專利名稱：哺乳動(dòng)物促乳素變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物促乳素(PRL)變體，及其作為哺乳動(dòng)物促乳素受體(PRLRs)拮抗劑的用途，更特別的，作為人促乳素受體(hPRLR)拮抗劑的用途。
促乳素作為一種垂體前葉激素，具有廣泛的生物學(xué)活性，其中包括生乳和生殖兩方面的生物活性(BOLE-FEYSOT等，Endocr.Rev.，19，225-268，1998)。
PRL對靶組織的作用由特異的膜結(jié)合受體——促乳素受體介導(dǎo)，該受體屬于細(xì)胞因子受體超家族(KELLY等，Endocr.Rev.，12，235-251，1991)。
最近幾年，幾項(xiàng)研究表明，PRL也合成于垂體以外的位點(diǎn)(作為綜述，見于BEN-JONATHAN等，Endocr.Rev.，17，639-669，1996)，例如哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞(GINSBURG和VONDERHAAR，Cancer Res.，55，2591-2595，1995)或者前列腺(NEVALAINEN等，J.Clin.Invest.，99，618-627，1997)。另外有研究表明，該激素通過自分泌/旁分泌環(huán)促進(jìn)了(表達(dá)PRLR的)這些細(xì)胞的增殖(GINSBURG和VONDERHAAR，Cancer Res.，55，2591-2595，1995；MERSHON等，Endocrinology，136，3619-3623，1995；CLEVENGER和PLANK，J.Mammary Gland.Biol.Neopl.，2，59-68，1997)。另外，有人認(rèn)為，正常情況下PRL對某些靶組織的促生長活性，在病理學(xué)條件下可能或多或少參與促進(jìn)腫瘤的增長。支持該P(yáng)RL促腫瘤增長活性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)為1)在PRL轉(zhuǎn)基因小鼠中，乳腺瘤的發(fā)病延遲期被縮減(WENNBO等，J.Clin.Invest.，100，2744-2751，1997)，2)相反，在PRL剔除小鼠中，中型T抗原介導(dǎo)的乳腺瘤延遲出現(xiàn)(VOMACHKA等，Oncogene，19，1077-1084，2000)，或者3)在PRL-轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)了大量的前列腺增生(WENNBO等，Endocrinology，138，4410-4415，1997)。
由于臨床上用多巴胺激動(dòng)劑進(jìn)行治療未能降低乳腺瘤的進(jìn)展，長久以來，PRL被認(rèn)為在人乳腺癌中扮演了一個(gè)微不足道的角色(MANNI等，Breast Cancer Res.Treat.，14，289-298，1989)。然而，多巴胺激動(dòng)劑不能靶向于垂體外PRL的合成，這種合成目前看來在這些腫瘤增生現(xiàn)象中至少與循環(huán)的、垂體分泌的PRL同等重要。開發(fā)能與野生型促乳素(WT-PRL)競爭結(jié)合受體、但不能引發(fā)下游信號途徑的PRLR拮抗劑，看來是一種阻止或至少減少PRL誘導(dǎo)的腫瘤增生的替代策略，所述PRL誘導(dǎo)的腫瘤增生可能牽涉乳腺癌以及前列腺增生等疾病(GOFFIN等，Mol.Cell.Endocrinol.，151，79-87，1999)。雖然有報(bào)道說生長激素(GH)的類似物，如G120K-hGH，可以拮抗PRLR(GOFFIN等，Endocrino.，1999)，這些類似物也可以拮抗GH的受體(GHR)。由于這種靶目標(biāo)的二元性可能不適用于治療，所以引發(fā)了特異靶向PRLR(而不靶向GHR)的拮抗劑研究。
發(fā)明人先前鑒定、定位并表征了該激素上的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，稱為結(jié)合位點(diǎn)1和2，并提出了順序均二聚化活化PRLR的模型(GOFFIN等，Endocr.Rev.，17，385-410，1996)。
基于這些數(shù)據(jù)，發(fā)明人通過在人PRL(hPRL)結(jié)合位點(diǎn)2內(nèi)引入空間位阻突變，設(shè)計(jì)了第一代人促乳素受體(hPRLR)拮抗劑，從而防止了該區(qū)域與PRLR分子的有效結(jié)合(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，271，16573-16579，1996)。在這些類似物中稱作G129R-hPRL的一個(gè)類似物中，甘氨酸129(屬于位點(diǎn)2)被精氨酸所取代，這產(chǎn)生了所期望的空間位阻(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，271，16573-16579，1996；GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994)。
在某些生物測定實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人證明了該hPRL突變體不再能夠激活PRLR，推測可能是因?yàn)槭荏w二聚作用受到了破壞，因此它發(fā)揮了拮抗劑的作用。這些特性首先在涉及人或大鼠PRLR激活響應(yīng)PRL的螢光素酶報(bào)告基因的生物測定中被證實(shí)(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，271，16573-16579，1996)，其次在不同人乳腺癌細(xì)胞系中信號通路的激活和增殖中被證實(shí)(LLOVERA等，Oncogene，19，4695-4705，2000)。
然而，因其親和力降低了10倍，有效的拮抗作用需要該類似物以與WT-hPRL(10∶1至50∶1)相比明顯過量的摩爾數(shù)使用。另外，在更靈敏的生物測定中，例如標(biāo)準(zhǔn)大鼠Nb2細(xì)胞增殖生物測定，G129R-hPRL不能發(fā)揮出任何拮抗活性(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994)，并發(fā)揮了微弱的激動(dòng)劑活性，當(dāng)濃度高于hPRL時(shí)展示了全部的活性。發(fā)明人在體外通過采用其他的增殖實(shí)驗(yàn)(用編碼hPRLR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞)，以及在體內(nèi)在表達(dá)G129R-hPRL類似物的轉(zhuǎn)基因鼠中證實(shí)了G129R-hPRL所殘留的激動(dòng)劑活性其中PRLR缺失型小鼠是不育的，并且不能發(fā)育出正常的乳腺(ORMANDY等，Genes Dev.，11，167-178，1997)，而表達(dá)G129R-hPRL類似物的小鼠不具有任何生殖缺陷，并且可以成功地分泌乳汁，這清楚表明，在體內(nèi)，G129R-hPRL不能消除PRL介導(dǎo)的作用。
