專利名稱：防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽錯誤顯色的方法、試劑溶液 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽錯誤顯色的方法、試劑溶液和使用該方法利用氧化還原反應(yīng)的測量方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，使用氧化還原反應(yīng)測量樣品中的分析物已經(jīng)用于許多領(lǐng)域。例如，以下面的方式實施這種測量。首先，向作為分析物的氧化性物質(zhì)或者從分析物中形成的氧化性物質(zhì)中加入過氧化物酶(下文稱作“POD”)和還原劑，使得在POD作為催化劑的情況下在氧化性物質(zhì)和還原劑之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)。當(dāng)使用氧化時顯色的還原劑作為還原劑時，可通過測量顯示的顏色來確定氧化性物質(zhì)的量，因為顯示顏色的量與氧化性物質(zhì)的量之間存在著相互關(guān)系。已經(jīng)使用N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽作為氧化時顯色的還原劑。
但是，這種方法不能表現(xiàn)出足夠的測量靈敏度，因此可能不提高測量的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
考慮上述的問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了深入的研究，并且發(fā)現(xiàn)通過在四唑鎓和疊氮化鈉存在下實施氧化還原反應(yīng)可以提高測量的靈敏度。所述結(jié)果已經(jīng)在另一篇專利申請中遞交。但是，本發(fā)明的發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)盡管如上所述這種測量方法可以提高測量靈敏度，但是它引起另一個問題由于溶液中一起存在N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽、四唑鎓化合物和疊氮化鈉，所以在氧化還原反應(yīng)之前，N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽作為顯示顏色的底物(下文中稱作“顯色底物”)可能發(fā)生錯誤的顯色。這種錯誤顯色導(dǎo)致在上述顯色測量中背景的增加，并且在一些情況中，即便添加的顯色底物的量是足夠的，也會導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)中顯色底物的缺乏。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽錯誤顯色的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種在包含四唑鎓化合物和疊氮化鈉的含水溶劑中防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(下文也稱作“DA-64”)錯誤顯色的方法，其包括在表面活性劑的存在下，在含水溶劑中混合四唑鎓化合物、疊氮化鈉和DA-64，其中每微摩爾DA-64存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且包含DA-64、四唑鎓化合物和疊氮化鈉的含水溶劑的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
通過在表面活性劑的存在下混合上述的三種組分并且設(shè)置混合物中各組分的濃度和pH值在上述的范圍內(nèi)，即便在含水溶劑中一起存在“DA-64、四唑鎓化合物和疊氮化鈉”也能抑制上述DA-64的錯誤顯色。因此，如果對后面所述的使用氧化還原反應(yīng)的測量施用這種防止錯誤顯色的方法，那么可以抑制吸光度測量中背景吸光度的增加，從而可以高準(zhǔn)確度地測量分析物。添加各種組分的順序沒有特別限制，只要在含水溶劑中彼此混合DA-64、四唑鎓化合物和疊氮化鈉時存在表面活性劑就行。因此例如，事先向含水溶劑中加入表面活性劑，然后分別向含水溶劑中加入剩下的三種組分。可選地，在已經(jīng)向含水溶劑中加入了四唑鎓化合物和疊氮化鈉后，可在表面活性劑的存在下加入DA-64。這些實例只是用于闡述目的，并且添加這些組分的順序沒有限制于這些實例。
接著，本發(fā)明提供了一種包含DA-64、四唑鎓化合物、疊氮化鈉和表面活性劑的DA-64試劑溶液，其中每微摩爾DA-64存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且試劑溶液的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
在具有這種組成的試劑溶液中，即便在四唑鎓化合物和疊氮化鈉的存在下，如同在上述防止錯誤顯色的方法的情況一樣，也可以防止DA-64的錯誤顯色。因此，可以以溶液形式穩(wěn)定地儲備DA-64，并且這種試劑溶液適用于例如下面描述的測量方法等。
