專利名稱：副結(jié)核分枝桿菌感染的診斷和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis)蛋白的核酸序列，這種核酸序列的一部分，它編碼這種蛋白的免疫原性片段，包含這種核酸序列或其一部分的DNA片段、重組DNA分子、活重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明也涉及這種序列編碼的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白及其免疫原性部分。此外，本發(fā)明涉及包含這種核酸序列或其一部分、包含這種核酸序列或其一部分的DNA片段、重組DNA分子、活重組載體和宿主細(xì)胞、蛋白或其免疫原性部分和抗這種蛋白或其免疫原性部分的抗體的疫苗。而且，本發(fā)明涉及所述蛋白在疫苗和制備疫苗中的用途。而且，本發(fā)明涉及所述核酸序列、蛋白或抗體用于診斷或接種目的的用途。而且，本發(fā)明涉及制備這種疫苗的方法。最后本發(fā)明涉及包含這種核酸、蛋白或抗這種蛋白的抗體的診斷試劑盒。
分枝桿菌屬的細(xì)菌是革蘭氏陽性抗酸生物體。該屬包括許多重要的人和動(dòng)物病原體。其中，鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種是副結(jié)核或Johne’s疾病的病因物質(zhì)，引起很多反芻動(dòng)物疾病的慢性肉芽腫感染，目前對很多肉類和牛奶工業(yè)造成基本上是全世界的經(jīng)濟(jì)損失。全世界很大比例的獸群(在21-70％之間)被感染。在歐洲，估計(jì)每年的損失是大約GBP207/奶牛。在美國，估計(jì)每年的損失是大約15億美元。(Harris，N.B.和Barletta，R.G.，Clinical Microbiology Reviews 14489-512(2001))。
除了其對反芻動(dòng)物的明顯致病性之外，懷疑鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種是Crohn′s病的原因，Crohn′s病是一種人的非特異性慢性透壁炎性疾病，最常影響末端回腸和結(jié)腸，但也可以發(fā)生在從口至肛門的胃腸道的任何部分和肛周區(qū)域。(P.Quirke，Gut 2001，49755-760(2001))(″Possible links between Crohn′s disease and Paratuberculosis″，European Commission，D-G Health and Consumer Protection，Reportof the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare，2000年3月21日)。Crohn′s病的主要問題之一是對該病不能治愈的事實(shí)。這種疾病狀況一旦積聚，一生保持存在，引起很大的發(fā)病率。
巴氏消毒過的牛奶中存在意外的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的比較耐熱菌株連同懷疑其在Crohn′s病發(fā)展中的作用也越來越引起關(guān)于其對人群潛在健康的影響的關(guān)注。Sung，N.和Collins，M.T.in Appl.Environm.Microbiol.64999-1005(1998)已經(jīng)描述了這個(gè)最新的和意外的發(fā)現(xiàn)。
對該問題的認(rèn)識(shí)的增加引起了發(fā)展控制和消滅副結(jié)核的有效診斷學(xué)和疫苗的重新緊迫需要。
鳥分枝桿菌包括一大組分枝桿菌，可以分成三個(gè)亞種，鳥分枝桿菌鳥亞種，鳥分枝桿菌唾液亞種和鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種。鳥分枝桿菌鳥亞種廣泛分布在自然環(huán)境中，包括土壤和表面健康的動(dòng)物，以及鳥類和人類中。鳥分枝桿菌鳥亞種分離株是機(jī)會(huì)病原體并且通常對無免疫應(yīng)答的宿主引起感染和疾病。目前測定了鳥分枝桿菌鳥亞種菌株104的完整基因組序列。鳥分枝桿菌唾液亞種可對鹿引起類似于副結(jié)核的疾病。盡管多數(shù)反芻動(dòng)物在六個(gè)月齡前感染鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種，但是臨床病變通常僅在在至少兩歲后或更晚發(fā)生。在這期間，據(jù)信細(xì)菌存活在宿主細(xì)胞內(nèi)，但是確實(shí)也發(fā)生胃腸腔中感染的細(xì)胞外發(fā)作(感染晚期頻率增加)，期間細(xì)菌變得可以檢測到。目前可利用的針對鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的(免疫學(xué))診斷學(xué)敏感性相對較低，特別是關(guān)于感染早期或潛伏期感染的檢測，因此不能有效作為疾病控制的工具。雖然可以獲得在某些檢測上認(rèn)為可有效使自由獸群不發(fā)生臨床疾病的全細(xì)胞分枝桿菌疫苗，但是這些疫苗基本上都干擾牛肺結(jié)核的免疫診斷并且不抑制疾病的傳播。迄今為止，已經(jīng)鑒定了鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的抗原成分。以前描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的抗原分子包括糖脂和用小試驗(yàn)動(dòng)物中產(chǎn)生的基本上單一特異性早期血清鑒定的蛋白抗原。細(xì)胞壁糖脂分子脂質(zhì)阿拉的甘露聚糖(lipoarabinomannan)(LAM)是通過其被產(chǎn)生的抗細(xì)菌釋放的細(xì)胞濾液的單克隆抗體識(shí)別而鑒定到的，并且隨后被純化和用于血清診斷學(xué)ELISA的開發(fā)(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57189-198)。此外，分子量14kD(Olsen等Clin.Diagn.Lab.Immunol.2001.8797-801)、18kD(bacterioferritin；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90503-508)、19kD(AhpD；Olsen等，Infect.Immun.2000.68801-808)、24kD(p24BCD；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90503-508)、30kD(p30；Burrels等；Vet.Immunol.Immunpathol.1995.45311-320)、34kD(Gilot等J.Bact.1993.1754930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)、34.5kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394)，)、35kD蛋白(Dheenadhayalan和Chang，未發(fā)表數(shù)據(jù))、38kD(Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.199290503-508)、44.3kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394)、45kD(AhpC；Olsen等，Infect.Immun.2000.68801-808)、65kD(hsp65；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70105-115)、70kD(hsp70；Stevenson等，1991.Nucleic Acids Res.194552；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70105-115)的蛋白抗原和過氧化物歧化酶分子(Mullerad等，F(xiàn)EMS Immunol.Med.Microbiol 3481(2002))已經(jīng)被鑒定和描述了(部分)特性。