這些數(shù)據(jù)清楚地表明1)在結(jié)合位點(diǎn)2內(nèi)引入空間位阻突變(G129R突變)改變了PRL的生物學(xué)特性，其結(jié)果是在某些類似的(人PRLR介導(dǎo)的)生物測定實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了拮抗特性，2)然而，這些突變不能完全防止受體的二聚作用，因?yàn)樵诟舾械臏y定中，以及在轉(zhuǎn)基因鼠中，拮抗特性被G129R-hPRL的內(nèi)在殘留的激動(dòng)活性所取代。
這樣，后者不能在治療中用作純促乳素受體拮抗劑，因?yàn)樗赡軙?huì)有與對拮抗劑所期望的相反的作用。
發(fā)明人已著手開發(fā)更有效的hPRLR拮抗劑。他們先研究了hPRL的N-末端尾部在其與PRLR結(jié)合中的潛在作用。他們已經(jīng)設(shè)計(jì)了hPRL中的N-末端重復(fù)缺失，包括去除頭9個(gè)殘基至頭14個(gè)殘基；野生型hPRL和hGH的N-末端序列以及hPRL的缺失突變體于

圖1所示。
圖1的圖例頂部對齊的PRL(SEQ ID No1)和GH(SEQ ID No2)N-末端序列；PRL中N-末端長了9個(gè)殘基，包括Cys4和Cys11之間的二硫鍵。箭頭指示了由同源性模型所預(yù)測的推測的螺旋1。
底部遞增的hPRL N-末端缺失。頭9個(gè)殘基(Δ1-9-hPRL)的缺失模擬了hGH的N-末端，而頭14個(gè)殘基的缺失(Δ1-14-hPRL)去掉了完整的N-末端尾部。
他們發(fā)現(xiàn)，hPRL頭9個(gè)殘基的缺失(Δ1-9-hPRL)輕微地加強(qiáng)了與PRLR的親合力，導(dǎo)致了螢光素酶分析實(shí)驗(yàn)中與野生型hPRL(WThPRL)相比最大活性增加，然而頭14個(gè)殘基的缺失(Δ1-14-hPRL)卻導(dǎo)致了親和力和最大活性的降低(Endocrine Society 82ndAnnualMeeting，Toronto，June 21-24 2000，Abstract 613)。
發(fā)明人已著手測試去除G129R-hPRL類似物的N-末端對其親合力以及拮抗活性的影響。因而，他們通過去除頭9個(gè)殘基(突變體Δ1-9-hPRL)和去除頭14個(gè)殘基(突變體Δ1-14-hPRL)設(shè)計(jì)了G129R-hPRL的兩種N-末端缺失。
發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)，兩種突變均徹底清除了G129R-hPRL所殘留的激動(dòng)劑活性。
不受理論的限制，但可以設(shè)想這些N-末端的缺失損害了Cys4和Cys11之間二硫橋的形成，并且其他防止所述二硫橋形成的突變可能也具有降低所殘留的激動(dòng)劑活性的有利效果。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物促乳素受體的拮抗劑，其中所述拮抗劑是哺乳動(dòng)物促乳素的變體，它具有下述突變a)在14個(gè)N-末端氨基酸范圍內(nèi)的突變或者系列突變，其中所述突變或者系列突變可防止Cys4和Cys11之間二硫橋的形成，和b)在促乳素結(jié)合位點(diǎn)2內(nèi)的空間位阻突變或者系列突變。
破壞Cys4-Cys11二硫橋的形成的突變a)包括例如包括Cys4和/或Cys11的缺失，或Cys4和/或Cys11被半胱氨酸之外的氨基酸替代。
突變b)包括特別是PRL結(jié)合位點(diǎn)2中的小氨基酸被大的和/或帶電的氨基酸的任何替代，以引入空間位阻。這些突變的例子是例如用殘基諸如Tyr，Phe，Asp，Glu，Arg，Lys或Trp，優(yōu)選Arg，Lys或Trp替代Gln122，Leu125，Ser26，Ala22或Gly129中的至少一個(gè)殘基，優(yōu)選Ala22，更優(yōu)選Gly129。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，突變a)包括缺失PRL的至少4個(gè)N-末端殘基，優(yōu)選PRL的至少9個(gè)N-末端殘基。
當(dāng)N-末端的缺失短于11個(gè)氨基酸時(shí)，突變a)可進(jìn)一步包括用除半胱氨酸以外的其他氨基酸替代Cys11殘基。這通過避免因游離SH基團(tuán)的存在而導(dǎo)致的聚集，進(jìn)一步使得變體的純化變得更為容易。
本發(fā)明優(yōu)選的PRL變體是包括如下突變的變體-缺失至少9個(gè)N-末端殘基，最多14個(gè)N-末端殘基；和-G129R替換。
有益的是，本發(fā)明的變體是人促乳素(hPRL)變體。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明PRL變體的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可用公知的重組DNA技術(shù)和/或化學(xué)DNA合成法獲得。這些方法也可用于向天然存在的DNA序列引入所期望的突變。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的重組DNA結(jié)構(gòu)，例如表達(dá)盒(expression cassettes)，其中所述多核苷酸連接了允許調(diào)節(jié)其在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的適當(dāng)?shù)目刂菩蛄校⑶疫€提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的重組載體。
這些重組DNA結(jié)構(gòu)可以采用公知的重組DNA技術(shù)和基因工程技術(shù)獲得并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
本發(fā)明還包括真核或原核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞被編碼本發(fā)明PRL變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的PRL變體可通過在適于其表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含含有編碼所述PRL變體的核苷酸序列的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述變體而獲得。
本發(fā)明還提供了用編碼本發(fā)明PRL變體的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的適當(dāng)方法例如公開于Manipulating the Mouse Embryo，第二版.，作者HOGAN等，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1994年；Transgenic Animal Technology，由C.PINKERT編輯，Academic PressInc.，1994年；Gene TargetingA Practical Approach，由A.L.JOYNER編輯，Oxford University Press，1995年；Strategies inTransgenic Animal Science，由G.M.MONASTERSKY和J.M.ROBL編輯，ASM Press，1995年；Mouse GeneticsConcepts andApplications，作者Lee M.SILVER，Oxford University Press，1995年。