接著，本發(fā)明提供了一種測量樣品中源于分析物的氧化性物質(zhì)的方法，其包括在源于分析物的氧化性物質(zhì)與作為顯色底物的DA-64之間引起反應(yīng)，所述反應(yīng)在四唑鎓化合物和疊氮化鈉的存在下通過氧化還原酶來引發(fā)；以及通過測量顯色物質(zhì)顯示的顏色來確定氧化性物質(zhì)的量。在此方法中，在表面活性劑的存在下于含水溶劑中混合四唑鎓化合物、疊氮化鈉和顯色底物，使得每微摩爾作為顯色底物的DA-64存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且所得混合物的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
因為可以抑制由于DA-64錯誤顯色引起的背景增加，這種測量方法不僅在測量靈敏度而且在測量準(zhǔn)確度方面都是優(yōu)異的。在本發(fā)明中，“源于分析物的氧化性物質(zhì)”包括分析物自身、分析物中包含的氧化性物質(zhì)，以及使用氧化還原酶從分析物形成的氧化性物質(zhì)等。
在根據(jù)本發(fā)明的測量方法中，含水溶劑優(yōu)選是包含分析物的樣品溶液。例如，優(yōu)選向樣品溶液中加入了四唑鎓化合物和疊氮化鈉，并且此后，在表面活性劑的存在下進一步加入N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)以及氧化還原酶，從而通過氧化還原酶引起反應(yīng)。
在根據(jù)本發(fā)明的測量方法中，樣品的類型沒有特別限制。所述方法還可以應(yīng)用于全血、血漿、血清和血細胞以外的樣品，例如生物樣品，如尿和脊髓液、飲料如果汁，以及食物如醬油和辣醬油。
在根據(jù)本發(fā)明的測量方法中，分析物沒有特別限制，只要使用氧化還原反應(yīng)就行。例如，分析物可以是全血中的組分、紅細胞中的組分、血漿中的組分、血清中的組分、尿中的組分、脊髓液中的組分等，并且優(yōu)選是紅細胞中的組分。例如，當(dāng)需要測量紅細胞中的組分時，全血自身可以發(fā)生溶血來制備樣品，或者紅細胞與全血分離，并且溶血來制備樣品。分析五的具體實例包括糖化蛋白，例如糖化血紅蛋白和糖化白蛋白、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、膽固醇、肌酸酐、肌氨酸和甘油。其中，糖化蛋白是優(yōu)選的并且糖化血紅蛋白是特別優(yōu)選的。原因如下。已經(jīng)認(rèn)為糖化血紅蛋白是一種在糖尿病的診斷、治療等中的重要指示劑，因為它反映了患者血糖水平的過去歷史。因為根據(jù)本發(fā)明可以準(zhǔn)確測量糖化血紅蛋白的量，所以提高了糖化血紅蛋白作為指示劑的可靠性。因此，本發(fā)明在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域是有利的。
在根據(jù)本發(fā)明的測量方法中，當(dāng)分析物是糖化蛋白時，優(yōu)選通過用果糖基氨基酸氧化酶(下文中稱作“FAOD”)氧化降解其糖化位，從而形成過氧化氫。另外，當(dāng)分析物是糖化肽或糖化氨基酸時，優(yōu)選糖化肽或糖化氨基酸時相似地受到FAOD的作用。由此形成的過氧化氫對應(yīng)于上述源自分析物的氧化性物質(zhì)。另外，需要時，優(yōu)選在FAOD處理前，用蛋白酶處理糖化蛋白和氧化肽。
優(yōu)選使用能夠催化由下式表示的反應(yīng)的FAOD作為FAOD。
(1)在式(1)中，R1表示羥基或者源于糖化前糖的殘基(即糖殘基)。糖殘基(R1)在糖化前糖是醛糖時為醛糖殘基，并且當(dāng)糖化前糖是酮糖時為酮糖殘基。例如，當(dāng)糖化前糖是葡萄糖時，它在糖化后通過Amadori重排采取果糖結(jié)構(gòu)。在此情況下，糖殘基(R1)成為葡萄糖殘基(一種醛糖殘基)。例如，該糖殘基(R1)可以如下表示-[CH(OH)]n-CH2OH式中，n是0至6的整數(shù)。
在式(1)中，R2沒有特別限制。但是，例如當(dāng)?shù)孜锸翘腔被?、糖化肽或者糖化蛋白質(zhì)時，α-氨基被糖化的情況與α-氨基以外的氨基被糖化的情況是不同的。
在式(1)中，當(dāng)α-氨基被糖化時，R2是氨基酸殘基，或者由下式(2)表示的肽殘基。
-CHR3-CO-R4(2)式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)鏈基團。R4表示羥基、氨基酸殘基，或者肽殘基，并且例如可以由下式(3)表示。在式(3)中，n是0或者更大的整數(shù)，并且R3表示與上述相同的氨基酸側(cè)鏈基團。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (3)在式(1)中，當(dāng)α-氨基以外的氨基被糖化(即氨基酸側(cè)鏈基團被糖化)時，R2可以由下面的式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)鏈基團中除糖化氨基以外的部分。例如，當(dāng)糖化氨基酸是賴氨酸時，R5如下。
-CH2-CH2-CH2-CH2-對于另一個實例，當(dāng)糖化氨基酸是精氨酸時，R5如下。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-式(4)中，R6表示氫、氨基酸殘基，或者肽殘基，并且例如可以由下面的式(5)表示。在式(5)中，n是0或者更大的整數(shù)，并且R3表示與上述相同的氨基酸側(cè)鏈基團。
