該突變異種中，預(yù)定氨基酸只出現(xiàn)在每個(gè)發(fā)生突變多肽的一個(gè)或兩上位置上，而目標(biāo)區(qū)域的其余氨基酸則不發(fā)生變化或盡可能保持與原生型序列相同。采用這種方法，可以快速并系統(tǒng)地實(shí)現(xiàn)更精確、更具體的化學(xué)變化。
圖示簡(jiǎn)介

圖1是免疫球蛋白MCPC603的Fv區(qū)域示意圖，其中誘變發(fā)生在該免疫球蛋白的三個(gè)CDR區(qū)域；這三個(gè)CDR區(qū)域?yàn)橹劓湹腃DR1(使用預(yù)定氨基酸Asp)、CDR2(使用預(yù)定氨基酸His)以及CDR3(使用預(yù)定氨基酸Ser)。
圖2表明的是CDR1區(qū)域上“變性”低核苷酸的結(jié)構(gòu)。
圖3表明的是CDR2區(qū)域上“變性”低核苷酸的結(jié)構(gòu)。
圖4表明的是CDR3區(qū)域上“變性”低核苷酸的結(jié)構(gòu)。
圖5表明的是CDR1區(qū)域中引入式誘變所生成的位于目標(biāo)區(qū)域上的氨基酸序列。
圖6表明的是CDR2區(qū)域中引入式誘變所生成的位于目標(biāo)區(qū)域上的氨基酸序列。
圖7表明的是CDR3區(qū)域中引入式誘變所生成的位于目標(biāo)區(qū)域上的氨基酸序列。
圖8表明的是突變的分布情況，在引入式誘變過程中所使用的原型核酸/變異(非原型)核酸的比例為1∶1。
圖9表明的是突變的分布情況，在引入式誘變過程中所使用的原型核酸/變異(非原型)核酸的比例為4∶1。
圖10表明的是突變的分布情況，在引入式誘變過程中所使用的原型核酸/變異(非原型)核酸的比例為9∶1。
圖11表明的是引入式突變過程所制備的一組多肽中目標(biāo)區(qū)域的氨基酸序列，在引入式誘變過程中所使用的原型核酸/變異核酸比例為9∶1.
圖12表明的是二項(xiàng)式分布情況，其中的成功概率P為0.2。
圖13表明的是二項(xiàng)式分布情況，其中的成功概率P為0.1。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明與引入式誘變的方法相關(guān)，其中使用“比例調(diào)節(jié)”手段來改變多肽產(chǎn)品的濃度比值。在引入式誘變過程中，產(chǎn)生了各種多肽(突變的多肽)的編碼核酸庫，在這些多肽中，構(gòu)成目標(biāo)區(qū)域內(nèi)氨基酸的密碼子的原型核苷酸被非原型核苷酸所取代，從而生合成低核苷酸的混合物，其中的低核苷酸被用來產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的密碼子變化。核酸庫的表達(dá)生成一組多肽，其中預(yù)先選定的氨基酸被引入到多肽目標(biāo)區(qū)域的每一個(gè)位置上。為了生成所要求的多肽混合產(chǎn)物，“比例調(diào)節(jié)”手段可按特定的比例生成特定的低核苷酸混合物。
“引入式誘變過程”“引入式誘變過程”在5,830,650號(hào)美國(guó)專利及5,798,208號(hào)美國(guó)專利中有詳細(xì)的說明，這兩項(xiàng)專利文獻(xiàn)在此通過引證被并入本文。引入式誘變過程同樣適用于多種蛋白質(zhì)和多肽，其中包括酶、免疫球蛋白、荷爾蒙、細(xì)胞漿液、整合蛋白以及其他蛋白質(zhì)或多肽。為了便于說明，本文在此使用“多肽”一詞。
選定多肽的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)區(qū)域。目標(biāo)區(qū)域可以是多肽的一個(gè)或多個(gè)活性區(qū)域，比如是酶的結(jié)合區(qū)或免疫球蛋白的超變環(huán)；或者整個(gè)多肽是目標(biāo)區(qū)域。多肽中不受誘變影響的區(qū)域(既目標(biāo)區(qū)域之外的區(qū)域)在本文中被稱“恒定”區(qū)域。重要的是，多肽中幾個(gè)不同的目標(biāo)區(qū)域可以同時(shí)發(fā)生誘變。在每個(gè)目標(biāo)中可引入相同或不同的預(yù)定氨基酸。這樣可以對(duì)結(jié)構(gòu)相關(guān)區(qū)域中氨基酸的取代結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，這些結(jié)構(gòu)相關(guān)區(qū)域通過多肽的疊合形成了功能點(diǎn)，比如形成了酶的催化點(diǎn)或抗體的結(jié)合點(diǎn)。
在引入式誘變過程中，一組多肽被生成，其中一個(gè)單一的氨基酸在多肽目標(biāo)區(qū)域的每個(gè)位置上至少被引入一次。誘變所產(chǎn)生的多肽(在本文中被稱為“突變多肽”)與原來的多肽不同，不同之處在于突變多肽中有單獨(dú)一個(gè)預(yù)定氨基酸插入到了多肽的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)區(qū)域中，這一預(yù)定的氨基酸取代了位于原來多肽中同一位置的原型氨基酸。這組突變的多肽含有每個(gè)目標(biāo)區(qū)域發(fā)生變異而生產(chǎn)的多肽，因此，對(duì)于目標(biāo)區(qū)域的每個(gè)位置(既結(jié)合區(qū)域或CDR)而言，突變多肽混合物中的多肽既含有原來多肽中的氨基酸，也含有預(yù)定的氨基酸，并且，全部突變多肽的混合物含有所有可能的變異種類。突變多肽混合物還可含有既不含預(yù)定氨基酸，也不含原來氨基酸的多肽，正如下面將要討論的，如果對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為了自身形成而需要改變一個(gè)以上的核苷酸時(shí)，某些多肽可含有某些由某一密碼子所編碼的氨基酸，該密碼子在形成過程中所發(fā)生的變化少于生成預(yù)定氨基酸所需的所有變化。正如下面將要說明的，每種多肽在混合物中所占的比例取決于合成過程中可用核苷酸的濃度之比。