本發(fā)明還涉及一種治療組合物，其包括本發(fā)明的PRL變體，或者編碼所述PRL變體的多核苷酸，可選地，與適當(dāng)?shù)妮d體和/或賦型劑相混合。
舉例來說，本發(fā)明的PRL變體可進(jìn)一步與一種或多種化學(xué)基團(tuán)相連，以增加它們的分子量。適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)的例子包括多元醇，如聚乙二醇(PEG)，或者異源多肽，優(yōu)選水溶性多肽，例如血清白蛋白或其片段。
本發(fā)明的治療組合物可用作PRLR拮抗劑，特別是用于治療或預(yù)防涉及PRLR介導(dǎo)的作用的疾病，例如在PRL靶組織(乳房、前列腺、肝、垂體、淋巴細(xì)胞)中包括任何形式良性或惡性腫瘤(增生、發(fā)育異常、瘤形成、腺瘤、癌)的腫瘤增生，自身免疫疾病(紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，高促乳素血癥，有代表性的是，因PRLR過度刺激所導(dǎo)致的任何疾病(乳腺肥大、生殖性疾病)(BOLE-FEYSOT等，Endocr.Rev.，1998)。
本發(fā)明治療組合物可通過各種不同途徑給藥它們可系統(tǒng)或單獨(dú)使用。優(yōu)選的用藥途徑是腸胃外途徑，包括，例如肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)，或者局部的腫瘤內(nèi)注射。
也可采同口服途徑，條件是該組合物呈適于口服給藥的形式，能夠保護(hù)有效成分免受胃腸酶的影響。
在本發(fā)明所述治療組合物包括編碼本發(fā)明PRL變體的多核苷酸的情況下，所述核苷酸通常插入表達(dá)盒中，使其可以在靶器官或組織中表達(dá)。
表達(dá)盒可以以裸露的DNA形式直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞，或者置于適當(dāng)?shù)妮d體中，例如病毒載體，如，源自腺病毒的載體。
基因轉(zhuǎn)移可在從待治療的對象身上取出的細(xì)胞上離體進(jìn)行，然后所述細(xì)胞再重新植入該治療對象體內(nèi)，或者可以通過直接將該核酸給予該治療對象而進(jìn)行。
對轉(zhuǎn)移方法和/或載體的選擇取決于靶器官或組織，和/或取決于想要短時(shí)間表達(dá)(短暫表達(dá))還是更穩(wěn)定的表達(dá)。
由于本發(fā)明的PRL變體與野生型PRL相比具有更低的PRL受體親和力，所以選擇給藥量以提供與血液和/或靶組織中的內(nèi)源性PRL相比大量過量的PRL變體。另一方面，因?yàn)楸景l(fā)明的PRL變體缺少殘留的激動(dòng)劑活性，故可以采用高劑量，而沒有出現(xiàn)所不期望的激動(dòng)劑活性的危險(xiǎn)。在大多數(shù)情況下，PRL變體的量為導(dǎo)致與內(nèi)源性PRL相比10-100倍過量為宜。如果需要，可以給予導(dǎo)致比內(nèi)源性的多1000倍或更多的量的PRL變體。
本發(fā)明可由下述附加的記載更進(jìn)一步地舉例說明，并參照舉例說明本發(fā)明hPRL拮抗劑的特性的實(shí)施例?？梢岳斫?，這些實(shí)施例的給出，僅用于舉例說明本發(fā)明，而不對其構(gòu)成任何形式的限制。
實(shí)施例1hPRL類似物的產(chǎn)生和純化激素類本研究中所使用的所有PRL(野生型和突變體形式)均通過重組技術(shù)產(chǎn)生WT hPRL，結(jié)合位點(diǎn)2類似物G129R-hPRL(用Arg替換Gly129)，單個(gè)N-末端缺失突變體(Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL，Δ1-11-hPRL，Δ1-12-hPRL，Δ1-13-hPRL，Δ1-14-hPRL)，在Δ1-9-hPRL或Δ1-14-hPRL中引入了突變G129R的雙重突變體(產(chǎn)生了Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-PRL類似物)。
突變的hPRL表達(dá)載體的構(gòu)建N-末端缺失構(gòu)建以質(zhì)粒pT7L-hPRL(PARIS等，Biotechnol.Appl.Biochem.，12，436-449，1990)作為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)構(gòu)建編碼Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL，Δ1-11-hPRL，Δ1-12-hPRL，Δ1-13-hPRL和Δ1-14-hPRL類似物的表達(dá)質(zhì)粒。5′端引物序列對應(yīng)于缺乏9個(gè)(Δ1-9-hPRL)至14個(gè)(Δ1-14-hPRL)N-末端密碼子的hPRL cDNA的5′端序列。將具有ATG密碼子(甲硫氨酸起始密碼子)的獨(dú)特的NdeI限制性位點(diǎn)(CATATG)插入到5′引物中。將編碼Cys11的TGC密碼子突變成編碼絲氨酸的TCC。
5′端引物序列如下(5′到3′)Δ1-9(SEQ ID No3)GGCATATGCGATCCCAGGTGACCCTTCGΔ1-10(SEQ ID No4)GGCATATGTCCCAGGTGACCCTTCGAGΔ1-11(SEQ ID No5)GGCATATGCAGGTGACCCTTCGAGACCΔ1-12(SEQ ID No6)GGCATATGGTGACCCTTCGAGACCTGTTΔ1-13(SEQ ID No7)GGCATATGACCCTTCGAGACCTGTTTGΔ1-14(SEQ ID No8)GGCATATGCTTCGAGACCTGTTTGACC對于所有的類似物，其3′端引物是相同的；它對應(yīng)于hPRL CDNA非編碼區(qū)的位于獨(dú)特的HindIII限制性位點(diǎn)3′端的序列(SEQ ID No9)5’CTGTTACACCCACGCATGG3’。
PCR反應(yīng)以如下方式進(jìn)行200μM dNTP；45μM MgCl2，1.5μlTaq聚合酶(5u/μl)，PCR緩沖液，10ng模板(質(zhì)粒pT7L-hPRL)，每種引物20pmoles。PCR進(jìn)行25個(gè)循環(huán)94℃(30sec)，56℃(30sec)，72℃(1min)。將PCR產(chǎn)物亞克隆到TA克隆載體(pCR II.1)上，使用NdeI和HindIII消化重組TA質(zhì)粒，并將純化的插入序列連接到使用同樣限制性內(nèi)切酶線性化的pT7L質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化后，分析大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)菌落的DNA成分；提取并消化質(zhì)粒來證實(shí)預(yù)期插入序列的存在，然后測序來核實(shí)預(yù)期的突變。
蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和純化在1升大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)物中過量表達(dá)重組體WT hPRL和hPRL類似物，并如前所述進(jìn)行純化(PARIS等，Biotechnol. Appl.Biochem.，12，436-449，1990；GOFFIN等，Mol.Endocrinol.，6，1381-1392，1992)。簡而言之，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)物的OD600達(dá)到約0.9時(shí)，使用2mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)其過量表達(dá)4h(4h后OD600約2.5)。使用細(xì)胞粉碎機(jī)(Basic Z，Cell D，Roquemaure，法國)裂解細(xì)胞。蛋白作為不能溶解的包含體被過量表達(dá)，將該包含體溶解于8M的尿素中(55℃5分鐘，然后室溫2h)，并通過對50mMNH4HCO3，pH 8持續(xù)透析重新折疊。
使用購于AMERSHAM-PHARMACIA BIOTECH(Orsay，法國)的層析設(shè)備(GRADIFRAC)和柱子(HITRAP Q SEPHAROSE，SEPHACRYL S200 High Resolution)純化蛋白。
采用了兩種備選方案。先將透析過的蛋白離心至少60分鐘(9000xg)以去除聚集物，然后將清澈的上清液混合物裝添到陰離子交換柱HITRAP Q(在pH 8的50mM NH4HCO3中平衡的)上。PRLs在兩個(gè)峰中被洗脫，一個(gè)主峰在150mM NaCl濃度處洗脫，一個(gè)小峰在較高的鹽濃度(～200mM)洗脫。對這些級分的分析型凝膠過濾表明主峰對應(yīng)于單體PRL，而小峰則包含了各種不同的多聚體形式。或者，使用YM10 MINIPLATE生物濃縮器(MILLIPORE CORP.-AMICON，Bedford，MA；流速500ml/min)，通過切線流超濾法來濃縮重新折疊的(透析的)蛋白，然后離心(10min，9000xg)濃縮液以去除超濾中形成的聚積物。使用50mM NH4HCO3，150mM NaCl，pH 8中平衡過的具具有高分辨率的SEPHACRYL S-200柱子，通過凝膠過濾層析來純化上清液。此第二種方案常因?yàn)樵诔瑸V步驟之中會(huì)產(chǎn)生較高的蛋白沉淀而導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。對應(yīng)于單體hPRLs的級分(從分子篩或陰離子交換柱中洗脫)被合并起來，定量，等分，并保藏于-20℃。
在還原性(β-巰基乙醇)或非還原性條件下，使用15％SDS-PAGE來估計(jì)蛋白的大小和純度。以BSA作為參考，通過Bradford蛋白測定法(BIO-RAD Laboratories，Inc.，Ivry-sur-Seine，法國)來確定蛋白級分的量。
雙重突變體通過將pT7L-G129R-hPRL質(zhì)粒(包含G129R突變)(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994)中的EcoRI-BglII片段替換成pT7L-Δ1-9-hPRL和pT7L-Δ1-14-hPRL表達(dá)載體中相應(yīng)的EcoRI-BglII片段，來構(gòu)建編碼Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL類似物的表達(dá)質(zhì)粒。分析獲得的克隆來確認(rèn)插入片段的存在，然后通過測序以核實(shí)預(yù)期的突變。采用上面描述的方法來用BL21(D3)細(xì)菌表達(dá)類似物并純化蛋白。
所有在細(xì)菌中作為包含體產(chǎn)生的hPRL突變體都能正確地折疊，這表明各種不同的突變體并沒有干擾蛋白的整體構(gòu)象。這一點(diǎn)通過采用循環(huán)二色性(未給出)分析它們二級結(jié)構(gòu)的成分得到了證實(shí)。突變的hPRL和野生型hPRL之間唯一重復(fù)的差別是N-末端的缺失傾向于增加蛋白折疊后所觀察到的單體/多聚體的比率。據(jù)信，兩個(gè)N-末端半胱氨酸(Cys4-Cys11)的去除阻止了負(fù)責(zé)這些殘基之間分子間二硫鍵鍵合的共價(jià)多聚體形成。
實(shí)施例2HPRL類似物對人PRLR的親和力結(jié)合研究通過各種不同的hPRL類似物競爭[125I]-hPRL以結(jié)合到這一受體上的能力來評估它們對人PRLR的親和力。根據(jù)先前描述過的步驟(KINET等，J.Biol.Chem.，274，26033-26043，1999)，使用HL5細(xì)胞(表達(dá)人PRLR)的細(xì)胞勻漿來確定結(jié)合親和力。
簡言之，使用IODOGEN碘化hPRL，其比活性在40-50Ci/μg之間。在30,000cpm[125I]-hPRL和遞增濃度的未被標(biāo)記的競爭物(野生的或突變的hPRL)存在的條件下，使用150-300μg細(xì)胞勻漿蛋白，室溫過夜，實(shí)施結(jié)合試驗(yàn)。
通過Scatchard分析計(jì)算的WT hPRL對人PRLR(使用HL5細(xì)胞勻漿)的親和力為Kd值3.4(±1.3)×10-10M(KINET等，J.Biol.Chem.，1999)。
單個(gè)N-末端hPRL突變體結(jié)合試驗(yàn)。
以從競爭曲線(S型線性部分的回歸)計(jì)算的hPRL類似物的IC50和WT hPRL的IC50的比率，來計(jì)算hPRL類似物的相對結(jié)合親和力。圖2A中所展現(xiàn)的結(jié)果是至少3個(gè)獨(dú)立的一式兩份進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的代表。
這些結(jié)果表明，頭10、11、12或13個(gè)殘基的缺失不影響hPRL與其受體的親和力，但用Δ1-9-hPRL獲得的曲線與野生型相比輕微地向左移，表明親和力有20％的小的增加，然而Δ1-14-hPRL的曲線向右移，表明親和力降低了2-3倍(40％相對親和力)。
包含G129R的突變體的結(jié)合試驗(yàn)包含有Gly129→Arg突變的3個(gè)類似物獲得的典型的競爭曲線顯示于圖2B中野生型hPRL(-●-)；單突變體G129R-hPRL(-◆-)；雙重突變體Δ1-9-G129R-hPRL(-■-)；雙重突變體Δ1-14-G129R-hPRL(-▲-)。
與野生型hPRL相比，這三個(gè)曲線向右移動(dòng)了～1數(shù)量級，表明對受體的親和力降低了10倍。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)平均來看，對于Δ1-9-G129R來說IC50為166±47ng/ml，對于Δ1-14-G129R來說是187±49ng/ml，相比之下WT hPRL的是18±5ng/ml。與G129-hPRL(單突變體)相比，沒有一個(gè)N-末端缺失提高了親和力。