-(CO-CHR3-NH)n-H (5)式(4)中，R7表示羥基、氨基酸殘基，或者肽殘基，并且例如可以由下面的式(6)表示。在式(6)中，n是0或者更大的整數(shù)，并且R3表示與上述相同的氨基酸側(cè)鏈基團。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(6)作為FAOD，例如可以使用對具有糖化α-氨基的糖化氨基酸特異的名為果糖基氨基酸氧化酶(FAOX-E)的商購產(chǎn)品(由Kikkoman公司生產(chǎn))、對具有糖化α-氨基的糖化氨基酸和具有糖化∈-氨基的諸如賴氨酸的糖化氨基酸特異的名為FOD(由Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn))和KAO(由Genzyme Japan K.K.生產(chǎn))的商購產(chǎn)品等。


圖1是表示在根據(jù)本發(fā)明的測量方法一個實例中吸光度隨時間的變化圖。
具體實施例方式
例如，本發(fā)明以下面的方式阻止了DA-64的錯誤顯色。
首先，在含水溶劑中溶解表面活性劑，然后將四唑鎓化合物、疊氮化鈉和DA-64與所得的溶液混合。四唑鎓化合物、疊氮化鈉和DA-64按照每微摩爾DA-64存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾表面活性劑的量來混合，并且調(diào)節(jié)所述混合物的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
優(yōu)選每微摩爾DA-64存在0.02至0.8毫摩爾的四唑鎓化合物、0.01至0.3毫摩爾的疊氮化鈉和0.01至0.4毫摩爾的表面活性劑。特別優(yōu)選每微摩爾DA-64存在0.03至0.6毫摩爾的四唑鎓化合物、0.01至0.2毫摩爾的疊氮化鈉和0.04至0.3毫摩爾的表面活性劑。此外，優(yōu)選所述混合物的pH值在6至9的范圍內(nèi)，更優(yōu)選從6.5至8。
如上所述，只要在混合剩下的三種組分四唑鎓化合物、疊氮化鈉和DA-64時，表面活性劑落在上述濃度范圍內(nèi)，則添加各組分的順序沒有特別限制。
含水溶劑的種類沒有特別限制，并且例如可以使用水、各種緩沖液等。緩沖液的實例包括Tris-HCl、磷酸鈉、EPPS、HEPES和TES緩沖液。其中，Tris-HCl和磷酸鈉緩沖液是優(yōu)選的。此外，例如緩沖液的濃度在從10至300毫摩爾，優(yōu)選從50至300毫摩爾的范圍內(nèi)。
表面活性劑沒有特別限制，并且例如可以是聚氧乙烯烷基醚，例如Brii 35、Brij 58；及聚氧乙烯月桂基醚；聚氧乙烯烷苯基醚，例如Triton X-100和Triton X-114；聚氧乙烯脫水山梨糖醇醚，例如Tween20和Tween 60等。
例如，四唑鎓化合物優(yōu)選至少在四唑環(huán)的兩個位置上，更優(yōu)選在四唑環(huán)的三個位置上具有帶環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基(環(huán)取代基)。
在如上所述四唑鎓化合物至少在四唑環(huán)的兩個位置上具有環(huán)取代基的情況中，優(yōu)選環(huán)取代基在四唑環(huán)的2位和3位。此外，在四唑鎓化合物在四唑環(huán)的三個位置上具有環(huán)取代基的情況中，優(yōu)選環(huán)取代基在四唑環(huán)的2位、3位和5位。
此外，優(yōu)選四唑鎓化合物至少兩個環(huán)取代基具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。除了苯環(huán)結(jié)構(gòu)以外，例如在環(huán)骨架中包含S或O時，環(huán)取代基可以具有共振結(jié)構(gòu)。具有這種共振結(jié)構(gòu)的環(huán)取代基的實例包括噻吩基、噻唑基等。
此外，優(yōu)選四唑鎓化合物至少在四唑環(huán)的三個位置上具有環(huán)取代基，并且至少兩個環(huán)取代基具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。
另外，優(yōu)選至少一個環(huán)取代基具有官能團，并且更多的官能團是更優(yōu)選的。官能團優(yōu)選的實例包括吸電子官能團，例如鹵素基團、醚基、酯基、羧基、?；?、亞硝基(nitroso group)、硝基、羥基和磺基。除這些官能團以外的實例包括含有氧的特征基團，例如氫過氧基、氧基、環(huán)氧基、環(huán)二氧基和橋氧基；以及含有硫的特征基團，例如巰基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基團、亞磺基、苯磺?；?benzenesulfonyl)、苯磺?；?phenylsulfonyl)、對甲苯磺?；?p-toluenesulfonyl)、對甲苯磺酰基(p-tolylsulfonyl)、甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺?；彤惲蚯杷狨セ?。其中，吸電子官能團、硝基、磺基、鹵素基團、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基是優(yōu)選的。除上述吸電子官能團以外的實例包括不飽和的烴基，例如苯基(C6H5-)和苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)。應(yīng)當(dāng)指出所述官能團可以被離解離子化。
