專利名稱：重組火雞皰疹病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種重組火雞皰疹病毒(rHVT)，其包含由修飾的雞β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)啟動(dòng)子控制下的新城疫病毒(NDV)F蛋白(F基因)的cDNA。
相關(guān)技術(shù)描述新城疫是在家禽飼養(yǎng)業(yè)中最可怕的傳染性疾病之一。新城疫的發(fā)生存在包括從高死亡率至無(wú)癥狀等許多形式。因而將該毒株分類為(1)強(qiáng)毒株(高毒性)，(2)中等毒力株(中等毒性)，(3)輕型毒株(低毒性)及(4)無(wú)癥狀毒株(Alexander，D.J.In Diseases of Poultry，1997)。強(qiáng)毒株形式NDV感染的雞在幾天后就變得抑郁和昏睡，其死亡率范圍從12％至50％以上。幸存的禽類通常產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如斜頸或頭回旋痙攣。這種疾病如此可怕的原因之一是雞不管年歲如何均易感NDV，而且感染強(qiáng)毒株NDV的雞在所有年齡均表現(xiàn)出爆發(fā)性癥狀。由于NDV是高度傳染性的，任何一只雞在疾病爆發(fā)時(shí)均必須處理。養(yǎng)雞場(chǎng)應(yīng)該徹底消毒以預(yù)防進(jìn)一步感染。中等毒力病原株(中等毒性)特征在于使幼雞死亡。輕型毒力病原株(低毒性)特征在于引起輕度呼吸道感染，這些毒株多用于制備接種于幼雞的疫苗。無(wú)癥狀腸道毒株通常在無(wú)疾病表現(xiàn)的雞的胃腸道中分離得到(Alexander，1997)。新城疫既能感染雞也能感染火雞，但是在火雞中的臨床癥狀沒(méi)有在雞中那樣嚴(yán)重(Alexander，1997)。
目前，可利用活的及滅活疫苗預(yù)防新城疫的發(fā)生。這些疫苗是有效的但并非沒(méi)有缺陷。滅活疫苗必須重復(fù)接種于下蛋的育種母雞。活疫苗主要用于幼雞。然而，它不能保證這些具有高母體抗體水平的幼雞產(chǎn)生長(zhǎng)期持久的免疫。重復(fù)施用活疫苗有時(shí)對(duì)幼雞健康生長(zhǎng)不利，因?yàn)橐呙绶磻?yīng)會(huì)導(dǎo)致輕度的呼吸道疾病。因此針對(duì)家禽業(yè)需要一種有效的無(wú)副作用的，而且不需要重復(fù)接種的新型疫苗。
為符合工業(yè)需要，Sakaguchi等人(J.Virol.743217-3226，2000；Vaccine 16472-479，1998)揭示了一種重組Mark’s病病毒血清1型，其病毒基因組的US10區(qū)域具有NDV的F基因。由此獲得的重組病毒在SPF雞以及母體抗體陽(yáng)性的商業(yè)禽類中均能誘導(dǎo)抗新城疫的持續(xù)保護(hù)性免疫。
Marek’s病是家禽業(yè)的另一種嚴(yán)重疾病。針對(duì)此種疾病，火雞皰疹病毒(HVT)(Writter R.L.et al.Am.J.Vet.Res.1970，31，525-538)已經(jīng)最廣泛用作安全疫苗。
迄今為止，已經(jīng)有一些關(guān)于基于HVT的新城疫-Marek’s病二價(jià)疫苗的報(bào)道。例如，Morgan等(Avian Dis.371032-1040，1993；Vaccine11349-358，1993；Avian Dis.36858-870，1992)構(gòu)建了具有NDVF基因的重組HVT并測(cè)試了這些重組體作為新城疫疫苗的效力。Macmillan等(Vaccine14469-477，1996)構(gòu)建了表達(dá)NDV的HN和F蛋白的重組的HVTs，并測(cè)試了這些重組體的效力。在這兩種情況中，接種的SPF雞對(duì)NDV有抵抗力，但對(duì)具有高母體抗體水平的商業(yè)雞類不能產(chǎn)生令人滿意的效力。
Saitoh等將編碼NDV的F和HN蛋白的cDNA插入HVT基因組(WO99/18215)。插入的基因在CMV或RSV啟動(dòng)子的控制下。外源基因的插入位點(diǎn)是UL44和45之間或者UL45和46之間的一種最新鑒別的基因間區(qū)域。這些重組體賦予SPF雞類以及具有NDV母體抗體的雞類良好的抗NDV攻擊的保護(hù)作用。然而，這些重組體表達(dá)HN和F兩個(gè)插入基因。由于HN蛋白誘導(dǎo)血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體以使雞類免疫，因此難以區(qū)分疫苗免疫的雞與NDV感染的雞。因此，能夠誘導(dǎo)抗新城疫的足夠保護(hù)性免疫且能夠表達(dá)F蛋白基因的的重組病毒是一種更希望的疫苗。如Morgan等所述，這個(gè)目的并不易于達(dá)到，因?yàn)橹痪哂蠳DV的F基因的rHVT在雞類中不誘導(dǎo)所期望的免疫。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種重組火雞皰疹病毒，其通過(guò)插入由修飾的雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Pec啟動(dòng)子)的控制下的NDV的F蛋白的cDNA而得到修飾。rHVT在SPF雞類以及在具有高NDV母體抗體水平的商業(yè)雞類中誘導(dǎo)抗NDV的持久保護(hù)性免疫。
具體地，本發(fā)明提供了一種重組火雞皰疹病毒，其通過(guò)插入由一種啟動(dòng)子控制下的NDV F基因而得到修飾，這一啟動(dòng)子的序列為SEQID NO.1。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種新城疫-Marek’s病的二價(jià)疫苗，其主要由上述的重組火雞皰疹病毒所組成。
下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
SEQ ID NO.15’-AGTTATTAAIAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATTGGCCCGCCGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCATTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGATGCAGTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCACCCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTCTAGAGG-3’(NDV F基因)