實(shí)施例3HPRL類似物的生物活性實(shí)驗(yàn)方案Nb2細(xì)胞增殖測定用于催乳激素類的參照生物測定是催乳激素誘導(dǎo)的大鼠Nb2淋巴瘤細(xì)胞增殖。大鼠Nb2淋巴瘤細(xì)胞獲自P.W.GOUT(Vancouver，加拿大)，用前述方法培養(yǎng)(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)。Nb2細(xì)胞常規(guī)維持于補(bǔ)加了10％HS、10％熱失活FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素以及100mMβ-巰基乙醇的RPMI 1640中。增殖測定如前敘方法進(jìn)行(TANAKA等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，51，1058-1063，1980)，并進(jìn)行了較小的修改(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)。簡要地說，在最初的一天，測定采用了96孔平板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，終體積為200μl，其中包括激素。激素刺激3天后，通過加入10μl WST-1四唑鹽(Roche，Meylan，法國)評估細(xì)胞增殖。該存活試劑被活細(xì)胞的線粒體代謝，導(dǎo)致450nm OD值(OD450)增加，OD值增加與用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器所計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)成正比(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)。該實(shí)驗(yàn)一式三份或四份，重復(fù)進(jìn)行了至少3次。
人PRLR轉(zhuǎn)錄的生物測定(HL5)HL5克隆是293 HEK成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞用編碼人PRLR和PRL-應(yīng)答報(bào)告基因的質(zhì)粒(包含編碼螢光素酶基因的序列，其處在催乳激素響應(yīng)元件(LHRE)的6重復(fù)序列的控制下，該元件為STAT5的DNA結(jié)合元件)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(KINET等，J.Biol.Chem.，274，26033-26043，1999)。
HL5克隆常規(guī)培養(yǎng)于加入了10％FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素以及700μg/ml G-418(克隆選擇)的DMEM-Nut F12培養(yǎng)基中。測定采用了96孔平板，每孔5×104細(xì)胞/100μl培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中僅含有0.5％FCS。允許細(xì)胞粘附過夜，然后每孔中加入在不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基中稀釋的100μl激素。刺激24小時(shí)后，裂解細(xì)胞(50μl裂解緩沖液)，然后計(jì)數(shù)包含于15μl細(xì)胞裂解物中的螢光素酶活性，時(shí)間為10秒(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001；KINET等，J.Biol.Chem.，274，26033-26043，1999)。為避免實(shí)驗(yàn)間的偏差，所有待比較的類似物在相同的實(shí)驗(yàn)條件下系統(tǒng)測試。在激動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，加入了待測的100μl的[2x]激素(“2x”＝與最終所需濃度相比濃縮2倍)，而在拮抗實(shí)驗(yàn)中，加入了50μl的[4x]激素類似物和50μl的[4x]WT hPRL(以獲得1μg/ml的終濃度)。
Ba/F3-hPRLR細(xì)胞增殖生物測定Ba/F3-hPRLR細(xì)胞是小鼠前-B淋巴細(xì)胞，其生長依賴于白介素-3。Ba/F3-hPRLR細(xì)胞是用編碼hPRLR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并在生長培養(yǎng)基中進(jìn)行了包括G-418處理和用hPRL替代IL-3的雙重篩選之后所獲得的。細(xì)胞用編碼hPRLR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(電穿孔)，用G-418處理后，篩選出了穩(wěn)定表達(dá)受體的群體。Ba/F3-hPRLR細(xì)胞用加入了10％熱失活FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、500-1000μg/ml G-418、以及10ng/ml WT-hPRL取代IL-3的RPMI 1640培養(yǎng)基維持。最佳的生物測定條件(細(xì)胞數(shù)、饑餓時(shí)間和介值等)以WT hPRL為配體進(jìn)行確定，并是如下條件在增殖測定之前，細(xì)胞于1％FCS RPMI培養(yǎng)基(加入添加物)中饑餓6小時(shí)，然后，分裝于96孔平板，密度為5×104細(xì)胞/孔，在相同培養(yǎng)基(排除了激素)中，終體積為100μl。在激動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，加入了100μl的[2x]激素；在拮抗實(shí)驗(yàn)中，加入50μl的[4x]用于測試拮抗特性的激素，和50μl的[4x]WT hPRL(終濃度為10ng/ml)。3天激素刺激后用10μlWST-1監(jiān)測細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)一式三份或四份至少重復(fù)了三次。
結(jié)果缺失N-末端的類似物激動(dòng)作用Nb2細(xì)胞增殖測定相應(yīng)于前邊的報(bào)道，在標(biāo)準(zhǔn)Nb2細(xì)胞增殖測定中單體hPRL誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，在1-2ng/ml作用最大。
圖3A展示了在存在濃度不斷增加的hPRL(-●-)，Δ1-9-hPRL(-□-)和Δ1-14-hPRL(-△-)的情況下細(xì)胞的增殖；圖3B展示了在存在濃度不斷增加的hPRL(-●-)，Δ1-10-hPRL(--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--)的情況下細(xì)胞的增殖。
本測試的劑量-反應(yīng)曲線在所有的突變體(Δ1-9-hPRL→Δ1-14-hPRL)和WT hPRL(EC50的范圍從0.57到0.87ng/ml)中相似，表明N-末端地缺失不會(huì)顯著地改變本測試中hPRL的促有絲分裂活性。
Ba/F3-hPRLR細(xì)胞增殖生物測定與用Nb2細(xì)胞的測定相反，采用了Ba/F3細(xì)胞的hPRLR-介導(dǎo)的增殖測定展現(xiàn)出了類似物的不同促有絲分裂活性。WT hPRL以劑量依賴的方式誘導(dǎo)了該細(xì)胞群的生長，在～10ng/ml時(shí)作用最大，這與在常規(guī)培養(yǎng)基中用10ng/ml hPRL取代IL-3所進(jìn)行的細(xì)胞篩選相關(guān)。