此外，優(yōu)選四唑鎓化合物在四唑環(huán)的2位和3位上具有苯環(huán)并且至少一個苯環(huán)具有至少一種選自鹵素基團、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基、乙氧基中的官能基團。應(yīng)當(dāng)指出此處兩個苯環(huán)都可以具有這種官能團。此外，官能團可以在位于每個苯環(huán)的任意位置上(鄰、間、對位)。此外，官能團的數(shù)量沒有特別限制，并且苯環(huán)可以具有相同或者不同的官能團。
在四唑環(huán)的2位、3位和5位上具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)取代基的四唑鎓化合物的實例包括2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽；2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽；2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽；2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽；3，3′-(1，1′-二苯基-4，4′-二基)-雙(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓鹽；3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽]；2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓鹽；2，5-二苯基-3-(對-聯(lián)苯基)四唑鎓鹽；2，3-二苯基-5-(對-聯(lián)苯基)四唑鎓鹽；2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯苯基)四唑鎓鹽；2，5-二苯基-3-(間-甲苯基)四唑鎓鹽；及
2，5-二苯基-3-(對-甲苯基)四唑鎓鹽。
四唑鎓化合物沒有局限于上述化合物。除了上述四唑鎓化合物外，也可以使用在四唑環(huán)兩個位置具有帶苯環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)取代基并且一個環(huán)取代基具有除苯環(huán)結(jié)構(gòu)以外的結(jié)構(gòu)的四唑鎓化合物。
這些四唑鎓化合物的實例包括2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓鹽；2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-2H-四唑鎓鹽；2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-雙[4-二(2-磺乙基)氨基甲?；交鵠-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯(lián)苯基)二四唑鎓鹽；及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5二苯基-2H-四唑鎓鹽。
此外，可以使用在四唑環(huán)兩個位置具有帶苯環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)取代基并且在一個位置上一個取代基不具有環(huán)結(jié)構(gòu)的四唑鎓化合物。這些四唑鎓化合物的實例包括2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓鹽；2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓鹽；2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓鹽；及2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓鹽。
在上述四唑鎓化合物中，優(yōu)選是上述具有三個環(huán)取代基的化合物，并且更優(yōu)選是具有三個帶苯環(huán)結(jié)構(gòu)并且具有許多吸電子官能團的環(huán)取代基的化合物。特別優(yōu)選是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。應(yīng)當(dāng)指出上述四唑鎓化合物例如可以是鹽或者可以是離子化的。另外，四唑鎓化合物可以單獨使用或者兩種或多種組合使用。
可以使用制備來防止DA-64錯誤顯色的溶液作為DA-64試劑溶液。DA-64試劑溶液的應(yīng)用沒有特別限制。例如，它可以在例如后面所述的氧化還原反應(yīng)中用作顯色底物的試劑溶液。
下文中，參照下面的實施例詳細地描述使用根據(jù)本發(fā)明的氧化還原反應(yīng)的測量方法，其中測量血細胞中的糖化蛋白質(zhì)。
首先，全血自身被溶血，或者按照例如離心的常用方法從全血中分離出血細胞部分，然后溶血，從而制備出溶血樣品。引起溶血的方法沒有特別限制，并且例如可以是使用表面活性劑的方法、使用超聲波的方法和使用滲透壓差異的方法。其中，因其操作簡單等，使用表面活性劑的方法是優(yōu)選的。