只要編碼NDV F蛋白，則來(lái)自任何NDV毒株的任何基因均符合本發(fā)明的目的。例如Sato、Miyadera、D26、Atami、D26、Atami或Fuji以及Texas GB、B1或LaSota毒株的F基因。野毒株或任何已知DNA序列的F基因也是合適的。在這些基因當(dāng)中，來(lái)自D26的基因是一個(gè)良好實(shí)例。本發(fā)明不希望將一個(gè)額外的抗原基因摻入病毒主鏈。
(啟動(dòng)子)在本發(fā)明中，NDV F基因通過(guò)SEQ IDNO.1所述啟動(dòng)子(稱為Pec啟動(dòng)子)或其類似物控制。所述Pec啟動(dòng)子(日本未經(jīng)審查的專利出版物No.2001-188)通過(guò)缺失雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)不必要區(qū)域而產(chǎn)生。與Pec同源的啟動(dòng)子是指一種啟動(dòng)子，其活性與Pec幾乎相同，長(zhǎng)度為120-850堿基對(duì)(bp)或者更適宜的150-600bp。一種同源啟動(dòng)子可以通過(guò)在β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子中取代、缺失或添加核苷酸而產(chǎn)生。本發(fā)明使用的啟動(dòng)子可包括天然存在的或修飾的增強(qiáng)子序列。這種啟動(dòng)子例如是COA啟動(dòng)子，如SEQ IDNO.2所示。
(禽類皰疹病毒)只要對(duì)雞類無(wú)病原性，任何火雞皰疹病毒均可以用于本發(fā)明中。例如，F(xiàn)C126(ATCC VR-584B)、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1或HPRS-26毒株適于所述病毒主鏈。而在這些之中，F(xiàn)C126由于其在雞類中的安全應(yīng)用而適宜用于本發(fā)明。
(基因插入?yún)^(qū)域)已知HVT的一些非必需區(qū)域，其對(duì)病毒生長(zhǎng)是不必要的，因此適合NDV F基因插入。例如，UL43(WO 89/01040)、US2(WO93/25665)或者UL44與UL46之間的ORF間區(qū)域(inter-ORF region)(WO 99/18215)適合插入F基因。在這些當(dāng)中，UL44與UL46之間的ORF間區(qū)域是最合適的。
就本發(fā)明而言，可最新通過(guò)以下的常用方法鑒別一個(gè)非必需區(qū)域。首先，將合適長(zhǎng)度的禽類皰疹病毒DNA片段克隆入大腸桿菌質(zhì)粒中并通過(guò)限制酶分析作物理圖譜。然后，將由一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)標(biāo)記基因組成的一個(gè)基因盒插入克隆DNA片段中的一個(gè)合適的限制位點(diǎn)，產(chǎn)生一個(gè)同源質(zhì)粒。如后文所述，如果與獲得的同源質(zhì)粒進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生一種表達(dá)所插入的標(biāo)記基因的重組病毒，而且其在體內(nèi)和體外是穩(wěn)定的，那么原始選擇的DNA片段應(yīng)是適于NDV F cDNA插入的一個(gè)非必需區(qū)域。
(構(gòu)建rHVT)就本發(fā)明而言，任何已知的產(chǎn)生重組禽類皰疹病毒的方法均是適合的。一個(gè)典型實(shí)例如下所述。(1)首先，如上所述，構(gòu)建一個(gè)重組質(zhì)粒，其包括禽類皰疹病毒的一個(gè)非必需區(qū)域。然后將5’末端的一個(gè)啟動(dòng)子及3’末端的一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)正確的接在一起，并將NDV-FcDNA插入所述非必需區(qū)域以產(chǎn)生一個(gè)同源質(zhì)粒。(2)將所得質(zhì)粒移至用親代HVT感染的雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞中，或者共同轉(zhuǎn)染入具有感染性HVT基因組DNA的CEF細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染可以通過(guò)任何已知的方法進(jìn)行。(3)將轉(zhuǎn)染的CEF細(xì)胞接種入培養(yǎng)平板中并孵育至出現(xiàn)病毒噬斑。(4)可鑒別的噬斑包括重組病毒以及親代野生型病毒。將重組病毒通過(guò)任何已知方法從野生型病毒中純化，以篩選插入的外源基因的表達(dá)。
(新城疫-Marek’s病二價(jià)疫苗)由于F蛋白是NDV的一種保護(hù)性抗原，而主鏈HVT是Marek’s病的一種活疫苗，因此含有本發(fā)明的F基因的rHVT可用作新城疫和Marek’s病的二價(jià)疫苗，或者作為新城疫的單價(jià)疫苗。
主要由本發(fā)明rHVT組成的疫苗可包括雞細(xì)胞和/或培養(yǎng)基的配料。只要無(wú)藥理學(xué)不利作用，所述疫苗可還有任何配料如防腐劑。另外，本發(fā)明的疫苗可用作與任何重組或非重組病毒如MDV血清1型或血清2型疫苗株的混合物。
任何已知方法均適于制備本發(fā)明的重組二價(jià)疫苗。例如，將rHVT接種于允許培養(yǎng)細(xì)胞如CEF細(xì)胞中并生長(zhǎng)至合適效價(jià)。然后，將細(xì)胞用刮刀從培養(yǎng)平板或者培養(yǎng)瓶中刮除，或者經(jīng)胰蛋白酶處理并進(jìn)行離心。然后將分離自上清的細(xì)胞懸浮于含有二甲基亞砜的培養(yǎng)基中并貯存于液氮中。當(dāng)rHVT在上清中時(shí)，將被收集并凍干。
將二價(jià)重組HVT疫苗通過(guò)任何已知的接種Marek’s病疫苗的方法施用于雞類。例如，將本發(fā)明的疫苗稀釋為10-105，或者更合適的102-104噬斑形成單位(PFU)/劑，皮下接種于一日齡的雛雞頸后部，或者使用注射器及其他任何注射設(shè)備注入胚卵中。
本發(fā)明的禽類二價(jià)疫苗給予SPF雞90％或更多的抗NDV攻擊的保護(hù)作用，而且給予具有高水平抗NDV母體抗體的商業(yè)雞類至少70％或更多的保護(hù)作用。