在引入式誘變中，預(yù)定的氨基酸被選擇用于目標(biāo)區(qū)域。如果多肽含有一個(gè)以上的目標(biāo)區(qū)域，則每個(gè)目標(biāo)區(qū)域可使用相同的預(yù)定氨基酸，也可以使用不同的預(yù)定氨基酸。預(yù)定的氨基酸可以是天然存在的氨基酸。20種天然存在的氨基酸只是在側(cè)鏈上有所差別。各個(gè)側(cè)鏈都氨基酸具有獨(dú)特的性質(zhì)(見G、E、Schulz和R、M、Schirner1998年著的《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理》)。典型的極性側(cè)鏈和中性側(cè)鏈?zhǔn)荂ys、Ser、Thr、Asn、Gln以及Tyr這些氨基酸的側(cè)鏈。Gly氨基酸被認(rèn)為是這組氨基酸的邊緣成員。Ser和Thr氨基酸在氫鍵的形成中發(fā)揮著重要的作用。Thr在β碳原子上還有非對(duì)稱性，因此只有一個(gè)空間異構(gòu)體被使用。酰胺Gln和Asn也可形成氫鍵，氨基基團(tuán)作用為氫供體，羰基基團(tuán)作為氫受體。Gln比Asn多一個(gè)CH2基團(tuán)，這使這一極性基團(tuán)更加活躍，從而降低了該基團(tuán)與主鏈的相互作用。Tyr具有一個(gè)極性很高的羥基基團(tuán)(酚基OH)，這一羥基基團(tuán)在高PH值下可以離解。Tyr的行為多少像一個(gè)充有電荷的側(cè)鏈，它的氫鍵是相當(dāng)強(qiáng)的。
在蛋白質(zhì)分子的表面以及內(nèi)部可以發(fā)現(xiàn)中極性酸。作為內(nèi)部的殘基，這些中極性酸通常在相互間形成氫鍵或同多肽的主鏈形成氫鍵。Cyr可形成二硫化物橋鍵。組氨酸帶有PK值為6.0的雜環(huán)芳烴側(cè)鏈。在生理PH值范圍內(nèi)，基咪唑環(huán)在從溶液中取得一個(gè)氫離子后既可以發(fā)生變化，也可以保持不變。由于這兩種狀態(tài)都比較容易得到，所以組氨酸在催化化學(xué)反應(yīng)方面非常有用，許多酶的活性中心中含有組氨酸。
Asp和Glu在生理PH值下帶有負(fù)電。由于這兩種氨基酸的側(cè)鏈短，所以Asp的羰基基團(tuán)對(duì)主鏈?zhǔn)窍喈?dāng)剛性的，邊也是在許多催化點(diǎn)上羰基基團(tuán)是由Asp而不是由Glu提供的原因。在蛋白質(zhì)的表面通常會(huì)發(fā)現(xiàn)帶電的酸分子。
賴氨酸和精氨酸通常位于蛋白質(zhì)的表面。這兩種氨基酸具有長(zhǎng)而柔性的側(cè)鏈。由于這兩種氨基酸在其周圍的溶液中會(huì)產(chǎn)生擺動(dòng)，所以這兩種氨基酸提高了蛋白質(zhì)球體的溶解度。在幾種情況下，賴氨酸和精氨酸參與內(nèi)部鹽橋的形成過程，或者有助于催化作用。由于這兩種氨基酸位于蛋白質(zhì)的表面，賴氨酸通常是酶攻擊的殘基；酶或者改變賴氨酸的側(cè)鏈，或者截去位于賴氨酸殘基羰基端的肽鏈。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)定的氨基酸是以下氨基酸之一色氨酸、蘇氨酸、Asn、甘氨酸、酪氨酸、胱胺酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸。然而，預(yù)定氨基酸也可從20種天然存在的氨基酸中選出。
在引入式誘變過程中，會(huì)生成低核苷酸(如cDNA)的混合物。低核苷酸對(duì)多肽的整體或部分(目標(biāo)區(qū)域)進(jìn)行編碼。然后，使用該低核苷酸可以制備突變的多肽。在本發(fā)明某一實(shí)施方案中，對(duì)非誘變目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列與對(duì)發(fā)生引入式誘變的多肽區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列結(jié)合在一起可以生成對(duì)突變多肽進(jìn)行編碼的核酸。舉例而言，在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，對(duì)恒定區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列與對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列結(jié)合在一起可以制備出對(duì)突變多肽進(jìn)行編碼的核酸。另外，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列(即對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的核苷酸插入其中的低核苷酸)可單獨(dú)插入到對(duì)原有多肽進(jìn)行編碼的核酸中，這些插入的核苷酸序列取代了對(duì)目標(biāo)區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行編碼的核酸序列。如果需要，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編碼的核苷酸序列可含有限制性酶的側(cè)翼識(shí)別部位(見4,888,286號(hào)美國(guó)專利)，或者可以采用天然存在的限制性酶識(shí)別部位，然后通過克隆低核苷酸將它們引入到使用限制性酶部位的相應(yīng)位置上。