例如，可以使用諸如聚氧乙烯-對-叔辛苯基醚(例如Triton系列表面活性劑)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇烷基酯(例如Tween系列表面活性劑)、聚氧乙烯烷基醚(例如Brij系列表面活性劑)等。具體的實例是Triton X-100，Tween-20，Brij 35等。使用表面活性劑的處理條件通常如下當(dāng)待處理溶液中血細胞濃度在從1至10體積％的范圍時，加入表面活性劑，使其在溶液中的濃度落在從0.01至5重量％的范圍內(nèi)，并且在室溫下攪拌約幾秒種(約5秒種)至10分鐘。
接著，向溶血的樣品中加入表面活性劑。在通過使用上述表面活性劑引起溶血的方法來制備溶血樣品的情況中，如果樣品中的表面活性劑濃度已經(jīng)在下面的范圍內(nèi)，則不需要再加入表面活性劑。另一方面，如果表面活性劑的濃度沒有達到下面的范圍，則可以加入表面活性劑，補償不足量。
加入表面活性劑，使其在后面所述的氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液中的最終濃度落在從0.006至80毫摩爾/升，優(yōu)選從0.05至40毫摩爾/升，并且特別優(yōu)選從0.2至20毫摩爾/升的范圍內(nèi)。此外，在已經(jīng)添加了表面活性劑的溶血樣品中，表面活性劑的濃度例如在從0.1至200毫摩爾/升，優(yōu)選從0.5至100毫摩爾/升，并且特別優(yōu)選從2至100毫摩爾/升的范圍內(nèi)。
隨后，再向包含表面活性劑的溶血樣品中加入四唑鎓化合物和疊氮化鈉。
加入四唑鎓化合物和疊氮化鈉，使它們在氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液中的最終濃度落在下面的范圍內(nèi)四唑鎓化合物在從0.01至40毫摩爾/升的范圍內(nèi)并且疊氮化鈉在從0.015至20毫摩爾/升的范圍內(nèi)；優(yōu)選四唑鎓化合物在從0.1至32毫摩爾/升的范圍內(nèi)并且疊氮化鈉在從0.05至12毫摩爾/升的范圍內(nèi)；并且特別優(yōu)選四唑鎓化合物在從0.15至24毫摩爾/升的范圍內(nèi)并且疊氮化鈉在從0.05至8毫摩爾/升的范圍內(nèi)。
此外，加入四唑鎓化合物(A)和疊氮化鈉(B)，使它們的比例(摩爾比A∶B)例如處于從10∶1至1∶1，優(yōu)選從6∶1至1.5∶1，并且更優(yōu)選從4∶1至2∶1的范圍內(nèi)。
具體地說，當(dāng)待處理溶液中的血細胞濃度在1至10體積％的范圍內(nèi)時，例如優(yōu)選加入四唑鎓化合物，使其在溶液的濃度落在從0.02至2000毫摩爾/升，更優(yōu)選從0.1至1000毫摩爾/升，并且特別優(yōu)選從0.4至200毫摩爾/升的范圍內(nèi)。另一方面，當(dāng)待處理溶液中的血細胞濃度在1至10體積％的范圍內(nèi)時，例如優(yōu)選加入疊氮化鈉，使其在溶液的濃度落在從0.006至800毫摩爾/升，更優(yōu)選從0.04至400毫摩爾/升，并且特別優(yōu)選從0.1至80毫摩爾/升的范圍內(nèi)。
可以簡單按原樣向溶血樣品中加入四唑鎓化合物和疊氮化鈉。但是，就操作簡單性等而言，優(yōu)選使用通過在溶劑中溶解四唑鎓化合物獲得的四唑鎓化合物溶液和在溶劑中溶解疊氮化鈉獲得的疊氮化鈉溶液，或者使用包含四唑鎓化合物和疊氮化鈉的液態(tài)混合物(即四唑鎓化合物-疊氮化鈉液態(tài)混合物)。
例如，可以使用MOPS、CHES、Tris-HCl、磷酸鈉、磷酸鉀、HEPES、TES緩沖液等作為上述溶液的溶劑。
另外，所制備的四唑鎓化合物-疊氮化鈉液態(tài)混合物優(yōu)選在加入溶血樣品之前先旋轉(zhuǎn)一段時間來老化，因為這會更進一步提高靈敏度。根據(jù)所述老化處理，例如靈敏度變成高于不實行老化處理情況的約1.2至3倍。
在老化處理中，處理溫度優(yōu)選在4℃至80℃，更優(yōu)選在25℃至75℃，并且特別優(yōu)選在40℃至70℃的范圍內(nèi)，而且例如處理時間在10分鐘至200小時，更優(yōu)選在1至180小時，并且特別優(yōu)選在3至100小時的范圍內(nèi)。
在簡單按原樣或者按上述溶液向溶血樣品中加入四唑鎓化合物和疊氮化鈉后，通常通過在10℃至40℃下培養(yǎng)樣品1至10分鐘，實施溶血樣品的預(yù)處理。通過用四唑鎓化合物預(yù)處理樣品，可以消除樣品中所含的還原物質(zhì)等對氧化還原反應(yīng)的影響，從而提高測量準(zhǔn)確度。如上所述，四唑鎓化合物通過消除還原物質(zhì)的影響而有助于提高測量的準(zhǔn)確度。另外，當(dāng)四唑鎓化合物與疊氮化鈉一起存在時，也可以提高測量靈敏度。
接著，用蛋白酶處理包含四唑鎓化合物和疊氮化鈉的經(jīng)預(yù)處理溶血樣品。實施所述蛋白酶處理，使隨后處理中使用的FAOD能夠更容易對分析物作用。
