專(zhuān)利名稱(chēng)：5－甲基嗎啉－3－氨基－2－惡唑烷酮的偶聯(lián)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類(lèi)抗生素代謝物的偶聯(lián)物及其制備方法，尤其涉及一種呋喃它酮(Furaltadone)代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)的偶聯(lián)物及其制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的下列名稱(chēng)適用于整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)B(niǎo)SA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產(chǎn)品PBS＝磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75＝葡聚糖凝膠，Sigma公司產(chǎn)品AMOZ＝5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)，Sigma公司產(chǎn)品Glutar＝(Glutaraldehyde)戊二醛，上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品透析膜美國(guó)聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品呋喃它酮是一種重要的硝基呋喃類(lèi)抗感染藥，而5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone)即AMOZ為呋喃它酮的代謝物。由于其優(yōu)良的抗菌性能和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，呋喃類(lèi)藥物早已被廣泛地應(yīng)用于家畜，家禽和水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)的傳染病預(yù)防與治療，是一類(lèi)廣譜抗菌藥。但長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，硝基呋喃類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物具有致癌和致突變的特性。動(dòng)物長(zhǎng)期或大劑量服用呋喃類(lèi)藥物能引起毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為興奮，驚厥，癱瘓的急性神經(jīng)癥狀以及全身出血和反芻獸消化障礙等慢性中毒反應(yīng)。對(duì)于人體的不良反應(yīng)主要是胃腸反應(yīng)，溶血性貧血，血小板減少性紫癜，多發(fā)性神經(jīng)炎，眼部損害，急性肝壞死和嗜酸性白細(xì)胞增多等過(guò)敏反應(yīng)。
由于這些毒害作用，世界上很多國(guó)家都對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物的使用及其殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。美國(guó)和日本分別于1975和1977年禁止呋喃唑酮作為醫(yī)藥使用；澳大利亞于1992年禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用硝基呋喃類(lèi)藥物；美國(guó)1993年禁止呋喃唑酮作為獸藥；歐盟在1995年6月開(kāi)始禁止使用呋喃唑酮和呋喃西林，規(guī)定動(dòng)物源食品中不得檢出硝基呋喃(Commission Regulation 1442/95)；在我國(guó)，硝基呋喃藥物是農(nóng)業(yè)部嚴(yán)禁的抗菌素。盡管如此，硝基呋喃類(lèi)藥物由于藥效顯著，價(jià)格低廉，難以檢測(cè)，在我國(guó)的畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用仍然非常普遍，這給人們的健康安全帶來(lái)巨大的隱患。我國(guó)出口歐盟的魚(yú)，蝦，禽肉，兔肉，和腸衣均被檢出過(guò)含有硝基呋喃類(lèi)藥物，尤其是兔肉和禽肉，常常因此導(dǎo)致出口食品被迫就地銷(xiāo)毀。這已嚴(yán)重制約我國(guó)動(dòng)物源食品的出口，對(duì)國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)極大的威脅。所以，關(guān)于硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)研究已刻不容緩。
由于硝基呋喃類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，通過(guò)檢測(cè)母體化合物并不能得知這類(lèi)藥物的濫用情況。因此檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留以杜絕使用這種違禁藥物的最佳方法是檢測(cè)其代謝物而非母體化合物本身。檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留就變成了檢測(cè)這些與蛋白組織結(jié)合在一起的代謝物的殘留。
在抗生素藥物殘留的檢測(cè)中，儀器法如液相色譜和質(zhì)譜以及液相質(zhì)譜聯(lián)用是應(yīng)用最廣泛的方法。這些方法準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，需要大型儀器設(shè)備，需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場(chǎng)操作。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)易，不需要專(zhuān)門(mén)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，這使得ELISA法成為一種理想的，可用于常規(guī)掃描的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的核心是高質(zhì)量的抗體。大多數(shù)抗生素包括硝基呋喃類(lèi)藥物都是小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱(chēng)之為半抗原。所以，要實(shí)施酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)，達(dá)到快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)易的檢測(cè)目的，必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱(chēng)之為完全抗原)。本發(fā)明涉及的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮的偶聯(lián)物就是用來(lái)引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)AMOZ有特異反應(yīng)的抗體的免疫原。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，至今尚未有關(guān)于AMOZ免疫原合成的相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種能引發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)AMOZ有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮的偶聯(lián)物以及制備這種免疫原的方法。
本發(fā)明的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，由5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。
上述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。
本發(fā)明所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的AMOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa
上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜265nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
上述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其中優(yōu)選n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法是將5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
上述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法具體步驟如下(1)將AMOZ與牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩爾比溶于設(shè)定體積的磷酸緩沖液中，反應(yīng)4～6小時(shí)，制成溶液A；(2)在25℃～30℃條件下，以溶液A體積75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同時(shí)不斷攪拌，反應(yīng)3～6小時(shí)，得到溶液B；(3)將溶液B用磷酸緩沖液透析70～78小時(shí)，每10～12小時(shí)更換一次透析液；(4)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液；(5)將制取的上清液凍干，得到5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物粗品；(6)以磷酸緩沖溶液為洗脫液，用葡聚糖凝膠層析分離純化上述粗品，制得AMOZ偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的AMOZ偶聯(lián)物。
在上述制備方法中，AMOZ與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比優(yōu)選為20∶1。
在上述制備方法中，所述的磷酸緩沖液優(yōu)選pH為7.40，濃度為0.01M。
在上述制備方法中，所述的戊二醛濃度是體積百分比為25％的水溶液。