舉例而言，可以制備出低核苷酸的混合物，其中每種低核苷酸或者含有對(duì)原肽原有目標(biāo)區(qū)域(或原肽目標(biāo)區(qū)域某一部分)進(jìn)行編碼的核苷酸，或者含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸形成密碼子，且該密碼子對(duì)取代目標(biāo)區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)天然氨基酸的預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼。在單一合成過程中，通過在低核苷酸內(nèi)每一位置上或引入合成原型肽的原有氨基酸所需的核苷酸(在本文中被稱為“原型核苷酸”)，或引入預(yù)定氨基酸的密碼子所需的適合單一核苷酸(預(yù)定核苷酸)可生產(chǎn)出低核苷酸的混合物。低核苷酸混合物的合成可在自動(dòng)化的DNA合成器中進(jìn)行，為了使所產(chǎn)生低核苷酸混合物不僅含有對(duì)原多肽中目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編碼的低核苷酸，而且含有對(duì)變異多肽進(jìn)行編碼的低核苷酸物，DNA合成器或者產(chǎn)生原型核苷酸，或者產(chǎn)生預(yù)定的核苷酸，或者產(chǎn)生這兩種核苷酸的混合物。
舉例而言，可使用總共10個(gè)試劑容器來合成引入式誘變過程的任何一種低核苷酸混合物。其中4個(gè)容器含有單個(gè)的堿基，其余6個(gè)容器含有4種堿基中所有可能的兩種堿基的混合物。例如，DNA合成可設(shè)計(jì)成含有下列10個(gè)反應(yīng)室表1自動(dòng)化DNA合成的合成子
在這種情況下，任何一個(gè)序列位置上的任何一種核苷酸都可以被兩種核苷酸中的一種所取代。另外，如果有可能在低核苷酸合成器的管線中將各堿基進(jìn)行混合，則可使合成器從兩個(gè)或多個(gè)純堿基儲(chǔ)罐中抽取堿基，從而生成所需比例的核苷酸。
引入式誘變過程的“比例調(diào)節(jié)”在前面所述的引入式誘變過程方法中(5,830,650及5,798,208號(hào)美國(guó)專利)，在反應(yīng)過程中所使用到的兩種核苷酸(既原型核苷酸和非原型(預(yù)定的)核苷酸)的濃度近似相等，這樣這兩種核苷酸進(jìn)入到目標(biāo)位置的機(jī)會(huì)是相等的。假定原型核苷酸與非原型核苷酸的比例為50∶50，如果將原型密碼子變異到對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子只需改變一種核苷酸堿基，則變異所生成的核苷酸序列中有50％含有對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子，有50％含有對(duì)原型氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子。同樣，如果生成對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子這一過程需要改變2種核苷酸堿基，則所生成的核苷酸序列中有25％含有對(duì)原型核苷酸進(jìn)行編碼的密碼子，另有25％含有對(duì)預(yù)定核苷酸進(jìn)行編碼的密碼子，其余50％(2×25％)含有通過組合核苷酸方式對(duì)其他氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子。
在本發(fā)明中，合成過程所用的兩種核苷酸的濃度比例可被改變，這樣可以提高一種核苷酸或另一種核苷酸進(jìn)入到低核苷酸中的機(jī)率。這一濃度比大于1∶1。具有代表性有濃度比包括大于1∶1的比例；等于或大于4∶1的比例；等于或大于7∶1的比例；等于或大于9∶1的比例?！翱捎玫摹焙塑账崾侵冈诤铣蛇^程中存在并在低核苷酸合成時(shí)能結(jié)合到低核苷酸中的核苷酸；舉例而言，在低核苷酸合成過程中，從自動(dòng)化低核苷酸合成器中抽取的核苷酸就是“可用的”核苷酸?？捎玫脑秃塑账崤c可用的變異核苷酸之比被確定，從而使核苷酸50％以上及100％以下的組成部分為原型核苷酸。在優(yōu)選情況下，所確定的比例可使原型核苷酸的百分率等于或大于60％，更優(yōu)選的情況是原型核苷酸的百分率等于或大天70％，甚至等于或大于80％。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所確定的比例可使原型核苷酸的百分率等于或大于90％；或者等于或大于95％；或者等于99％。舉例而言，原型核苷酸與變異核苷酸比例為9∶1時(shí)(即90％為原型核苷酸)，所生成的低核苷酸庫中每個(gè)目標(biāo)區(qū)域基本上沒有、或者只有一個(gè)或兩個(gè)目標(biāo)氨基酸被取代。在某一實(shí)施方案中，這一比例是采用二項(xiàng)式分布加以確定的，這其中考慮到了目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度以及核苷酸結(jié)合到合成產(chǎn)物中所需的成功度；所生成的核苷酸對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼。有關(guān)比例的確定，下面將結(jié)合“比例調(diào)節(jié)”的數(shù)學(xué)分析進(jìn)行說明。
比例調(diào)節(jié)的數(shù)學(xué)分析對(duì)于采用引入式誘變過程進(jìn)行變異的且長(zhǎng)度為N的原型多肽而言，從隨機(jī)的觀點(diǎn)看，多肽的突變(將整個(gè)多肽視為目標(biāo)區(qū)域)可被看作為一組獨(dú)立的誘變事件，每個(gè)氨基酸位置上的變異都是一個(gè)事件?，F(xiàn)在假定每個(gè)位置有兩種可能的結(jié)果“成功”和“不成功”；“成功”表示預(yù)定的氨基酸被引入到了一個(gè)位置上；“不成功”表示原型氨基酸仍然保持在該位置；或另一種(不希望的)氨基酸被引入到了該位置上，這另一種氨基酸既不是預(yù)定的氨基酸，也不是原型氨基酸。舉例而言，當(dāng)密碼子中有2個(gè)或3個(gè)堿基發(fā)生變異時(shí)，“不希望的”氨基酸便會(huì)出現(xiàn)。成功結(jié)果的概率用P(j)表示，其中的j代表序列中的位置(1≤j≤N)。同一位置產(chǎn)生不成功結(jié)果的概率為1-P(j)。在這里使用圓括號(hào)(替代更常用的下標(biāo))是為了強(qiáng)調(diào)位置j這一概率從變量。實(shí)際上，P(j)是位置j的函數(shù)，是得到預(yù)定氨基酸所需堿基混合物的函數(shù)(1、2或3種核苷酸基本組分被取代)。