蛋白酶的類型沒有特別限制，并且例如可以使用絲氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、金屬蛋白酶等。具體地說，蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶等是優(yōu)選的。在要降解的糖化蛋白質(zhì)是糖化血紅蛋白時，蛋白酶是選擇性降解糖化血紅蛋白的酶，并且菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、源自豬胰腺的胰蛋白酶、金屬蛋白酶和源自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶等是優(yōu)選的。源自枯草桿菌的蛋白酶包括名為Protease N的產(chǎn)品(如FlukaChemie AG)和名為Protease N“AMANO”的產(chǎn)品(Amano EnzymeInc.)。金屬蛋白酶的實例包括源于桿菌屬的金屬蛋白酶(EC 3.4.24.4)。其中，金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶是更優(yōu)選的，并且金屬蛋白酶是特別優(yōu)選的。因此，通過使用選擇性降解蛋白質(zhì)的蛋白酶可以選擇性地制備特定蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。蛋白酶處理通常在緩沖液中進行，并且處理條件根據(jù)所用蛋白酶的類型、分析物糖化蛋白質(zhì)的類型和濃度等來適當(dāng)?shù)卮_定。
例如，作為緩沖液，可以使用CHES、CAPSO、CAPS、磷酸鹽、Tris、EPPS、HEPES緩沖液等。緩沖液的pH例如在6至13，優(yōu)選在7至10的范圍內(nèi)。另外，接受蛋白酶處理的溶液中緩沖液的最終濃度例如在1至200毫摩爾/升的范圍內(nèi)。
具體地說，當(dāng)使用金屬蛋白酶作為蛋白酶處理預(yù)處理的溶血樣品時，通常在如下條件中進行蛋白酶處理反應(yīng)溶液中金屬蛋白酶的濃度在2至20,000 KU/l的范圍內(nèi)；反應(yīng)溶液中血細胞濃度在0.05至15體積％的范圍內(nèi)；反應(yīng)溫度在15℃至37℃的范圍內(nèi)；反應(yīng)時間在1分鐘至24小時的范圍內(nèi)；并且pH在6至12的范圍內(nèi)。
此外，當(dāng)使用蛋白酶K作為蛋白酶來處理預(yù)處理的溶血樣品時，通常在如下條件中進行蛋白酶處理反應(yīng)溶液中金屬蛋白酶的濃度在2至10,000 KU/l的范圍內(nèi)；反應(yīng)溶液中血細胞濃度在0.05至15體積％的范圍內(nèi)；反應(yīng)溫度在15℃至37℃的范圍內(nèi)；反應(yīng)時間在1分鐘至24小時的范圍內(nèi)；并且pH在6至12的范圍內(nèi)。另外，緩沖液的類型沒有特別限制，并且例如可以使用可以Tris-HCl、EPPS、PIPES緩沖液等。
接下來，用FAOD處理通過蛋白酶處理獲得的降解產(chǎn)物。通過所述FAOD處理催化了上面式(1)表示的反應(yīng)。
與上述蛋白酶處理相似，所述FAOD處理優(yōu)選在緩沖液中進行。FAOD處理的條件根據(jù)所用FAOD的類型、作為分析物的糖化蛋白質(zhì)的類型和濃度等來適當(dāng)?shù)卮_定。
具體例如，在如下條件下實施FAOD處理反應(yīng)溶液中FAOD的濃度在50至50,000 U/l的范圍內(nèi)；反應(yīng)溶液中血細胞濃度在0.01至1體積％的范圍內(nèi)；反應(yīng)溫度在15℃至37℃的范圍內(nèi)；反應(yīng)時間在1至60分鐘的范圍內(nèi)；并且pH在6至9的范圍內(nèi)。另外，緩沖液的類型沒有特別限制，并且在FAOD處理中也可以使用與蛋白酶處理中相同的緩沖液。
接下來，使用POD和DA-64通過氧化還原反應(yīng)測量FAOD處理形成的過氧化氫。
可以加入DA-64作為顯色底物，使其在氧化還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液中最終濃度落在從0.001至20毫摩爾/升，優(yōu)選從0.005至2毫摩爾/升，并且特別優(yōu)選從0.01至0.5毫摩爾/升的范圍內(nèi)。
DA-64(C)和已經(jīng)加入的表面活性劑(D)、四唑鎓化合物(E)和疊氮化鈉(E)之間的比例(摩爾比C∶D∶E∶F)例如在1∶6∶10∶3至1∶2000∶1000∶500，優(yōu)選從1∶10∶20∶10至1∶1000∶800∶300，并且更優(yōu)選從1∶40∶30∶10至1∶500∶600∶200的范圍內(nèi)。
該反應(yīng)溶液的pH在從6至9，優(yōu)選從6至8的范圍內(nèi)。
氧化還原反應(yīng)通常在緩沖液中進行。反應(yīng)的條件根據(jù)所形成的過氧化氫等的濃度來適當(dāng)?shù)卮_定。具體例如，所述條件如下反應(yīng)溶液中的POD濃度在10至100,000 IU/l的范圍內(nèi)；顯色底物的濃度在從0.001至20毫摩爾/升的范圍內(nèi)；反應(yīng)溫度在15℃至37℃的范圍內(nèi)；反應(yīng)時間在0.1至30分鐘的范圍內(nèi)；并且pH在6至8的范圍內(nèi)。另外，緩沖液的類型沒有特別限制，并且例如可以使用與蛋白酶處理和FAOD處理中相同的緩沖液。
DA-64通過氧化還原反應(yīng)顯色。因此，通過用分光光度計在例如從650至760納米范圍內(nèi)的波長下測量反應(yīng)溶液的吸光度(即顯色的程度)，可以確定過氧化氫的量。然后，使用由此確定的過氧化氫的量和先前繪制的表示過氧化氫量和糖化蛋白質(zhì)量之間關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的量。
因此，通過添加表面活性劑以及四唑鎓化合物和疊氮化鈉，并且設(shè)置這種組分的比例在上述范圍內(nèi)，可以防止DA-64的錯誤顯色。結(jié)果，可以抑制背景的增加，從而實現(xiàn)高的測量準(zhǔn)確度。