在本發(fā)明中，如實(shí)施例所述，抗NDV攻擊的保護(hù)作用以在攻擊測(cè)試中保護(hù)的禽類與總測(cè)試禽類的比率而確定。首先，通過(guò)攻擊未接種的禽類確定NDV攻擊病毒的合適劑量。90％或更多這些禽類(陰性對(duì)照組)必須顯示臨床信號(hào)。接下來(lái)將接種的禽類通過(guò)肌內(nèi)途徑注射至股部或者通過(guò)氣管內(nèi)、眼內(nèi)或眶下途徑用相同劑量的攻擊病毒攻擊。觀測(cè)受攻擊的禽類的新城疫發(fā)病情況，特別是神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
優(yōu)選實(shí)施方案描述實(shí)施例1構(gòu)建同源載體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒(Molecular CloningALaboratory Manual.2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。將DNA限制片段在瓊脂糖凝膠上電泳并用QIAquick凝膠提取試劑盒純化(QIAGEN，Cat#28704)。
1-1構(gòu)建用于測(cè)定啟動(dòng)子活性的質(zhì)粒質(zhì)粒pGIMICSpolyASfi(2773bp，WO 99/18215)通過(guò)將一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)和一個(gè)SfiI位點(diǎn)導(dǎo)入pUC18的多克隆位點(diǎn)而構(gòu)得。然后將pGIMICSpolyASfi用NheI消化并與通過(guò)NheI和XbaI消化從Pica基因增強(qiáng)子2(5064bp，TOYO INK MFG CO.，LTD)切下的1721bp的片段連接，獲得的質(zhì)粒稱為pLUC-Pro(4494bp)。
接下來(lái)使用雞細(xì)胞基因組DNA庫(kù)作為模板通過(guò)PCR制備包含β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)DNA片段(大約1.5kb)。所述引物為PrBacl(SEQ ID NO.2，5’-CAGTGTCGCTGCAGCTCAGTGCATGCACGCTCATTGCCC-3’)及PrBac2(SEQ ID NO.3，5’-GCTCTAGAGTCGACAAGCTTCATGGCTGGCTGCGGAGGAACAGAGAAGGG-3’)。
獲得的片段用PstI和XbaI消化及與通過(guò)PstI和XbaI消化而產(chǎn)生的4482bp片段連接。所得質(zhì)粒稱為pLUC-bac，其長(zhǎng)度為5986bp，并包含所述β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子區(qū)域。
pLUC-bac用BamHI和BglII消化，將所得5958bp片段自身連接產(chǎn)生pLUC-bac-Sma。由于pLUC-bac-Sma在β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上游具有PstI和SmaI位點(diǎn)，因此用PstI和SmaI限制pLUC-bac-Sma隨后自身連接產(chǎn)生第一個(gè)質(zhì)粒以獲得β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子縮短的5’區(qū)域。相似地，用SacI和XbaI限制pLUC-bac隨后通過(guò)自身連接產(chǎn)生第二個(gè)質(zhì)粒以獲得β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子縮短的3’區(qū)域。然后將所得兩個(gè)質(zhì)粒線性化及使用Kilo序列檢測(cè)試劑盒(TAKARA SYUZO CO.，LTD)進(jìn)行ExoIII處理。在1、2和3分鐘取樣以從第一個(gè)質(zhì)粒獲得7個(gè)樣品及從第二個(gè)質(zhì)粒中獲得22個(gè)樣品。所有29個(gè)樣品均包含大約200-1500bp的啟動(dòng)子區(qū)域。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟將所得樣品平端化并自身連接以產(chǎn)生環(huán)形質(zhì)粒。
使用PicaGene(TOYO INK MFG.CO.，LTD)測(cè)定螢光素酶活性。簡(jiǎn)而言之，將1μg所述29個(gè)質(zhì)粒的每一個(gè)質(zhì)粒借助基因脈沖發(fā)生器(Gene Pulser，Bio-Rad Laboratories)通過(guò)電穿孔導(dǎo)入CEF細(xì)胞中。然后將所述細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)及加入細(xì)胞裂解緩沖液(PicaGene試劑盒中的)。將所述細(xì)胞在-80℃冷凍1小時(shí)，并在室溫解凍以完成細(xì)胞裂解。離心后，將10μl回收的上清加入100μl的PicaGene底物溶液中，1分鐘之后用Lumino-Meter(Model 11253，Bio-Rad Laboratories)測(cè)定熒光素酶強(qiáng)度。Lumino-Meter用于計(jì)算產(chǎn)生的螢光素酶的數(shù)量，可以用來(lái)指征啟動(dòng)子的活性(見(jiàn)

圖1)。
如圖1所示，在含有5’末端缺失的樣品中，TATAAA上游缺失120bp以上的樣品，其啟動(dòng)子的活性明顯降低。相反，在3’末端，啟動(dòng)子活性與缺失長(zhǎng)度之間沒(méi)有相關(guān)性。例如，與全長(zhǎng)β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子相比，大約100bp的缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子的活性降低1/5。朝向3’末端的進(jìn)一步缺失(超過(guò)100bp)不會(huì)恢復(fù)原始活性。