X是任意的隨機(jī)變量，它代表著長(zhǎng)度為N的序列中氨基酸變異的總數(shù)，X的采樣空間為Ω＝{0、1、2、3......N}。因此，下面的集合可被定義
Sk＝{j∈(1、2、3......N)V成功的位置}S′N-K＝{j∈(1、2、3......N)V不成功的位置}SK∩S′N-K＝請(qǐng)注意子集的索引代表每個(gè)集合的基數(shù)。在最一般情況下，描述這種分布情況的方程為PKN=ΣKi=1(N)(ΠjϵiP(j))(ΠjϵsN-K′(1-P(j))),1≤K≤N]]>這一方程代表N個(gè)獨(dú)立事件中有K個(gè)成功事件(既預(yù)定氨基酸被引入到了目標(biāo)位置上)的概率。
每次實(shí)驗(yàn)中的變種數(shù)量也應(yīng)加以考慮。標(biāo)準(zhǔn)的引入式誘變過程(即不進(jìn)行比例調(diào)節(jié))是在基本組分混合比固定為50∶50下進(jìn)行的。在這種情況下，根據(jù)位置j上預(yù)定氨基酸與原型氨基酸的距離d可假定3個(gè)P(j)值；其中的距離d是將原型密碼子變換成預(yù)定密碼子(對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼)所需的堿基變異數(shù)量。
距離 P(j)引入式誘變后變種/位置的數(shù)量d＝1 P(j)＝0.5 1引入+1目標(biāo)+0其他＝2總數(shù)d＝2 P(j)＝0.25 1引入+1目標(biāo)+2其他＝4總數(shù)d＝3 P(j)＝0.125 1引入+1目標(biāo)+6其他＝8總數(shù)在這一假設(shè)下，所感興趣的單一多肽通過引入式誘變(沒有進(jìn)行比例調(diào)節(jié))產(chǎn)生含有幾個(gè)變異多肽(也被稱為變種)的庫，其中n＝2M，M是預(yù)定核苷酸堿基的總數(shù)。產(chǎn)生每一變種的概率為1/n，這一概率為常數(shù)，與位置上氨基酸變異的類型無關(guān)。這是因?yàn)橐氲矫總€(gè)密碼子中的預(yù)定核苷酸不受前面所示距離的影響，只以恒定的概率(分別為50％、25％、12.5％)生成三組不同的氨基酸，三組氨基酸含有的氨基酸種類分別為2、4、8種。由于這一原因，在引入式誘變所產(chǎn)生的低核苷酸庫中找到所有N個(gè)位置上氨基酸都發(fā)生變異的變異多肽(變種)的概率與在同一庫中找到只有一個(gè)氨基酸發(fā)生變異的變異多肽的概率是完全一樣的。出于幾種原因的考慮，人們不希望出現(xiàn)這種局面。
首先，在自然界找到帶有目標(biāo)序列(既使較短)的多肽是非常不容易的(如果不是不可能)，何況還要求其在演變之后，其所取代的殘基大多數(shù)或全部被同一(預(yù)定)氨基酸取代。其次，變種的數(shù)量隨ZM成指數(shù)增長(zhǎng)，其中M是變異基本組分(預(yù)定核苷酸)的總數(shù)，一般而言，M隨序列的長(zhǎng)度而增加。此外，如果變異過程的目標(biāo)是在同一時(shí)間使多肽的數(shù)個(gè)目標(biāo)區(qū)域發(fā)生變異(例如使某一抗體的所有6個(gè)CDR同時(shí)發(fā)生變異)，則很容易得到一個(gè)具有很多種變種的庫。在這些情況下，通過限制生成某些所需的變種有助于處理數(shù)量較少的變種。
調(diào)節(jié)比例可生成具有較少變異氨基酸數(shù)量的低核苷酸庫(即變異的多肽中只有較少數(shù)量的預(yù)定氨基酸被結(jié)合到了多肽中)。通過采用不同的堿基混合比，并對(duì)需要進(jìn)行取代的序列保持恒定的堿基比可以實(shí)現(xiàn)核苷酸的比例調(diào)節(jié)。這意味著，為了與對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的預(yù)定核苷酸相結(jié)合，密碼子每次需要一種由兩種堿基組成的混合物，所使用的堿基混合比例是有利于原型核苷酸存在(通過在原型多肽中插入原型核苷酸)的比例，而不是有利于預(yù)定氨基酸存在(通過在原型多肽中插入對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼的預(yù)定核苷酸)的比例。
采用這一方法，在位置j上含有預(yù)定氨基酸的概率取決于原型氨基酸與目標(biāo)氨基酸之間的距離。因此，三種不同的情況被加以考慮(d＝1、2、3)，調(diào)節(jié)距離值從而濾掉變種數(shù)量很多的序列。舉例而言，下列信息是在原型核苷酸與預(yù)定核苷酸之比為9∶1的條件下獲得的距離P(j) 引入式突變過程后變種/位置的數(shù)量d＝1P(j)＝0.1 1WT(90％)+1目標(biāo)(10％)+0其他＝2總數(shù)d＝2P(j)＝0.01 1WT(81％)+1目標(biāo)(1％)+2其他＝4總數(shù)d＝3P(j)＝0.0011WT(72.9％)+1目標(biāo)(0.1％)+6其他＝8總數(shù)在這一情況下，每種被取代的氨基酸仍有存在的概率，這一概率取決于將其引入到序列中所需的堿基變異數(shù)量。然而，在進(jìn)行比例調(diào)節(jié)的情況下，低核苷酸庫中的變種并不具有相同的生成概率。
在誘變過程中使用恒定的堿基混合比例可使原型堿基和預(yù)定的堿基保持恒定的存在概率。如果每種氨基酸可使每一變種的出現(xiàn)概率只取決于序列中的取代數(shù)量，則每種取代發(fā)生的概率可固定在所需要的程度，并且可使用不同的堿基混合比例來進(jìn)行誘變過程，混合比取決于預(yù)定氨基酸與原型氨基酸之間的距離，在這種方式下，每一變種的出現(xiàn)將只取決于取代發(fā)生的數(shù)量。