在上述制備方法中，所述的葡聚糖凝膠層析優(yōu)選采用Sephadex-G75。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原AMOZ與載體蛋白特別是牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)起來(lái)，從而合成了能夠在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原。利用此免疫原免疫兔，鼠，雞等動(dòng)物可以得到對(duì)半抗原AMOZ有特異反應(yīng)的抗體，這為該偶聯(lián)物用于制備AMOZ的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。把該抗體鍍?cè)谖⒖妆P(pán)內(nèi)，就可以用來(lái)檢驗(yàn)動(dòng)物源食品中呋喃它酮抗生素的殘留。由于該方法具有簡(jiǎn)易，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，所以可以用于食品檢驗(yàn)檢疫中的初步掃描檢測(cè)之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗(yàn)時(shí)間，還可以用于現(xiàn)場(chǎng)操作，從而彌補(bǔ)了儀器法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員操作，難于用于現(xiàn)場(chǎng)的不足。所以，半抗原AMOZ與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物的合成為這種快速檢驗(yàn)法奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 171.00mg(0.0025mmol)(所用BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)4小時(shí)，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在25℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)4小時(shí)，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AMOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析72小時(shí)(透析膜美國(guó)聯(lián)合炭化(United Carbide)公司產(chǎn)品)，每12小時(shí)更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到140mg白色固體粉末，即為5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75進(jìn)行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AMOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AMOZ免疫原固體粉末。通過(guò)紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物在265nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
實(shí)施例2(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 225.72mg(0.0033mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)5小時(shí)，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在28℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)5.5小時(shí)，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AMOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析77小時(shí)，每11小時(shí)更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到162mg白色固體粉末，即為5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AMOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AMOZ免疫原固體粉末。通過(guò)紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的免疫原在265nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
實(shí)施例3(1)溶液A的制備在50ml圓形反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，加入AMOZ 10.00mg(0.050mmol)，牛血清蛋白BSA 114.00mg(0.0017mmol)，溶解于15ml PBS(pH＝7.40，0.01M)中，反應(yīng)6小時(shí)，得到溶液A。
(2)溶液B的制備在30℃條件下，攪拌中(120轉(zhuǎn)/分鐘)，向溶液A中加入0.20ml戊二醛(25％v/v水溶液)，反應(yīng)5小時(shí)，得到淡黃色溶液B。
(3)制備AMOZ免疫原將溶液B用PBS(pH＝7.40，0.01M)緩沖液透析72小時(shí)，每12小時(shí)更換一次透析液。以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液。凍干上清液，得到113mg白色固體粉末，即為5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進(jìn)行純化分離，以PBS(pH＝7.40，0.01M)為洗脫液。收集AMOZ偶聯(lián)物純品。再經(jīng)凍干得到AMOZ免疫原固體粉末。通過(guò)紅外和紫外吸收光譜(吸收值)確定產(chǎn)物的偶聯(lián)情況。本發(fā)明的免疫原在265nm處有特征紫外吸收峰。紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
權(quán)利要求
1.一種5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，由5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮類(lèi)半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)偶聯(lián)構(gòu)成，所述載體物質(zhì)為優(yōu)選蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段，合成多肽或半合成多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其中所述的蛋白質(zhì)是牛血清蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的AMOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜265nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3407，2923，2871，1650，1540，1439，1398，1081，591，527，483。
4.如權(quán)利要求3所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，其中n為整數(shù)1～10，BSA分子量范圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是，將5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
6.如權(quán)利要求5所述5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，該方法步驟如下(1)將AMOZ與牛血清蛋白以15∶1～30∶1的摩爾比溶于設(shè)定體積的磷酸緩沖液中，反應(yīng)4～6小時(shí)，制成溶液A；(2)在25℃～30℃條件下，以溶液A體積75分之一的量加入戊二醛于溶液A中，同時(shí)不斷攪拌，反應(yīng)3～6小時(shí)，得到溶液B；(3)將溶液B用磷酸緩沖液透析70～78小時(shí)，每10～12小時(shí)更換一次透析液；(4)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析后的溶液B，取上清液；(5)將制取的上清液凍干，得到5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物粗品；(6)以磷酸緩沖溶液為洗脫液，用葡聚糖凝膠層析分離純化上述粗品，制得AMOZ偶聯(lián)物純品，再經(jīng)凍干得到白色固體粉末狀的，具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的AMOZ偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的AMOZ與牛血清蛋白的摩爾數(shù)比為20∶1。
8.如權(quán)利要求6所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的磷酸緩沖液pH為7.40，濃度為0.01M。
9.如權(quán)利要求6所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的戊二醛濃度是體積百分比為25％的水溶液。
10.如權(quán)利要求6所述的5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物的制備方法，其中所述的葡聚糖凝膠層析采用Sephadex-G75。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通式(I)的5－甲基嗎啉－3－氨基－2－惡唑烷酮(AMOZ)的偶聯(lián)物，由5－甲基嗎啉－3－氨基－2－惡唑烷酮類(lèi)半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)優(yōu)選牛血清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成，其中n為與一個(gè)牛血清蛋白分子結(jié)合的AMOZ的分子數(shù)，n為整數(shù)1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa～6.9KDa。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的偶聯(lián)物的制備方法，即將5－甲基嗎啉－3－氨基－2－惡唑烷酮與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來(lái)，結(jié)合為具有誘發(fā)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便，快速，特異，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為用所述偶聯(lián)物制備AMOZ的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑提供了廣闊的應(yīng)用空間。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1593659SQ200410024479
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者郗日沫, 盧圣欣, 劉金庭, 張玉蘭 申請(qǐng)人:山東大學(xué)