1-2核心序列啟動(dòng)子文獻(xiàn)(參考文獻(xiàn)12-19)表明β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的所有區(qū)域均不是不可缺少的?；谶@種信息，通過(guò)PCR使用pLUC-bac的β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子作為模板獲得273、211、175和163bp片段。引物是SEQ IDNO.4(5’-TATTTTGTGCAGCGAT-3’)及SEQ ID NO.5(5’-ACGTCTAGAAGGCAACGCAGCGACT-3’)或者SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6(5’-CTGTCTAGATAACGCGGTCAGTCAGA-3’)。所得片段coa273、coa211、coal75和coa163稱為核心序列啟動(dòng)子(COA)。
接著，將這四個(gè)COA用PstI和XbaI消化，同時(shí)用PstI和XbaI從pLUC-pro中切下的一個(gè)4482bp片段，并將這些片段進(jìn)行連接。四個(gè)質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性如實(shí)施例1-1所述測(cè)定。結(jié)果是，pLUC-COA273、pLUC-COA211、pLUC-COA175和pLUC-COA163的活性分別是全長(zhǎng)β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子活性的97％、76％、96％和34％。pLUC-COA273中包含的啟動(dòng)子稱為COA啟動(dòng)子，因?yàn)槠浔憩F(xiàn)出最高的啟動(dòng)子活性。
1-3構(gòu)建p45/46Sfi(圖2和3)基于MDV血清1型的gC同源(gCh)基因(Coussers et al.，J.Virol.622373-2379，1988)及其鄰近BamHI-B片段(Japanese UnexaminedPatent Publication No.H6-292583)的信息，通過(guò)PCR制備在兩個(gè)ORFUL45h和UL46h之間具有一個(gè)SfiI位點(diǎn)的DNA片段并克隆入pUC18。首先，根據(jù)Lee等所述方法從感染HVT FC126毒株的CEF細(xì)胞中制備HVT DNA(J.Gen.Virol，51245-253，1980)。用獲得的HVT DNA作為模板，使用兩對(duì)引物進(jìn)行PCR。第一對(duì)引物是SEQ ID NO.7(5’-CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC-3’)和SEQ ID NO.8(5’-CGCGGGCCTTATTGGCCAAAACACACCTCTAACGGTTACT-3’)。第二對(duì)引物是SEQ ID NO.9(GCGCGGCCAATAAGGCCAAAACACAGTAACCGTTAGAGGT-3’)和SEQ ID NO.10(5’-CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA-3’)。使用所得兩個(gè)PCR產(chǎn)物的混合物作為模板，用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8進(jìn)行另一次PCR以產(chǎn)生在兩個(gè)QRF UL45h和UL46h之間具有一個(gè)SfiI位點(diǎn)的片段。
所得片段然后用EcoRI和HindIII消化并與已經(jīng)用EcoRI和HindIII消化的pUC18連接。所得質(zhì)粒稱為p45/46Sfi。
1-4構(gòu)建pUC18polyAsfi通過(guò)退火兩個(gè)合成的寡核苷酸(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)隨后與已經(jīng)用EcoRI和HindIII消化的pUC18連接而構(gòu)建pUC18polyASfi。
SEQ ID NO.11138bp5’-AGCTTGCCAATAGGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGCGAGCTCGTAGCGGGCCCGCATGCGGTACCGTCGACAATAAAGAACCGCTTTAAGAATAGTGTTTATTTTTGTGTTTATGGCCAATAAGGCCG-3’
SEQ ID NO.12138bp5’-AATTCGGCCTTATTGGCCATAAACACAAAAATAAACACTATTCTTAAAGCGGTTCTTTATTGTCGACGGTACCGCATGCGGGCCCGCTAGCGAGCTCGCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCTTATTGGC-3’將插入的片段用BglI切除并設(shè)計(jì)粘端以插入p45/46Sfi的SfiI位點(diǎn)中。另外，將多克隆位點(diǎn)加入所述片段的5’末端以便可以插入一個(gè)啟動(dòng)子-外源基因盒。SalI位點(diǎn)下游的43bp序列是聚腺苷酸化信號(hào)，它是衍生于位于MDV GA毒株UL46h下游的序列。
1-5構(gòu)建pBac將包含實(shí)施例1-1所述β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)大約1.5kb的DNA片段用PstI和SalI消化，及與已經(jīng)用PstI和SalI消化的pUC18polyASfi連接。所得質(zhì)粒稱為pBac。
1-6構(gòu)建pGICOA使用pBac作為模板，用引物PrBac3和PrBac4進(jìn)行PCR。
PrBac3(SEQ ID NO.13)5’-TTTCTGCAGTATTTTGTGCAGCGAT-3’PrBac4(SEQ ID NO.14)5’-CTGTCTAGATAACGCGGTCAGTCAGA-3’PrBac3具有一個(gè)PstI位點(diǎn)，PrBac4具有一個(gè)XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的片段用PstI和XbaI切除以產(chǎn)生一個(gè)大約300bp的片段。然后將該片段與已經(jīng)用PstI和XbaI消化的pUC18polyASfi連接。所得質(zhì)粒稱為pGICOA。
1-7構(gòu)建Pec啟動(dòng)子將CMV增強(qiáng)子加入COA啟動(dòng)子中以增強(qiáng)其啟動(dòng)子的活性。