舉例而言，假設(shè)P(j)＝P＝常數(shù)，代表上述關(guān)系的方程采用被稱為標(biāo)準(zhǔn)二項(xiàng)式分布的形式，其特點(diǎn)是目標(biāo)序列的長(zhǎng)度以及所需的成功概率。標(biāo)準(zhǔn)的二項(xiàng)式分布方程為P(X＝K)＝(KN)PK(1-P)N-K1≤K≤N其中參數(shù)n和p分別是目標(biāo)序列的長(zhǎng)度和每個(gè)單獨(dú)事件所需的成功概率。將k值從零變到N，即可得到典型的分布結(jié)果，其中平均值和方差為X＝npEx2＝np(1-p)圖12(p＝0.2)及圖13(p＝0.1)表明了這些分布。一旦參數(shù)值被固定下來，則可以改變基礎(chǔ)組分的比例來達(dá)到所需要的p值。根據(jù)原型氨基酸與預(yù)定氨基酸之間的距離可采用不同的堿基混合比例。
例如p＝0.25n＝10x＝2.5 方差(x)＝1.87
p＝0.2 n＝10x＝2.0 方差(x)＝1.6
p＝0.3 n＝10x＝3.0 方差(x)＝2.1
因此，使用這些公式可以確定出引入式誘變過程中所需的變異多肽水平，在引入式誘變過程中，原型核苷酸與變異核苷酸的比例可據(jù)此進(jìn)行調(diào)節(jié)。
制備核酸庫核酸庫含有對(duì)原型多肽和變異多肽進(jìn)行編碼的核酸，正如本文前面所述的，核酸庫可從低核苷酸制備；多肽庫含有原型多肽和變異多肽，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可從核酸制備出多肽庫。舉例而言，對(duì)變異免疫球蛋白進(jìn)行編碼的核酸可引入到宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(見Huse W.D.等人在《科學(xué)》上的文章，2461275(1989)；見Viera J.等人在《Meth.Enzymol.》上的文章，1533(1987))。核酸例如可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)(見Pluckthun A.及Skerra A在《生物技術(shù)》上的文章，925-278(1991))。核酸可以在培養(yǎng)基的分泌液和/或細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)(見BetterM.及Horwitz A.在《Meth.Enzymol.》上的文章，178476(1989))；或者核酸可在諸如酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如在骨髓瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解，可以使用多種表達(dá)方式生成本文所述的庫。通過將核酸與其他基因單元相融合，例如與助催化體、終結(jié)體以及其他適合的序列相融合，按照pluckthun等人的描述可在試管中完成核酸的表達(dá)(核糖體顯示)(見Pluckthun A.和Skerra A.在《Meth.Enzymol.》上的文章，178476-515(1989))，其中的助催化體、終結(jié)體以及其他適合的序列會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)錄過程。同樣，噬菌體表達(dá)、細(xì)菌表達(dá)、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)、真菌(酵母)表達(dá)、植物細(xì)胞表達(dá)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)可按所述的方式得到(見R.konterman、S.Dubel的《抗體工程》)。scFV庫還可以與其他基因相融合，從而產(chǎn)生具有結(jié)合部分以及其他功能的嵌合蛋白質(zhì)，例如具有催化功能、胞毒等功能的蛋白質(zhì)。(見R.konterman和S.Dubel的《抗體工程》)。
本發(fā)明中的方法還可生成多肽變種，在這些變種中，預(yù)定氨基酸只限于引入到每個(gè)變異多肽的一處或兩處位置，目標(biāo)區(qū)域中的其他氨基酸則保持不變，或者盡可能接近于原型序列。這樣，可產(chǎn)生更精確、更具體的化學(xué)變化。舉例而言，為了改善兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合情況，或改善抗體與抗原之間的結(jié)合情況，可逐個(gè)位置地對(duì)結(jié)合區(qū)(作為“目標(biāo)”區(qū)域)內(nèi)其他疏水側(cè)鏈存在的系統(tǒng)效果進(jìn)行研究。同樣，通過將具有特定化學(xué)特性的氨基酸選定為預(yù)定的氨基酸可以在整個(gè)結(jié)合過程中解決電荷(+電荷或-電荷)效應(yīng)、親脂性、親水性等問題。
免疫球蛋白在某一特定實(shí)施方案中，所感興趣的多肽是一種免疫球蛋白。正如本文中所用的，“免疫球蛋白”一詞可指整個(gè)免疫球蛋白，也可指免疫球蛋白中含有易變區(qū)域的部分。作為感興趣多肽的免疫球蛋白可以是產(chǎn)生抗體的任何種類免疫球蛋白。在優(yōu)選情況下，免疫球蛋白是哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白，尤其是人類的免疫球蛋白。所感興趣的免疫球蛋白或者是一種嵌合式抗體或一種“共有的”或正則的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是由氨基酸抗體數(shù)據(jù)庫所生成的結(jié)構(gòu)(見Kabat等人1991年出版的《免疫蛋白的結(jié)構(gòu)》，美國(guó)健康及人類服務(wù)署出版，第5版)。所感興趣的免疫球蛋白可以是原型免疫球蛋白(即從生命組織分離出來的免疫球蛋白，或可以從生命組織中分離出來的免疫球蛋白，例如在哺乳動(dòng)物；尤其是人類的相應(yīng)生理樣品(比如血液、血清等)中可以發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白)。另外，所感興趣的免疫球蛋白也可是改性的免疫球蛋白(既在原型免疫球蛋白中一個(gè)或多個(gè)易變區(qū)域和/或穩(wěn)定區(qū)域發(fā)生變化后所形成的免疫球蛋白)。