這些中僅少數(shù)被估價(jià)用于診斷學(xué)或疫苗(34kD；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)。因此目前的診斷學(xué)和疫苗仍基于相當(dāng)粗的抗原物質(zhì)。DE19621488和中W09216628已描述了脂質(zhì)阿拉伯甘露聚糖(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57189-198)和34 kD抗原(Gilot等J.Bact.1993.1754930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)用于診斷和疫苗。已經(jīng)提出幾個(gè)其它分子用于診斷學(xué)、疫苗和治療。有插入序列ISM-1(EP0288306和US5225324；)的編碼蛋白，分枝桿菌DAP分子(US9523226)，36kD抗原(US5776692)，可溶性抗原制劑(RU2118538)，具有還原鐵的能力的細(xì)胞外蛋白(DE19728834)和?；D(zhuǎn)移酶(WO9949054)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠有助于保護(hù)哺乳動(dòng)物，特別是人和牛不受鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種感染的致病影響的多肽。而且，很多這些多肽和抗這些多肽的抗體提供了有效的診斷工具。
現(xiàn)在首次驚奇地發(fā)現(xiàn)在表達(dá)文庫中可特異性鑒定和分離的九個(gè)不同的多肽，和在proteomics中可鑒定的兩個(gè)另外的多肽，這些不同多肽中的每一個(gè)都能夠誘導(dǎo)抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的免疫應(yīng)答并適合作為疫苗成分。本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)這些多肽可以單獨(dú)或與彼此組合用作疫苗成分，提供確實(shí)有助于保護(hù)哺乳動(dòng)物，特別是人和牛不受鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種感染并且有助于降低鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種引起的損害的疫苗。
三種不同的方法用于根據(jù)本發(fā)明的(編碼疫苗成分的基因)疫苗成分和診斷學(xué)工具的檢測。實(shí)施例中更詳細(xì)地介紹這些方法。一個(gè)方法使用非常特異的抗血清檢測表達(dá)文庫中編碼免疫反應(yīng)性鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的基因。使用的抗血清在某種意義上不同于通常用于篩選表達(dá)文庫的抗血清，即從感染鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種很長時(shí)期的牛獲得。而且，這些抗血清取自發(fā)現(xiàn)自然感染鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種，但是沒有感染肺結(jié)核、布魯氏桿菌病或造白細(xì)胞組織增生(leucosis)的歷史的牛。這通過下列發(fā)現(xiàn)證實(shí)，獲得測試血清前大約兩年長時(shí)間內(nèi)的至少兩個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種陽性糞便樣品用于篩選，和基本上沒有與副結(jié)核抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的抗引起肺結(jié)核的物質(zhì)的抗體或其它免疫反應(yīng)。由此獲得的血清在鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種抗原的免疫篩選中非常有效，因?yàn)樗鼈兎浅V泛地反應(yīng)對抗相關(guān)的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種肽片段，然而在另一方面，它們與引起肺結(jié)核、布魯氏桿菌病或造白細(xì)胞組織增生(leucosis)的病原體顯示基本上無或僅很低的特異反應(yīng)性。
這個(gè)方法導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)三個(gè)新的免疫原性蛋白，其編碼序列在下面給出的SEQ ID NO1、3和5中描述。
現(xiàn)在已經(jīng)克隆和測序了編碼第一個(gè)蛋白的基因，包含免疫原性決定簇的該基因的核酸序列在SEQ ID NO1中描述。全長基因編碼分子量28kD的蛋白(如SEQ ID NO2中描述)。
本領(lǐng)域熟知，很多不同的核酸序列可編碼一個(gè)和相同的蛋白。普遍已知這個(gè)現(xiàn)象是編碼氨基酸的每個(gè)三聯(lián)體的第二和特別是第三個(gè)堿基的波動(dòng)。這個(gè)現(xiàn)象可產(chǎn)生仍編碼相同蛋白質(zhì)的兩個(gè)核酸序列的異種性。因此，原則上，具有低如70％序列同源性的兩個(gè)核酸序列仍可編碼一個(gè)和相同的蛋白。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO1中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
下面定義了免疫原性片段的概念。編碼免疫原性片段的核酸序列的長度通常至少18或更常21個(gè)核苷酸，但是優(yōu)選24、27、30、33或甚至36個(gè)核苷酸。
由于本領(lǐng)域經(jīng)常遇到的分子量測定的細(xì)微變異性，當(dāng)在聚丙烯酰胺凝膠上凝膠電泳測定時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的所有蛋白的分子量可以在一定程度上變化。因此根據(jù)本發(fā)明的蛋白的分子量應(yīng)該解釋為其理論分子量+/-5kD。
優(yōu)選，編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的根據(jù)本發(fā)明的核酸序列或編碼那個(gè)蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分與SEQ ID NO1中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％，99％或甚至100％的同源性水平。