由于CMV增強(qiáng)子有兩個(gè)BglI位點(diǎn)，因此來(lái)自CMV增強(qiáng)子的BglI盒不易被插入于pGICOA的SfiI位點(diǎn)中。為缺失BglI位點(diǎn)，使用pBK-CMV(Stratagene)作為模板，用3對(duì)引物進(jìn)行PCR而構(gòu)建體外誘變。所述引物是PrCMV1(SEQ ID NO.15)和PrCMV3(SEQ ID NO.17)、PrCMV4(SEQ ID NO.18)和PrCMV5(SEQ ID NO.19)及PrCMV6(SEQ ID NO.20)和PrCMV2(SEQ ID NO.16)。使用獲得的三個(gè)擴(kuò)增片段作為模板，用引物PrCMV1和PrCMV2進(jìn)行第二次PCR。由于PrCMV1有一個(gè)PstI位點(diǎn)，PrCMV2有一個(gè)EcoT22I位點(diǎn)，因此將擴(kuò)增的片段用PstI和EcoT22I消化以產(chǎn)生一個(gè)大約300bp的片段，然后將其克隆入pGICOA的PstI位點(diǎn)中以產(chǎn)生pGIPec。pGIPec中包含的啟動(dòng)子稱為Pec啟動(dòng)子，由來(lái)自CMV增強(qiáng)子的大約275bp片段以及來(lái)自β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的一個(gè)273bp片段組成。
所述Pec啟動(dòng)子表現(xiàn)出增強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，當(dāng)用實(shí)施例1-1所述的方法在體外評(píng)估時(shí)，比COA啟動(dòng)子的活性高6.5倍。
PrCMV1(SEQ NO.15)5’-GGG CTG CAG AGT TAT TAA TAG TAA TCA ATT-3’PrCMV2(SEQ NO.16)5’-GGG ATG CAT CCA TTT ACC GTC ATT GAC GTC-3’PrCMV3(SEQ NO.17)5’-GGG TCG TTG GGC GGT CAG CCG GCG G-3’PrCMV4(SEQ NO.18)5’-CTT ACG GTA AAT GGC CCG CCG GCT G-3’PrCMV5(SEQ NO.19)5’-TAC ACT TGA TGT ACT GCC AAT GGG C-3’PrCMV6(SEQ NO.20)5’-TAT TTA CGG TAA ACT GCC CAT TGG C-3’1-8構(gòu)建NDV-F載體使用XLIII10H(Sato，H.et al.，Virus Research，7241-7255，1987)作為模板，用引物PrF1和PrF2進(jìn)行PCR。
PrF1(SEQ NO.21)5’-GCTCTAGAGGATCCGCATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCC-3’PrF2(SEQ NO.22)5’-GCGAGCTCGGTCCATGACTGAAGACTGCTATTGG-3’PrF1有XbaI和BamHI位點(diǎn)，PrF2有一個(gè)SacI位點(diǎn)。
擴(kuò)增的長(zhǎng)度為大約1.9kb的片段編碼F基因的553個(gè)氨基酸，其與病毒研究7241-7255，1987中所報(bào)道的內(nèi)容相一致。將該片段用XbaI和KpnI消化并克隆到已用XbaI和KpnI消化的pGIPec中。所得質(zhì)粒稱為pGIPecF。
1-9構(gòu)建同源載體p45/46PecF為構(gòu)建同源質(zhì)粒p45/46PecF，將Pec啟動(dòng)子、NDV F基因和SV40聚腺苷酸化信號(hào)序列插入p45/46Sfi中。首先，將Pec啟動(dòng)子和NDV F基因用BglI和KpnI從pGIPecF中切除。其次，從pBR-CMV(Stratagene)中通過(guò)PCR使SV40聚腺苷酸化信號(hào)序列擴(kuò)增，并用BglI和KpnI切割。將這兩個(gè)片段克隆入SfiI位點(diǎn)，同時(shí)破壞一個(gè)SfiI位點(diǎn)，并產(chǎn)生所述同源質(zhì)粒p45/46pecF。
實(shí)施例2構(gòu)建并純化rHVT/NDV如Morgan等所述制備HVT野生型FC126毒株(wt-HVT)的病毒DNA(Avian Disease，34345-351，1990)。將CEF細(xì)胞用制備的wt-HVT DNA和p45/46PecF轉(zhuǎn)染(見(jiàn)實(shí)施例3-3)。所得重組病毒引起噬斑并得到純化，這一過(guò)程采用抗NDV-F抗體對(duì)噬斑進(jìn)行染色的方法實(shí)現(xiàn)。
簡(jiǎn)而言之，將5μg同源載體p45/46PecF和25μg wt-HVT DNA溶解于100μl的生理鹽水G(0.14M NaCl，0.5mM KCl，1.1mM Na2HPO4，1.5mM NaH2PO4，0.5mM MgCl2，0.011％葡萄糖)中。然后，將CEF細(xì)胞懸浮于0.7ml的生理鹽水G中并進(jìn)行電穿孔。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在室溫孵育10分鐘并移至一個(gè)60mm培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿中含有由Leibovitz’s L-15(GIBCO BRL，Cat.#41300-39)和McCoy’s 5A培養(yǎng)基(GIBCO BRL，Cat.#21500-061)(1∶1)，以及4％小牛血清組成的5ml培養(yǎng)基(LM(+)培養(yǎng)基)。在37℃在5％CO2中孵育后，重組體從wt-HVT中通過(guò)一系列有限稀釋法得以純化。在每次純化循環(huán)時(shí)，使用抗原—抗體反應(yīng)證實(shí)F基因的表達(dá)，抗體采用抗NDV-F單克隆抗體3-1G/5(Morrison，T.G.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.841020-1024，1987)作為一級(jí)抗體。重復(fù)純化操作直至每個(gè)獲得的噬斑均由抗NDV-F抗體染色呈現(xiàn)陽(yáng)性。純化的重組體HVT稱為rHVT/NDV。