在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，所感興趣的免疫球蛋白是具有催化作用的抗體。按本文所述方法在免疫球蛋白易變區(qū)域的結(jié)合點(diǎn)上引入適當(dāng)?shù)陌被峥墒姑庖咔虻鞍拙哂写呋δ?，或者可使已有的催化功能得到加?qiáng)。例如，模仿絲氨酸蛋白酶的催化三元素組可在抗體易變區(qū)域的超變段上形成，并可對(duì)解蛋白活度進(jìn)行篩選。具有代表性的催化抗體包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)以及連接酶；這些種類范疇的酶包括蛋白酶、糖酶、脂肪酶、雙加氧酶以及其他的酶。這些酶及其他的酶在健康護(hù)理、化妝品、食品、釀造、清潔劑、環(huán)境保護(hù)(如水處理)、農(nóng)業(yè)、鞣革、紡織品以及其他化學(xué)過程中可被用來進(jìn)行酶催化轉(zhuǎn)化過程，比如用于醫(yī)療診斷、治療過程、脂肪轉(zhuǎn)化、碳水化合物轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、有機(jī)污物降解以及化學(xué)品的合成過程。舉例而言，可制造出具有血纖維蛋白溶解活性或具有抗病毒結(jié)構(gòu)活性的蛋白質(zhì)酶，比如制造出病毒包衣蛋白；這些酶具有治療效果。這些蛋白酶是有效的抗凝血?jiǎng)┗蛘呤菍?duì)抗諸如艾滋病病毒、鼻病毒、流感病毒或肝炎病毒的抗病毒劑。另外，在另一實(shí)例中，氧酶(比加氧酶)這類在對(duì)芳香環(huán)及其他雙鍵結(jié)構(gòu)進(jìn)行氧化時(shí)需要輔助因素幫助的酶還可應(yīng)用于工業(yè)過程中，比如用于生物制漿過程、生物材料轉(zhuǎn)化成燃料或其轉(zhuǎn)化成他化學(xué)品的過程、廢水污染物的轉(zhuǎn)化過程、煤炭生化加工過程以及有機(jī)物質(zhì)的去毒過程。
本發(fā)明中的方法對(duì)于制備免疫球蛋白的通用庫特別有用。有關(guān)免疫球蛋白通用庫的制備在60/373,558號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中有詳細(xì)的說明，該專利申請(qǐng)的標(biāo)題為“免疫球蛋白的通用庫”，該專利申請(qǐng)與本專利申請(qǐng)是同時(shí)提交的，該專利申請(qǐng)的全文在此通過引證被并入本文。
核酸庫的應(yīng)用正如本文所述的，核酸庫對(duì)變異的多肽進(jìn)行編碼或含有變異的多肽，其中變異的多肽是以某種方式生成的，基于這種方式可對(duì)原型多肽的結(jié)合區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)及精確的分析，尤其可對(duì)特定的預(yù)定氨基酸對(duì)該結(jié)合區(qū)的影響進(jìn)行系統(tǒng)和精確的分析。這些核酸庫避免了與隨機(jī)誘變過程中突變性質(zhì)的控制或預(yù)測(cè)相關(guān)的問題，這些核酸庫可產(chǎn)生有關(guān)特定突變的具體信息，這些特定突變可改變多肽與其他媒劑(如配體、受體、抗原)之間的相互作用，其中包括多肽不同結(jié)合區(qū)域中氨基酸的多個(gè)相互作用。
使用適當(dāng)?shù)姆椒稍谶@些核酸庫中篩選特定的多肽，比如篩選具有專門性質(zhì)的免疫球蛋白。舉例而言，通過對(duì)基質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治隹纱_定多肽的催化活性，通過標(biāo)準(zhǔn)免疫分析和/或親和力氣相色譜可評(píng)估多肽的結(jié)合活性。這些活性的分析可通過具備所需生長(zhǎng)活性的細(xì)胞進(jìn)行。比如在篩選具有降解有毒化合物能力的免疫球蛋白時(shí)，在培養(yǎng)基中引入致死量的有毒化合物可以只使那些具備降解這些有毒化合物能力的細(xì)胞生長(zhǎng)(見Wasserfallen A.和Rekik M.《在物技術(shù)》所發(fā)表的文章，9296-298(1991))。還可針對(duì)其他活性對(duì)這些核酸庫進(jìn)行篩選，比如針對(duì)瞄準(zhǔn)或破壞各種病原的能力進(jìn)行篩選。還可通過將感興趣的病原暴露在抗體中來進(jìn)行這些活性的分析，表現(xiàn)出所需特性(如殺滅病原體)的抗體可被篩選出來。
本文下面提供的實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，這些實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例中所引用的所有文獻(xiàn)內(nèi)容在此通過引證被并入本文。
實(shí)施例A.材料和方法為了評(píng)估比例調(diào)節(jié)對(duì)引入式誘變過程的影響，引入式誘變過程是在單克隆抗體MCPC603的三個(gè)超變區(qū)域的互補(bǔ)確定區(qū)(CDRs)上進(jìn)行的。MCPC603是一種能與磷酸膽堿相結(jié)合的單克隆抗體。這種免疫球蛋白因?yàn)榫哂辛己玫慕Y(jié)構(gòu)特性而被認(rèn)為是研究結(jié)合性能和催化性能的一種良好模型?？贵wMCPC603的CDRs已經(jīng)得到了識(shí)別。在重鏈中，CDR1包括氨基酸31-35，CDR2包括氨基酸50-69，CDR3包括氨基酸101-111。在輕鏈中，CDR1包括氨基酸24-40，CDR2包括氨基酸55-62，CDR3包括氨基酸95-103。