此外，如上所述，只要使用氧化還原反應(yīng)，分析物沒有特別限制。除了糖化蛋白質(zhì)以外的分析物的實例包括糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、膽固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸和甘油。當(dāng)測量上述每種分析物實例的量時，例如通過形成源于分析物的氧化性物質(zhì)，并且按照上述相同的方式使用氧化還原反應(yīng)測量氧化性物質(zhì)的量，從而實施測量。
例如，通過形成過氧化氫作為源于分析物的氧化性物質(zhì)來實施測量時，例如可分別通過葡萄糖氧化酶對葡萄糖；膽固醇氧化酶對膽固醇；尿酸酶對尿酸；肌氨酸氧化酶對肌酸酐；或者甘油氧化酶對甘油的作用來形成過氧化氫。以與上述相同的方式測量過氧化氫的量。另外，例如以與上述糖化蛋白質(zhì)的測量相同的方式來測量糖化肽和糖化氨基酸。
實施例(處理溶液A)A-1包含7克/升(12毫摩爾/升)的聚氧乙烯(9)月桂醚(PEGLE)的40毫摩爾/升CHES緩沖液(pH9.5)A-2包含50克/升(85毫摩爾/升)PEGLE的40毫摩爾/升CHES緩沖液(pH9.5)(處理溶液B)制備包含5毫摩爾/升2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽(產(chǎn)品名WST-3，由Dojindo Laboratories生產(chǎn))和1.5毫摩爾/升疊氮化鈉的混合物，并且在50℃下培養(yǎng)24小時。然后，3毫升這種溶液、1毫升金屬蛋白酶(ARKRAY，Inc.，10,000 KU/l)、1毫升MES緩沖液(50毫摩爾/升，pH5.5)、NaCl溶液(500毫摩爾/升)，以及3毫升純化水被彼此混合。使用所得混合物作為處理溶液B。
(處理溶液C)C-1DA-64 80微摩爾/升Tris緩沖液(pH7.0) 300毫摩爾/升FAOD(ARKRAY，INC.)30 KU/lPOD 100 KU/lC-2DA-64 1000微摩爾/升Tris緩沖液(pH7.0) 300毫摩爾/升FAOD(ARKRAY，INC.)30 KU/lPOD 100 KU/l(程序)離心血液(3000rpm)，并且收集血細胞。然后，10微升血細胞分別與300微升的處理溶液A(A-1和A-2)混合，制備溶血樣品。然后，向10微升這些溶血樣品中加入100微升的處理溶液B，并且所得混合物在37℃培養(yǎng)5分鐘。隨后，分別向每種混合物中加入22微升的處理溶液C(C-1和C-2)，并且在37℃下培養(yǎng)所得混合物。使用名為JCA-BM 8(由Japan Electron Optics Laboratory Co.Ltd.生產(chǎn))的自動分析儀測量這些反應(yīng)溶液的吸光度(在751納米的波長下)。溶血樣品與處理試劑B混合的瞬間被視為0秒，并且加入處理溶液C的瞬間為300秒。為了測量在完成FAOD和POD之間的反應(yīng)之后，繼續(xù)發(fā)生的錯誤顯色，確定486秒和603秒間吸光度變化的量。下面的表1表示了反應(yīng)溶液中各種組分的最終濃度和相對于1微摩爾DA-64各組分的量。此外，圖1和和下面的2表示了吸光度變化量的測定結(jié)果。圖1是表示反應(yīng)溶液吸光度隨時間變化的圖。
表1

表2

如上面表所示，在比較例1中，PEGLE的量(＞0.4毫摩爾)相對于1微摩爾DA-64太大。在比較例2中，PEGLE(＜0.006毫摩爾)、WST-3(＜0.01毫摩爾)和NaN3(＜0.003毫摩爾)的量相對于1微摩爾DA-64太小，并且在比較例3中，WST-3(＜0.01毫摩爾)和NaN3(＜0.003毫摩爾)的量相對于1微摩爾DA-64太小。因此，比較例1至3由于錯誤顯色表現(xiàn)出高的吸光度，如圖1所示，因此吸光度的變化量是很大的，如表2所示。相反，在實施例1中，因為防止了錯誤顯色，吸光度是低的，如圖1所示，因此吸光度的變化量減小。這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法可以防止DA-64的錯誤顯色，從而提高了測量準(zhǔn)確度。
工業(yè)應(yīng)用性如上面具體所述，根據(jù)本發(fā)明可以防止作為顯色底物的DA-64的錯誤顯色。因此，通過將防止錯誤顯色的方法運用于使用氧化還原反應(yīng)的測量中，可以抑制由于錯誤顯色引起的背景增加，從而提高了測量準(zhǔn)確度。另外，通過將這種測量方法運用于例如紅細胞中HbAlc的測量中，可以實現(xiàn)比傳統(tǒng)方法更高準(zhǔn)確度的測量，這進一步增加了HbAlc作為指示劑在糖尿病診斷等中的重要性。
權(quán)利要求