可以用可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.找到的計(jì)算機(jī)程序″BLAST 2 SEQUENCES″通過選擇子程序″BLASTN″確定核苷酸同源性的水平。這個(gè)程序的參考文獻(xiàn)是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters 174247-250(1999)。使用的參數(shù)是缺省參數(shù)匹配獎(jiǎng)勵(lì)分+1.不匹配罰分-2開放gap5延伸gap2.Gapx_dropoff50.
與SEQ ID NO 1或?qū)⒃谙旅婷枋龅腟EQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15或17中任何一個(gè)描述的序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或包含根據(jù)本發(fā)明的序列串聯(lián)排列的核苷酸序列，也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼14kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO3中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼14kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分與SEQ ID NO3中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式還涉及編碼9kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO5中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼該9kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ IDNO5中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
用于檢測免疫學(xué)重要的多肽的另一個(gè)方法基于使用抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的高度特異性單克隆抗體。這個(gè)方法具有甚至比使用上述抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的特異性抗血清的方法更特異的優(yōu)點(diǎn)。
這些單克隆抗體的使用導(dǎo)致六個(gè)另外的免疫原性鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的鑒定和分離。
因此，這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼47kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO7中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼該47kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ IDNO7中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO9中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼這個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ ID NO9中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO11中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼這個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ ID NO11中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO13中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼這個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ ID NO13中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO15中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼這個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ ID NO15中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
這個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)形式涉及編碼鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列或編碼所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分與SEQ ID NO17中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
優(yōu)選，編碼這個(gè)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的根據(jù)本發(fā)明的核酸序列或編碼該蛋白的免疫原性片段的該核酸序列的一部分與SEQ IDNO17中描述的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白基因的核酸序列具有至少90％、優(yōu)選93％、更優(yōu)選95％的同源性。
甚至更優(yōu)選的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
第三個(gè)方法，基于鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的proteome的仔細(xì)分析產(chǎn)生了再兩種新疫苗成分的檢測。這個(gè)方法基于在2D凝膠中免疫原性蛋白的鑒定。它具有勝過其它方法的優(yōu)點(diǎn)，即表達(dá)文庫中尚未發(fā)現(xiàn)或鑒定的蛋白現(xiàn)在可以明確地鑒定為疫苗成分。下列實(shí)施例2給出了該方法的詳細(xì)內(nèi)容。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還涉及具有5.60-6.15的pI的60kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白。


圖1b和d中可見到這個(gè)蛋白是大約5個(gè)斑點(diǎn)的水平行(由于表現(xiàn)出如不同翻譯后修飾或2D凝膠電泳樣品制備引入的假象(artifacts)的同工形式的微小差異)。
另外，另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有4.20-4.75的pI的33kD鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白。圖1b和d中可見到這個(gè)蛋白是大約3個(gè)斑點(diǎn)的水平行(由于表現(xiàn)出如不同翻譯后修飾或2D凝膠電泳樣品制備引入的假象的同工形式的微小差異)。