重鏈的CDR1、CDR2和CDR3是所選定的區(qū)域。已公布的單克隆抗體MCPC603重鏈和輕鏈氨基酸序列可以轉(zhuǎn)化成DNA序列(見Rudikoff S.和Potter M.在《生物化學(xué)》上的文章，134033(1974))；另外，MCPC603的原型DNA序列也可以被使用(見Pluckthun A.等人在Cold Spring港演討會(huì)論文集《定量生物學(xué)》第LII卷中的文章，P105-112，(1987))。為了便于引入變異的低核苷酸，序列中可包括限制點(diǎn)，或者在基因集中引入變異的序列。
引入式誘變過程所選擇的預(yù)定氨酸是絲氨酸催化三元組的三個(gè)殘基Asp、His和Ser。Asp被選來用于重鏈的CDR1、His用于重鏈的CDR2，Ser用于重鏈的CDR3。
圖1表明了MCPC603中CDRs引入式誘變過程所用基因的結(jié)構(gòu)；圖中表明了要發(fā)生突變的位置或“窗口”。應(yīng)該理解的是，為了便于插入到目標(biāo)結(jié)構(gòu)中去，合成所生成的低核苷酸可以大于圖1中所示的窗口。這了使用Asp(圖3所示)取代每個(gè)原型氨基酸，研究人員設(shè)計(jì)了與重鏈CDR1相對(duì)應(yīng)的低核苷酸混合物。兩個(gè)密碼子表明了Asp(GAC和GAT)。CDR1的第一個(gè)密碼子不需要任何取代。為了轉(zhuǎn)化成Asp的密碼子，第二個(gè)密碼子(TTC、PHE)需要在第一位置(T-G)和第二位置(T-A)發(fā)生取代。第三個(gè)密碼子(TAC、TYR)只需在第一位置(T-G)發(fā)生取代。第四個(gè)密碼子需要三個(gè)取代，第一個(gè)取代發(fā)生在A-G，第二個(gè)取代發(fā)生在T-A，第三個(gè)取代發(fā)生在G-T。第五個(gè)密碼子(GAG、GUL)只需在第三位置(G-T)發(fā)生一次取代。圖2中表明了所生成的低核苷酸混合物。
從基因編碼可推斷出取代每個(gè)位置上原有氨基酸的所有氨基酸的結(jié)構(gòu)。對(duì)該實(shí)施例而言，第一種氨基酸永遠(yuǎn)是Asp(100％)，第二種氨基酸將是Phe(25％)、Asp(25％)、Tyr(25％)或Val(25％)；第三種氨基酸是Tyr(50％)或Asp(50％)；第四種氨基酸是Met(12.5％)、Asp(12.5％)、Val(25％)、Glu(12.5％)、Asn(12.5％)Ile(12.5％)、Lys(12.5％)；第五種氨基酸或者是Glu(50％)，或者是Asp(50％)?？偣部缮蓪?duì)112種不同蛋白質(zhì)序列進(jìn)行編碼的128種低核苷酸。在所生成的112種不同氨基酸序列中，包括原型序列(在位置31上帶有Asp殘基)以及與原型序列不同的序列，不同之處在于，在所有可能的替換中，后一種序列在位置32-35上含有1個(gè)到4個(gè)Asp殘基。此外，某些發(fā)生Asp取代或未發(fā)生Asp取代的序列在位置32或位置34或同時(shí)在這兩個(gè)位置上含有既不是原型也不是Asp的氨基酸。這些氨基酸通過核苷酸的變異而被引入，這些氨基酸對(duì)原型氨基酸和預(yù)定的氨基酸進(jìn)行編碼。舉例而言，在圖2中，在位置32上，除原型苯丙氨酸殘基以及預(yù)選的Asp殘基外，還生成了酪氨酸和纈氨酸。
MCPC603重鏈區(qū)的CDR2含有圖3所示的14種氨基酸(55-68)。這一低核苷酸混合物中原型序列的每種氨基酸都將被組氨酸所取代。兩個(gè)密碼子(CAT和CAC)指明了組氨酸的結(jié)構(gòu)。在整個(gè)原型DNA序列中所需的取代總量為25。因此，所生成的核苷酸混合物含有的低核苷酸可指明3.3×107種不同肽序列的結(jié)構(gòu)(見圖3)。
如圖4所示，單克隆抗體MCPC603中VH區(qū)域的CDR3由11種氨基酸組成。在所生成的低核苷酸混合物中，正如前面針對(duì)CDR1所述的，原型序列中的每一個(gè)非絲氨酸氨基酸都被絲氨酸所取代。6個(gè)基碼(TCX、AGC、AGT)指明了絲氨酸的結(jié)構(gòu)。整個(gè)原型序列所需的取代總數(shù)為12。因此，所產(chǎn)生的低核苷酸混合物含有4096種不同的低核苷酸。在這一情況中，這些低核苷酸將對(duì)4096種蛋白質(zhì)序列進(jìn)行編碼。在這些序列中，某些序列在任何其他位置(101-104、106-111)上含有一個(gè)絲氨酸殘基(在絲氨酸105之外)，以及在任何組合中帶有一個(gè)以上絲氨酸的變體(見圖4)。
采用引入式誘變過程可生成一個(gè)Fv序列庫，該庫中含有幾種不同的蛋白質(zhì)序列，其中包括原型序列和變異序列。這些序列的主要部分將對(duì)氨基酸三元組His、Ser、Asp進(jìn)行編碼，該氨基酸三元組是目標(biāo)超變區(qū)域內(nèi)所需位置上絲氨酸蛋白酶的典型結(jié)構(gòu)。引入式誘變過程是在自動(dòng)化DNA合成器中通過突變低核苷酸混合物的合成而實(shí)現(xiàn)的；其中的DNA合成器既可以將一種核苷酸輸送到反應(yīng)室中，也可以將比例相同的兩種核苷酸的混合物輸送到反應(yīng)室中，這兩種核苷酸在輸送到反應(yīng)室之前已經(jīng)混合完畢。
合成所生成的每種低核苷酸混合物被結(jié)合到MCPC603各個(gè)易變區(qū)域中的基因中。這些低核苷酸通過酶催化技術(shù)轉(zhuǎn)化成了雙股鏈結(jié)構(gòu)，并隨后與含基因的限制性質(zhì)粒形成配位，其中的基因?qū)σl(fā)生突變的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。限制點(diǎn)即可以是自然存在的也可以是人為控制的限制點(diǎn)。