1.一種在包含四唑鎓化合物和疊氮化鈉的含水溶劑中防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽錯誤顯色的方法，其包括在表面活性劑存在下，在含水溶劑中混合四唑鎓化合物、疊氮化鈉和N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽，其中每微摩爾N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且包含四唑鎓化合物、疊氮化鈉、N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽和表面活性劑的含水溶劑的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中每微摩爾N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽存在0.02至0.8毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.01至0.4毫摩爾的表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在將表面活性劑加入到含水溶劑中后，將四唑鎓化合物、疊氮化鈉和N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽加入含水溶劑中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在四唑鎓化合物和疊氮化鈉加入到含水溶劑中后，N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽在表面活性劑存在下加入到所述含水溶劑中。
6.一種N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽試劑溶液，其包含N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽；四唑鎓化合物；疊氮化鈉；表面活性劑，其中每微摩爾N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且該試劑溶液的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑溶液，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
8.一種測量樣品中源于分析物的氧化性物質(zhì)的方法，其包括在源于分析物的氧化性物質(zhì)與作為顯色底物的N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽之間引起反應(yīng)，所述反應(yīng)在四唑鎓化合物和疊氮化鈉存在下通過氧化還原酶來引發(fā)；及通過測量底物顯示的顏色來確定氧化性物質(zhì)的量；其中，在表面活性劑的存在下于含水溶劑中混合四唑鎓化合物、疊氮化鈉和顯色底物，使得每微摩爾作為底物的N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且所得混合物的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述含水溶劑是包含分析物的樣品溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中將所述四唑鎓化合物和疊氮化鈉加入到所述樣品溶液中，然后，在表面活性劑的存在下進一步加入N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽和氧化還原酶，通過氧化還原酶引起反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中在通過氧化還原酶引起反應(yīng)之前用蛋白酶處理所述分析物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述氧化還原酶對使用蛋白酶處理獲得的分析物的降解產(chǎn)物起作用。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述氧化還原酶是果糖基氨基酸氧化酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述源于分析物的氧化性物質(zhì)是過氧化氫。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述分析物是糖化蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述分析物是糖化血紅蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種防止N－(羧甲基氨羰基)－4，4′－雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽作為顯色底物錯誤顯色的方法，從而提高了利用使用顯色底物實行氧化還原反應(yīng)的測量的準(zhǔn)確度。在表面活性劑的存在下向樣品中加入四唑鎓化合物、疊氮化鈉和顯色底物。樣品中源于分析物的氧化性物質(zhì)與通過氧化而顯色的顯色底物之間的反應(yīng)通過氧化還原酶來引發(fā)。通過測量顯示的顏色來確定氧化性物質(zhì)的量。設(shè)置反應(yīng)溶液中各組分的濃度，使每微摩爾顯色底物存在0.01至1毫摩爾的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩爾的疊氮化鈉和0.006至0.4毫摩爾的表面活性劑，并且反應(yīng)溶液的pH值在6至9的范圍內(nèi)。
文檔編號C12Q1/26GK1656232SQ0381146
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月21日
發(fā)明者米原聰, 小森胤樹 申請人:愛科來株式會社