圖4A展示了在存在濃度不斷增加的hPRL(-●-)，Δ1-9-hPRL(-□-)和Δ1-14-hPRL(-△-)的情況下，Ba/F3細(xì)胞的增殖；圖4B展示了在存在遞增濃度的hPRL(-●-)，Δ1-10-hPRL(--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--)的情況下，Ba/F3細(xì)胞的增殖。
將用類似物Δ1-9-hPRL、Δ1-10-hPRL、Δ1-11-hPRL、Δ1-12-hPRL以及Δ1-13-hPRL得到的劑量-反應(yīng)曲線與用hPRL獲得的曲線疊加，發(fā)現(xiàn)生物活性沒有改變。相反，Δ1-14-hPRL的曲線向右移動(dòng)了＞1log，表現(xiàn)出在本測定中顯著地改變活化hPRLR的能力。只要在本測定中加入足夠的激素濃度，所有的類似物均能夠誘導(dǎo)最大水平的細(xì)胞分裂。
人PRLR轉(zhuǎn)錄生物測定(HL5)圖5展示了一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)和三個(gè)實(shí)驗(yàn)代表性的結(jié)果數(shù)據(jù)，該典型實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行，該圖描述了在存在濃度(μg/ml)不斷增加的hPRL(-●-)，Δ1-9-hPRL(-□-)，Δ1-14-hPRL(-△-)，Δ1-10-hPRL(--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--)時(shí)的hPRL的轉(zhuǎn)錄活性(以WT hPRL最大值為100％，活性與之相比得到的百分?jǐn)?shù))。
該結(jié)果表示為對螢光素酶活性的誘導(dǎo)的倍數(shù)(即以WT hPRL最大作用為100％，活性與之相比得到的百分?jǐn)?shù))。
在本測定中，類似物Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL，Δ1-11-hPRL，Δ1-12-hPRL和Δ1-13-hPRL差別不大，其曲線與WT hPRL相比向左移動(dòng)(EC50降低了約～2倍)。另外，所有這些類似物所誘導(dǎo)的最大反應(yīng)都要高于WT hPRL(120-140％)，反應(yīng)出了更強(qiáng)的激動(dòng)特性。
相反，與hPRL相比，Δ1-14-hPRL的活性要小一些，這反應(yīng)在它的劑量反應(yīng)曲線(EC50高了約3倍)及其最大活性(WT激素的60％)。
拮抗作用與其內(nèi)在的激動(dòng)活性相一致，在本研究的所有三個(gè)生物測定中(未給出數(shù)據(jù))，缺失了N-末端的突變體均未能表現(xiàn)出拮抗活性。
G129R突變體和雙重突變體所有實(shí)驗(yàn)均包括單突變體(G129R-hPRL)以及雙重突變體Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL。
Nb2細(xì)胞增殖測定激動(dòng)作用。圖6展示了細(xì)胞的增殖，該增殖發(fā)生在不含有hPRL(□)，以及存在濃度遞增的純化的WT hPRL(■)，G129R-hPRL(■)，Δ1-9-G129R-hPRL 和Δ1-14-G129R-hPRL 的情況下。
WT hPRL在1-2ng/ml誘導(dǎo)最大增殖，而G129R-hPRL的劑量依賴型的促有絲分裂效應(yīng)移至高濃度，但是達(dá)到(亞)最大增殖。相反，兩個(gè)雙重N-末端缺失型突變體Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL卻沒有明顯的激動(dòng)活性。
已有報(bào)道(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994；BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)，與WThPRL相比，獲自G129R-hPRL的激動(dòng)作用劑量-反應(yīng)曲線向右移動(dòng)了超過兩個(gè)log單位，在約0.5至1μg/ml達(dá)到最大效應(yīng)。有趣的是，當(dāng)去掉G129R-hPRL的N-末端尾部之后(即在Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL類似物中的情形)，該激動(dòng)活性被完全去除，并且，即使?jié)舛缺葘?dǎo)致WT hPRL最大活性的濃度(1ng/ml比10μg/ml)高多達(dá)4個(gè)數(shù)量級也仍有此現(xiàn)象。
人PRLR轉(zhuǎn)錄生物測定(HL5)激動(dòng)作用。圖7A展示了LHRE-螢光素酶報(bào)告基因在存在濃度不斷增加的WT hPRL(■)，以及含有G129R的三個(gè)類似物G129R-hPRL G129R-hPRL Δ1-9-G129R-hPRL 和Δ1-14-G129R-hPRL 的情況下的活化。
本測試中，G129R-hPRL的激動(dòng)活性急劇下降，達(dá)到的最大水平＜2％hPRL活性。類似的，沒有雙重突變體誘導(dǎo)可檢測的螢光素酶活性，即使在極高(最高至50μg/ml)濃度下測試也是如此。
拮抗作用結(jié)果顯示于圖7BΔ1-14-G129R-hPRL(-■-)，Δ1-9-G129R-hPRL(-▲-)，G129R-hPRL(-◆-)。
與它們對hPRLR的相對親和力一致，三種類似物的拮抗特性很相似，但重復(fù)顯示了如下的活性順序G129R-hPRL＞Δ1-9-G129R-hPRL＞Δ1-14-G129R-hPRL。
Ba/F3-hPRLR細(xì)胞增殖生物測定激動(dòng)作用圖8A展示了在純化的WT hPRL(■)，G129R-hPRL Δ1-9-G129R-hPRL 以及Δ1-14-G129R-hPRL 的濃度不斷增加的情況下細(xì)胞的增殖。
在10ng/ml獲得WT hPRL的最大作用。G129R-hPRL誘導(dǎo)了次最大增殖，其劑量反應(yīng)曲線向高濃度移動(dòng)了2log。相反的，雙重突變體(Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL)沒有誘導(dǎo)明顯的增殖。
如在Nb2中的測定，獲自G129R-hPRL的曲線向右移動(dòng)了約2log，達(dá)到了與hPRL相比的次最高水平(50-80％)。在高濃度下，hPRL和G129R-hPRL表現(xiàn)出了鐘形的曲線，這是使用這些配體時(shí)典型的觀測結(jié)果(KINET等，Recent Res.Devel.Endocrinol.，2，1-24，2001)。Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL均沒有表現(xiàn)出任何的激動(dòng)活性，即使其濃度高達(dá)10μg/ml。
拮抗作用。通過將遞增濃度的類似物與固定濃度的WT hPRL(10ng/ml)競爭，進(jìn)行拮抗測定。圖8B展示了細(xì)胞的增殖，其中Δ1-9-G129R-hPRL(-■-)，Δ1-14-G129R-hPRL(-▲-)，G129R-hPRL(-◆-)濃度不斷升高，與固定濃度的WT hPRL競爭。