通過前面所述的這些及其他適用過程所生成的MCPC603變異基因在簡(jiǎn)便的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)；Pluckthun和Skerra對(duì)這一表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行過說明(見Pluckthun A.和Skerra A.在《Meth.Enzymol.》上發(fā)表的文章，178476-515(1989)；見Skerra.A.等人在《生物技術(shù)》上發(fā)表的文章，9273-278(1991))。
使用預(yù)測(cè)變種分布的計(jì)算機(jī)程序來評(píng)估“比例調(diào)節(jié)”對(duì)原型堿基與變異堿基之間比例的影響以及對(duì)所生成的氨基酸的影響。該程序被用來評(píng)價(jià)“比例調(diào)節(jié)”對(duì)VH-CDR2(Asp)突變的影響。圖8表明了原型/變異比為1∶1下所得到的結(jié)構(gòu)；圖9表明了該比例為4∶1時(shí)所得到的結(jié)果；圖10表明了該比例為9∶1時(shí)所得到的結(jié)果?？梢钥闯?，分布情況會(huì)隨比例的改變出現(xiàn)很大的變化。
上面所述的方法還被用來生成抗體MOPC603的一組變種，其中所使用的原型/變異比例為9∶1。在變異過程中，有20種新的菌落形成，圖11表明了排序數(shù)據(jù)。這些結(jié)果證明，該庫主要含有目標(biāo)區(qū)域中未發(fā)生氨基酸取代；或目標(biāo)區(qū)域中只有一個(gè)或二個(gè)目標(biāo)氨基酸被取代后所產(chǎn)生的變種。
雖然本發(fā)明是結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行具體說明和描述的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不脫離本文所附權(quán)利要求所限的本發(fā)明范圍及原理的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的形式及細(xì)節(jié)進(jìn)行各種各樣的修改。
權(quán)利要求
1.一種引入式核酸誘變的方法，其中的核酸編碼感興趣的多肽，該方法包括a)在被這種核酸所編碼的多肽中選定一個(gè)或多個(gè)原型氨基酸目標(biāo)區(qū)域；b)為每個(gè)目標(biāo)區(qū)域選擇一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的氨基酸，這些預(yù)定的氨基酸將取代原型氨基酸而結(jié)合到目標(biāo)區(qū)域中；c)合成低核苷酸混合物，其中低核苷酸含有每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列，其中的每種低核苷酸在目標(biāo)區(qū)域的每個(gè)序列位置上或含有合成多肽中原型氨基酸所需的原型核苷酸，或含有合成預(yù)定氨基酸所需的預(yù)定核苷酸；在合成過程中，可用的原型核苷酸與可用的預(yù)定核苷酸之比大于1∶1。
2.權(quán)利要求1中的方法，還包括生成核酸表達(dá)庫，該核酸表達(dá)庫含有所述的低核苷酸。
3.如權(quán)利要求1中的方法，其中的比例等于或大于4∶1。
4.如權(quán)利要求1中的方法，其中的比例等于或大于7∶1。
5.如權(quán)利要求1中的方法，其中的比例等于或大于9∶1。
6.如權(quán)利要求1中的方法，其中目標(biāo)區(qū)域含有多肽的功能區(qū)。
7.如權(quán)利要求1中的方法，其中目標(biāo)區(qū)域包括免疫球蛋白的催化部位。
8.如權(quán)利要求1中的方法，其中目標(biāo)區(qū)域包括抗體的超變區(qū)域。
9.如權(quán)利要求1中的方法，其中預(yù)定的氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、胱氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸或精氨酸。
10.如權(quán)利要求1中的方法，其中使用二項(xiàng)式分布來確定可用原型核苷酸與可用預(yù)定核苷酸之比，二項(xiàng)式分布中考慮到了目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度以及與核苷酸結(jié)合所需的成功率，其中的核苷酸對(duì)預(yù)定氨基酸進(jìn)行編碼。
11.使用權(quán)利要求1中方法所制備出的核酸庫。
12.通過權(quán)利要求11中核酸的表達(dá)而制備出的多肽庫。
全文摘要
本文涉及引入式核酸突變的方法，其中的核酸對(duì)研究感興趣的原多肽進(jìn)行編碼。本文所述的方法包括選擇預(yù)定的氨基酸以及多肽的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)區(qū)域；合成低核苷酸的混合物。其中的低核苷酸在目標(biāo)區(qū)域的每個(gè)序列位置上或者含有原型核苷酸或者含有預(yù)定的核苷酸。原型核苷酸被用來合成預(yù)定的氨基酸。在合成過程中，可用的原型核苷酸與可用的預(yù)定核苷酸之比大于1∶1。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1653193SQ03811148
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月17日
發(fā)明者羅伯特歐·克瑞, 蓋德·卡布其力 申請(qǐng)人:羅伯特歐·克瑞, 蓋德·卡布其力