實(shí)施例3確證rHVT/NDV的穩(wěn)定性3-1Southern雜交將純化的rHVT/NDV在兩個(gè)150mm培養(yǎng)皿中CEF細(xì)胞上增殖以獲得鋪滿的噬斑。將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮下，轉(zhuǎn)移至Falcon試管中，在1500轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心5分鐘。收獲的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再懸浮于1.2ml PBS和0.8ml裂解緩沖液(1.25％TritonX-100，250mM 2-ME以及50mM EDTA(溶于PBS中))，渦旋30秒使之裂解。然后將裂解物在室溫在3000rpm離心5分鐘，將上清移至一個(gè)Eppendorf試管中。在22℃，15000rpm離心20分鐘收集病毒。然后將回收的沉淀再懸浮1ml的12.5mM Tris-Cl(pH7.5)中，并補(bǔ)加4μl核酸酶溶液(0.25mg/ml DNase I，0.25mg/ml RNase A，150mM NaCl)，在37℃孵育30分鐘，及通過(guò)用SDS-蛋白酶溶液(500mM EDTA，25μl；10％SDS，125μl；H2O，87μl；10mg/ml蛋白酶K，12.5μl；2-巰基乙醇，0.5μl)在55℃孵育30分鐘而破壞。所得混合物用苯酚-氯仿處理兩次，并將16μl 5M NaCl加入水相中。病毒DNA通過(guò)加入2.5體積的-20℃的乙醇而沉淀，用70％乙醇洗滌及沉淀。在風(fēng)干后，將回收的沉淀溶解于50μl的TE緩沖液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA)中。
然后將TE緩沖液中回收的病毒DNA用XhoI、XbaI和SfuI消化并進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。將單個(gè)凝膠上電泳的DNA片段同時(shí)移至兩個(gè)尼龍膜上(Molecular CloningA Laboratory Mannual，thirdedition，6.35，Sambrook，J.，and Russell，D.W.，Cold Spring HarborLaboratory)。在烘焙固定DNA后，將固定的DNA與DIG-標(biāo)記的探針雜交，所用探針為“F探針”或“IS45/46探針”，是用PCR DIG探針合成試劑盒(ROCHE DIAGNOSTICS，Cat.#1636090)制備。F探針用NDV-F-F(SEQ ID NO.23)和NDV-F-R(SEQ ID NO.24)作為引物，p45/46PecF作為模板，通過(guò)PCR制備。IS45/46探針用45/46-F(SEQ ID NO.25)和45/46-R(SEQ ID NO.26)及p45/46Sfi制備。
NDV-F-F(SEQ ID NO.23)5’-CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT-3’NDV-F-R(SEQ ID NO.24)5’-GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT-3’45/46-F(SEQ ID NO.25)5’-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3’45/46-R(SEQ ID NO.26)5’-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3’Southern印跡結(jié)果顯示，一個(gè)3.6kb片段與F探針雜交，3.6kb和1.2kb片段與IS45/46探針雜交，表明所制得的rHVT/NDV含有期望的基因組結(jié)構(gòu)。
3-2rHVT/NDV的體外穩(wěn)定性將rHVT/NDV在CEF細(xì)胞中傳代10次，并進(jìn)行Southern印跡分析。結(jié)果與實(shí)施例3-1所得結(jié)果相同，表明所發(fā)明的rHVT/NDV甚至在10代后仍保持穩(wěn)定。
3-3rHVT/NDV的體內(nèi)穩(wěn)定性將3000PFU的rHVT/NDV皮下接種于SPF雞，以及具有抗NDV母體抗體的商業(yè)雞的背部。在接種3、4、5及6周后，從接種的禽類中收集外周血并從外周血淋巴細(xì)胞中回收病毒。收集淋巴細(xì)胞的過(guò)程如下所示。
使用含有0.5ml肝素溶液(100u/ml)的2.5ml注射器，從雞中收集2md血液并置于15ml Falcon離心管中的5ml Ficoll-Paque(Amersham-Pharmacia)上。在1800rpm離心20分鐘后，在Ficoll-Paque和血清層界面處形成外周血淋巴細(xì)胞帶。用Pasteur移液管收集界面層，接種于9cm培養(yǎng)皿中的CEF細(xì)胞中，培養(yǎng)7天。當(dāng)在第一次培養(yǎng)及隨后的傳代培養(yǎng)期間觀測(cè)到噬斑時(shí)，認(rèn)為病毒從淋巴細(xì)胞中成功分離。結(jié)果歸納于表1中。
表1從接種的禽類外周血淋巴細(xì)胞中分離rHVT
*從中回收病毒的禽類數(shù)/測(cè)試的禽類數(shù)**周齡***母體抗體陽(yáng)性雞****無(wú)特異性病原的雞*****未做如表1所示，rHVT/NDV以及親代HVT FC126毒株自接種3-6周后接種的雞的外周血淋巴細(xì)胞回收。當(dāng)用實(shí)施例2所述的方法，用抗F抗體染色時(shí)，所有重組噬斑均表現(xiàn)為表達(dá)F基因，表明rHVT/NDV在體內(nèi)傳代后是穩(wěn)定的。
實(shí)施例4確證rHVT/NDV表達(dá)插入的基因4-1免疫熒光技術(shù)rHVT/NDV感染的細(xì)胞在37℃與組織培養(yǎng)室玻片中新鮮的CEF細(xì)胞一起孵育，并將獲得的噬斑用冷卻的丙酮固定。為檢測(cè)表達(dá)的抗原基因產(chǎn)物，使用雞抗NDV抗血清或兔抗F抗血清的500倍PBS稀釋液作為一級(jí)抗體。固定的細(xì)胞與一級(jí)抗體在室溫和100％濕度下孵育大約1小時(shí)，用PBS洗滌3次，然后與二級(jí)抗體在室溫反應(yīng)大約1小時(shí)。二級(jí)抗體是用熒光底物(FITC)標(biāo)記的抗雞免疫球蛋白或抗兔IgG抗體。在用PBS洗滌3次后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)處理的玻片。用感染親代HVT FC-126的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果歸納于表2。
表2通過(guò)rHVT/NDV表達(dá)所插入的F基因(熒光檢測(cè))