用Arg替代Gly129的三種突變體(G129R-hPRL，Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL)表現(xiàn)出了類似的拮抗活性，意味著與WT hPRL產(chǎn)生有效的競爭需要所用的類似物的摩爾數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量(10至50倍)，而不管N-末端是否缺失。至于雙重突變體，對WT hPRL所誘導(dǎo)的活性的競爭性抑制大概反應(yīng)了拮抗作用的真實(shí)現(xiàn)象，因?yàn)檫@些類似物均沒有內(nèi)在的激動(dòng)作用(圖8A)。相反，由于G129R-hPRL表現(xiàn)出了明顯的激動(dòng)活性，故在競爭測定中所觀察到的抑制效果大概反應(yīng)了一種真實(shí)的拮抗和自拮抗現(xiàn)象的結(jié)合(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994；BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001，KINET等，Recent Res.Devel.Endocrinol.，2，1-24，2001)。
實(shí)施例4在野生型Balb-C/J小鼠的肝臟中，Δ1-9-G129R抑制了PRL-誘導(dǎo)的MAPK活化用10μg hPRL或不同比率的hPRL與拮抗劑(G129R-hPRL或Δ1-9-G129R-hPRL)處理8周大的野生型balb-c/J雌鼠。在腹膜內(nèi)(IP)注射激素后六十分鐘，處死小鼠，迅速收集它們的肝臟，解剖并勻漿化，然后用常規(guī)方法制備細(xì)胞溶解物。取70μg溶解物加樣到10％的SDS-PAGE上，接下來液體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下，用5％脫脂乳封閉膜1小時(shí)，充分洗滌后，用一級單克隆抗體和它們過夜溫育，該單抗特異針對Erk 1和Erk 2 MAP激酶的活性形式(在蘇氨酸202和酪氨酸204上磷酸化)。充分洗滌后，使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二級抗鼠抗體溫育膜1h。通過增強(qiáng)了的化學(xué)發(fā)光(ECL)和其后的放射自顯影顯示出免疫印跡。
用脫膜緩沖液對膜進(jìn)行去雜交，50℃，30min，并在洗滌和重新封閉后，用多克隆抗-Erk1/Erk2抗體重新探測，該抗體能同時(shí)識(shí)別活性和無活性形式的Erk1和Erk2 MAP激酶。接下來，在與HRP-偶聯(lián)的抗兔抗體溫育后顯示印跡。
結(jié)果如圖9所示A抗-MAPK印跡上圖(MAPK-P)磷酸化的MAPK；底圖總MAPK(MAPK)BMAPK-P印跡(上圖)的光密度定量這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示了，通過IP注射10μg hPRL而誘導(dǎo)的MAP激酶的活化被50倍摩爾過量的Δ1-9G129R-hPRL拮抗劑所抑制。相反，即使在更高摩爾比率(100倍)，G129R-hPRL也不能降低MAPK的活化，甚至顯示出對它有增強(qiáng)作用。
實(shí)施例5在野生型balb-c/J小鼠的可分泌乳汁的乳腺中，Δ1-9-G129R抑制PRL-誘導(dǎo)的STAT3和STAT5的活化拮抗作用用200μg溴代隱亭(bromocriptine)處理(IP)8周大且分泌乳汁(10-12天)的野生型balb-c/J雌鼠，以降低內(nèi)源PRL的循環(huán)水平(溴代隱亭是一種多巴胺類似物，是腦垂體促乳素分泌的天然抑制劑)。5h后，僅用10μg hPRL或者用1∶100的hPRLΔ1-9G129R-hPRL處理(IP)小鼠。然后處死小鼠；取出第四個(gè)乳腺(右邊和左邊)，并用常規(guī)方法合并和勻漿化。將總細(xì)胞溶解物(2mg)用于免疫沉淀(4℃，旋轉(zhuǎn)過夜)，其中分別使用抗-STAT5的多克隆抗體或抗-STAT3的多克隆抗體。然后，用20ul蛋白A瓊脂糖漿在旋轉(zhuǎn)條件下保溫1小時(shí)，來捕獲免疫復(fù)合物。通過離心沉淀蛋白A復(fù)合物，洗滌沉淀顆粒，然后在還原性樣品緩沖液中煮沸5min。在7.5％SDS-PAGE上電泳，隨后按實(shí)施例4所描述的方法作western印跡分析免疫沉淀的樣品。
該實(shí)驗(yàn)中所使用的一級抗體(多克隆)特異識(shí)別Stat5和Stat3的活化形式(分別是抗磷酸化的STAT5和抗磷酸化的STAT3)。解雜交后，用可識(shí)別總(磷酸化和非磷酸化形式)Stat5和Stat3的多克隆抗體重新探測膜。
結(jié)果如圖10所示A抗-STAT印跡上圖(P-Stat5和P-Stat3)磷酸化的Stat5和磷酸化的Stat3；下圖(Stat5和Stat3)總的Stat5和Stat3。
B抗磷酸化STAT印跡(上圖)的光密度定量結(jié)果表明，加入100倍摩爾過量的Δ1-9G129R-hPRL可抑制在分泌乳汁的乳腺中由PRL誘導(dǎo)的STAT3和STAT5的活化。
實(shí)施例6在轉(zhuǎn)入人PRL、大鼠PRL和G129R-人PRL的轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺中，Δ1-9-G129R抑制PRL-誘導(dǎo)的MAPK組成型活化
MAPK活化的生物測定激動(dòng)劑(PRL；G129R-hPRL)該體內(nèi)生物測定使用了表達(dá)處在遍在金屬硫蛋白啟動(dòng)子調(diào)控下的人PRL或G129R-hPRL(Tg Met-hPRL和Tg Met-G129R)、或者表達(dá)處在前列腺特異性probasin啟動(dòng)子調(diào)控下的大鼠PRL(Tg Prob-rPRL)的轉(zhuǎn)基因小鼠(雄性)。
處死1年大的轉(zhuǎn)基因雄鼠；取出泌尿生殖道，在顯微鏡下解剖前列腺，將腹側(cè)葉與背外側(cè)葉分離開。然后將背外側(cè)葉勻漿化，按常規(guī)的方法制備細(xì)胞溶解物。如實(shí)施例4中描述的肝臟那樣，取70ug溶解產(chǎn)物加載到10％SDS-PAGE上來檢測Erk 1和Erk 2 MAPK的自發(fā)活化。
結(jié)果如圖11所示A抗MAPK印跡上圖(MAPK-P)磷酸化的MAPK；下圖(MAPK)總MAPK。
BMAPK-P印跡(上圖)的光密度定量該實(shí)驗(yàn)表明與未轉(zhuǎn)基因的同窩出生的小鼠(野生型)相比，在所有轉(zhuǎn)基因小鼠系背外側(cè)前列腺葉中，MAP激酶被組成型活化。這表明前列腺中局部產(chǎn)生PRL導(dǎo)致了該組織中MAPK的活化。
此外，圖11顯示，G129R-hPRL還展示出與野生型促乳素相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)激動(dòng)活性。