既然這些蛋白現(xiàn)在已被明確鑒定，那它們就可以被測序，如根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)步驟可確定N末端的前15個(gè)氨基酸。現(xiàn)在這種N末端測序已商業(yè)化并且在標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上由專門蛋白測序的公司進(jìn)行。接著可使用簡并探針容易地鑒定編碼這些蛋白的基因。這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
由于本發(fā)明公開了編碼新的鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種蛋白的核酸序列，現(xiàn)在首次可能獲得足夠量的這些蛋白。這可以如使用表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的編碼該蛋白或其免疫原性片段的全部或部分基因來進(jìn)行。因此，在涉及核酸序列的該實(shí)施方案的更優(yōu)選形式中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的DNA片段。DNA片段是作為根據(jù)本發(fā)明核酸序列的載體起作用的一段核苷酸。這種DNA片段可以是如質(zhì)粒，其中克隆根據(jù)本發(fā)明的核酸序列。例如這種DNA片段可有效增加用作引物，DNA接種疫苗目的和表達(dá)根據(jù)本發(fā)明核酸序列的DNA量，如下所述。
表達(dá)核酸序列的必要條件是適當(dāng)啟動(dòng)子與核酸序列功能性連接，使得該核酸序列處于啟動(dòng)子控制之下。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，啟動(dòng)子的選擇擴(kuò)展到能夠指導(dǎo)基因在用作蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的任何真核、原核或病毒啟動(dòng)子是顯而易見的。
因此，這個(gè)實(shí)施方案的甚至更優(yōu)選形式涉及包含根據(jù)本發(fā)明的DNA片段和/或核酸序列的重組DNA分子，其中根據(jù)本發(fā)明的核酸序列置于功能性連接的啟動(dòng)子控制之下。這可依靠如標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)完成。(Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.Molecular cloningalaboratory manual，1989.ISBN 0-87969-309-6).
功能性連接的啟動(dòng)子是能夠控制與它們連接的核酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是根據(jù)本發(fā)明的新基因的天然啟動(dòng)子或鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的另一個(gè)啟動(dòng)子，只要那個(gè)啟動(dòng)子在用于表達(dá)的細(xì)胞中是有功能的。它也可以是異源啟動(dòng)子。當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，可以使用的有用的表達(dá)控制序列包括Trp啟動(dòng)子和操縱子(Godeddel等，Nucl.Acids Res.，8，4057，1980)；1ac啟動(dòng)子和操縱子(Chang，等，Nature，275，615，1978)；外膜蛋白啟動(dòng)子(Nakamura，K.和Inoμge，M.，EMBO J.，1，771-775，1982)，λ噬菌體啟動(dòng)子和操縱子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.，11，4677-4688，1983)；α-淀粉酶(枯草芽孢桿菌)啟動(dòng)子和操縱子，與所選宿主細(xì)胞相容的終止序列和其它表達(dá)增強(qiáng)和控制序列。
當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，有用的表達(dá)控制序列包括如α-交配因子。對于昆蟲細(xì)胞，可以使用多角體蛋白或桿狀病毒的p10啟動(dòng)子(Smith，G.E.等，Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。當(dāng)宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物時(shí)，示例的有用表達(dá)控制序列包括(人)巨細(xì)胞病毒即早啟動(dòng)子(Seed，B.等，Nature 329，840-842，1987；Fynan，E.F.等，PNAS 90，11478-11482，1993；Ulmer，J.B.等，Science259，1745-1748，1993)，魯斯氏肉瘤病毒LTR(RSV，Gorman，C.M.等，PNAS 79，6777-6781，1982；Fynan等，前述；Ulmer等，前述)，MPSV LTR(Stacey等，J.Virology 50，725-732，1984)，SV40即早啟動(dòng)子(Sprague J.等，J.Virology 45，773，1983)，SV-40啟動(dòng)子(Berman，P.W.等，Science，222，524-527，1983)，金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Brinster，R.L.等，Nature 296，39-42，1982)，熱休克啟動(dòng)子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)，Ad2的主要晚期啟動(dòng)子和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Tang等，Nature 356，152-154，1992)。調(diào)節(jié)序列也可以包括終止和聚腺苷酸序列。其中可使用的序列是熟知的牛生長激素聚腺苷酸序列，SV40聚腺苷酸序列，人巨細(xì)胞病毒(hCMV)終止子和聚腺苷酸序列。
細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲和脊椎動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是很常使用的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的并且通?？梢詮纳虡I(yè)上獲得，如從Clontech Laboratories，Inc.4030 Fabian Way，Palo Alto，California94303-4607，美國。僅次于這些表達(dá)系統(tǒng)，基于寄生蟲的表達(dá)系統(tǒng)是有吸引力的表達(dá)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)如在法國專利申請，
發(fā)明者P·T·J·威廉姆森, S·F·維斯特芬, D·巴克爾, F·G·范茲德維爾德, J·E·R·瑟爾 申請人:動(dòng)物飼養(yǎng)與動(dòng)物健康研究有限公司