+檢測(cè)到，-未檢測(cè)到如表2所示，rHVT/NDV表達(dá)插入的NDV-F基因。
4-2Western印跡將CEF細(xì)胞用rHVT/NDV感染，m.o.i.＝0.1，孵育72小時(shí)，溶解于SDS-GEL上樣緩沖液中。類似地，將被親代HVT FC126感染或未感染的細(xì)胞孵育及溶解。所得樣品還原、變性并進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳的蛋白質(zhì)從SDS-GEL中轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)，該膜用1％w/v脫脂奶粉PBS溶液封閉1小時(shí)。然后將處理的膜與稀釋500倍的抗F兔抗血清在室溫下反應(yīng)，用PBS洗滌3次，及與生物素酰化的山羊抗兔抗血清孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次后，將該膜與抗生物素蛋白-堿性磷酸酶復(fù)合物孵育1小時(shí)，用PBS洗滌3次，TBS洗滌1次，然后與BCIP-NBT(一種堿性磷酸酶底物)反應(yīng)。如圖4所示，60kDa的一個(gè)蛋白條帶僅在rHVT/NDV感染細(xì)胞的泳道中觀測(cè)到，這就是所期望大小的F蛋白。
實(shí)施例5rHVT/NDV在SPF雞中的效力將在實(shí)施例2中獲得的rHVT/NDV作為新城疫疫苗進(jìn)行效力測(cè)試。
使用20Gauge注射器，以1950PFU/100μl/禽的劑量將rHVT/NDV皮下接種于15只1天齡的SPF雞的背部(LineM，日本生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)。從接種后3周開(kāi)始，從接種的禽類中收集血清，通過(guò)商用ELISA試劑盒(IDEXX，ELISA kit to diagnose Newcastle Disease)測(cè)定抗NDV抗體的滴度。陽(yáng)性對(duì)照組的雞在14天齡根據(jù)銷售者推薦接種商用NDV活疫苗。陰性對(duì)照組的雞不予施用任何疫苗。在43天齡(接種后42天)，將3個(gè)組的所有雞均用103EID50的NDV-TexasGB通過(guò)股部肌內(nèi)注射而加以攻擊，NDV-TexasGB是美國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株。對(duì)所攻擊的雞每天檢測(cè)死亡率或者檢測(cè)新城疫任何的發(fā)作跡象。
表3用毒性NDV對(duì)rHVT/NDV接種的SPF雞的攻擊實(shí)驗(yàn)
如表3所示，用rHVT/NDV接種的雞未表現(xiàn)出任何臨床跡象，在攻擊后ELISA滴度明顯提高。
實(shí)施例6rHVT/NDV在NDV母體抗體陽(yáng)性雞中的效力為檢測(cè)rHVT/NDV作為疫苗對(duì)具有抗NDV母體抗體陽(yáng)性雞的效力，購(gòu)買商業(yè)雞的受精卵(Hyline，Kanagawa Youkei Rengoukai)并孵化。使用20Gauge 1.5英寸注射器將1950PFU/μl的rHVT/NDV接種于18天齡雞胚。將陽(yáng)性對(duì)照組的雞在14天齡時(shí)用商業(yè)NDV活疫苗根據(jù)銷售者推薦進(jìn)行接種。陰性對(duì)照組的雞不予施用任何疫苗。在43天齡，將所有組的雞均用103EID50的NDV-TexasGB通過(guò)在股部肌內(nèi)注射而加以攻擊，所述NDV-TexasGB是美國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株。對(duì)受攻擊的禽類每天檢測(cè)死亡率或者檢測(cè)新城疫的任何發(fā)作情況。
表4用毒性NDV對(duì)rHVT接種的商業(yè)雞的攻擊實(shí)驗(yàn)
如表4所示，用rHVT接種的雞未表現(xiàn)出任何臨床跡象，在攻擊后ELISA滴度明顯提高。
實(shí)施例7ELISA滴度與疫苗效力之間的關(guān)系ELISA滴度與保護(hù)作用之間的關(guān)系通過(guò)測(cè)定在攻擊后從雞中收集的血清的中抗NDV滴度而進(jìn)行評(píng)估，待測(cè)雞用如實(shí)施例5和6所述方法接種?？贵w滴度通過(guò)實(shí)施例5所用商業(yè)ELISA試劑盒測(cè)定。圖5和6分別表示存活或未存活的SPF以其商業(yè)禽類的ELISA滴度。正如圖中所示，所有具有0.15或更高抗體滴度(S/P值)的雞在受到毒性NDV攻擊時(shí)均存活。
實(shí)施例8免疫持續(xù)時(shí)間按照實(shí)施例6所用的方法用rHVT/NDV接種5只雞，保持不受攻擊，每?jī)芍苁占宀y(cè)定其中的NDV-ELISA滴度。作為對(duì)照，未接種的雞以相同的程序處理。以實(shí)施例7中獲得的S/P值0.15作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定保護(hù)作用。結(jié)果如表5所示。
表5rHVT/NDV給予的保護(hù)性免疫的持續(xù)時(shí)間
如表5所示，在4周齡，未接種雞的ELISA滴度降低至標(biāo)準(zhǔn)值以下，表示無(wú)保護(hù)作用。在50周齡，滴度降低至幾乎為0。相反，接種的雞示在5周齡時(shí)表現(xiàn)出最低的滴度值，而這足以賦予完全保護(hù)作用。之后，在24周齡時(shí)，該數(shù)值持續(xù)逐漸提高至1.21，并將其保持至50周齡。這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的rHVT/NDV在接種的母體抗體陽(yáng)性的商業(yè)雞中能夠誘導(dǎo)長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫。
實(shí)施例9從rHVT/NDV接種雞的外周血淋巴細(xì)胞中分離rHVT/NDV將3000PFU的rHVT/NDV皮下接種于1天齡抗NDV母體抗體陽(yáng)性商業(yè)雞的背部。該接種雞保持30周，每?jī)芍軓钠涑崦}收集外周血。如實(shí)施例3所用方法，從外周血淋巴細(xì)胞中回收病毒。從rHVT/NDV接種的所有雞中回收的病毒，均表現(xiàn)能表達(dá)F基因。
序列表<110>日本瑞翁株式會(huì)這社<120>重組火雞皰疹病毒及其應(yīng)用<130>新城疫病毒<140>
<141>