拮抗劑(Δ1-9G129R-hPRL)向7個(gè)月大的雄鼠中注射(IP)1mgΔ1-9G129R-hPRL 60分鐘，這些鼠是在前列腺特異性probasin啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)大鼠PRL的轉(zhuǎn)基因鼠譜系來源的。然后處死這些鼠。取出泌尿生殖道，在顯微鏡下解剖前列腺，以將腹側(cè)葉與背外側(cè)葉相分離。將這些組織勻漿化并按常規(guī)的方法制備細(xì)胞溶解物。取70vg裂解物加樣到10％SDS-PAGE上，接下來按實(shí)施例4中所描述的那樣進(jìn)行western印跡。
結(jié)果如圖12所示
A抗-MAPK印跡上圖(MAPK-P)存在(+)或不存在(-)Δ1-9G129R-hPRL突變體的前列腺腹側(cè)和背外側(cè)葉中的磷酸化MAPK；下圖(MAPK)相同樣品中總的MAPK。
B抗-磷酸化MAPK-P印跡(上圖)的光密度定量該實(shí)驗(yàn)表明，通過注射Δ1-9G129R-hPRL在兩個(gè)葉中抑制了前列腺中PRL局部表達(dá)引起的MAP激酶的組成型激活(自分泌-旁分泌效應(yīng)，見圖11)。
序列表<110> INSERMGOFFIN，VincentBERNICHTEIN，SophieKELLY，Paul A<120> 哺乳動(dòng)物促乳素變體<130> MJPbv598/62<160> 9<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 38<212> PRT<213> 人<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(9)<223> delta 1-9 hPRL缺失<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(10)<223> delta 1-10 hPRL缺失<220>
<221> VARIANT<222> (11)..(11)<223> delta 1-9 hPRL和delta 1-10 hPRL用Ser取代Cys<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(11)<223> delta 1-11 hPRL缺失<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(12)<223> delta 1-12 hPRL缺失<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(13)<223> delta 1-13 hPRL缺失<220>
<221> VARIANT<222> (1)..(14)<223> delta 1-14 hPRL缺失
<400> 1Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg1 5 10 15Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu20 25 30Ser Ser Glu Met Phe Ser35<210> 2<211> 29<212> PRT<213> 人<400> 2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln20 25<210> 3<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 3ggcatatgcg atcccaggtg acccttcg28<210> 4<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 4ggcatatgtc ccaggtgacc cttcgag 27<210> 5<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 5
ggcatatgca ggtgaccctt cgagacc 27<210> 6<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 6ggcatatggt gacccttcga gacctgtt28<210> 7<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 7ggcatatgac ccttcgagac ctgtttg 27<210> 8<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 8ggcatatgct tcgagacctg tttgacc 27<210> 9<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物<400> 9ctgttacacc cacgcatgg 19
權(quán)利要求
1.哺乳動(dòng)物促乳素受體的拮抗劑，其中所述拮抗劑是哺乳動(dòng)物促乳素的變體，該變體具有下述突變a)在14個(gè)N-末端氨基酸內(nèi)的突變或者系列突變，其中所述突變或系列突變防止形成Cys4和Cys11之間的二硫鍵，和b)在促乳素結(jié)合位點(diǎn)2內(nèi)的空間位阻突變或者系列突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的促乳素變體，其中突變a)包括促乳素的至少4個(gè)N-末端殘基的缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的促乳素變體，其中突變a)包括促乳素的至少9個(gè)N-末端殘基的缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的促乳素變體，具有下述突變·至少9個(gè)N-末端殘基、最多14個(gè)N-末端殘基的缺失；和·G129R替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的促乳素變體，該變體是人促乳素變體。
6.編碼權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)的促乳素變體的多核苷酸。
7.包含權(quán)利要求6的多核苷酸的表達(dá)盒。
8.包含權(quán)利要求6的多核苷酸的重組載體。
9.用權(quán)利要求6的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
10.用權(quán)利要求6的多核苷酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。
11.包含權(quán)利要求6的多核苷酸的治療組合物。
12.權(quán)利要求1-5之任一項(xiàng)的促乳素變體或權(quán)利要求6的多核苷酸用于獲得治療組合物的用途，該治療組合物用于治療或預(yù)防涉及PRL介導(dǎo)的效應(yīng)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物促乳素(PRL)變體，該變體在14個(gè)N－末端氨基酸內(nèi)具有突變或系列突變，以此來阻止Cys
文檔編號C12N5/10GK1628128SQ03803357
公開日2005年6月15日 申請日期2003年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月8日
發(fā)明者V·戈芬, S·貝爾尼奇坦, P·A·凱利 申請人:國家健康醫(yī)學(xué)研究所