<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>555<212>DNA<213>Gallus gallus<220>
<221>promoter<222>(1)..(555)<400>1gagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60cgttacataa cttacggtaa attggcccgc cggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180atgggtggag tatttacggt aaactgccca ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 240agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggatgc agtattttgt gcagcgatgg 300gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540ctgactgacc gcgtc 555<210>2<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequencesyntheticPrimer DNA for PCR<400>2cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc 39<210>3<211>50<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequencesynthetic
primer DNA for PCR<400>3gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg 50<210>4<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial Sequencesyntheticprimer DNA for PCR<400>5acgtctagaa ggcaacgcag cgact 25<210>6<211>26<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<210>8<211>40<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceModifiedsynthetic oligonucleotide from pUCl8 plasmid<400>12aattcggcct tattggccat aaacacaaaa ataaacacta ttcttaaagc ggttctttat 60tgtcgacggt accgcatgcg ggcccgctag cgagctcgcc cggggatcct ctagagtcga 120cctgcagcct tattggc 137<210>13<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<220>
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<223>Description of Artificial SequenceSyntheticprimer DNA for PCR<400>21gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc 45<210>22<211>34<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSyntheticprimer DNA for PCR<400>22gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg 34<210>23<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial SequenceSyntheticprimer DNA for PCR<400>24gttaaggcag gggaagtgat ttgt24<210>25<211>24
<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSyntheticprimer DNA for PCR<400>25ggggaagtct tccggttaag ggac 24<210>26<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSyntheticprimer DNA for PCR<400>26ggtgcaattc gtaagaccga tggg 2權(quán)利要求
1.一種重組火雞皰疹病毒，其攜帶在如SEQ ID NO1所示序列的啟動(dòng)子控制下的新城疫病毒的F蛋白基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組火雞皰疹病毒，其中所述啟動(dòng)子和F蛋白基因被插入病毒基因組主鏈的非編碼的ORF間區(qū)域。
3.如權(quán)利要求2所述的重組火雞皰疹病毒，其中所述非編碼區(qū)位于皰疹病毒基因組的UL45和UL46之間。
4.一種在禽類宿主中誘導(dǎo)抗禽類皰疹病毒和新城疫病毒的保護(hù)性免疫的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求1、2或3所述的重組火雞皰疹病毒接種所述禽類宿主。
5.如權(quán)利要求4所述的一種在禽類宿主中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的方法，其中重組火雞皰疹病毒通過(guò)皮下或卵內(nèi)途徑施用于所述禽類宿主。
6.一種禽類疫苗，其包含權(quán)利要求1、2或3所述的重組火雞皰疹病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組火雞皰疹病毒，其通過(guò)存在在啟動(dòng)子控制下的編碼新城疫病毒F蛋白的cDNA而被修飾。由本發(fā)明的重組火雞皰疹病毒組成的禽類疫苗可以在雞中誘導(dǎo)抗新城疫病毒的保護(hù)性免疫。
文檔編號(hào)C12P21/06GK1774264SQ03803004
公開(kāi)日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者克里斯逖·M.·多爾西, 齊藤修治, 奧田尚志, 久保村真由美 申請(qǐng)人:日本瑞翁株式會(huì)社