專利名稱：含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒及其產(chǎn)生方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種含原癌基因c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒以及它的產(chǎn)生方法和用途。
背景技術：
赤潮毒素主要有麻痹性貝毒(paralytic shellfish poisoning，PSP)、腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)、神經(jīng)性貝毒(neurotoxic shellfish poisoning，NSP)和記憶缺失性貝毒(amnesiashellfish poisoning，ASP)等。其中PSP是鈉通道阻斷劑，可以特異的與Na+通道結(jié)合。我國四大海域貝類PSP均有檢出。PSP毒素包括石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neo-STX)、膝溝藻毒素1-4(GTX1-4)和氨基甲酰-N-磺基毒素等。目前，國內(nèi)外已建立了多種PSP檢測分析技術。其中細胞分析方法是利用PSP毒素的毒理特征，即和Na+通道特異結(jié)合的原理來檢測毒素，其最大的優(yōu)點是直接利用了毒素的作用機理，因而不僅能夠給出毒素量的信息，更重要的是能夠反映毒素的毒力水平。細胞分析中最具潛力、最受人們關注的是以報告基因為基礎的細胞分析法。原癌基因c-fos是一種快速反應基因(immediate-early gene，IEG)，作為快速、靈敏的生物標記已用于藻類毒素檢測的研究。正常細胞中c-fos的表達量很低，但當細胞受到傷害時，可以快速表達。在富含Na+通道的細胞中，Na+通道激活劑可以導致Na+通道持續(xù)開放，導致Na+內(nèi)流，從而誘導細胞中的c-fos基因快速表達。NSP自身是鈉通道激活劑；而PSP可以特異的與Na+通道結(jié)合，減少或降低由于Na+內(nèi)流而引起的細胞損傷。
Elizabeth R Fairey等在荷蘭Elsevier Science公司出版AnalyticalBiochemistry，1997，251129-132上公開了一種以c-fos啟動子為啟動子、熒光素酶(Luc)為報告基因的赤潮毒素細胞分析法。具體步驟如下1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染小鼠成神經(jīng)細胞瘤細胞系N2A細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣，5％CO2)中。
應用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將c-fos-Luc與攜帶新霉素抗性基因的質(zhì)粒pSV2-neo(ATCC)共轉(zhuǎn)染N2A細胞。2-3周后，用G418篩選轉(zhuǎn)染細胞，挑取毒素STX存在下可誘導熒光素酶表達的陽性N2AC細胞。將N2AC細胞培養(yǎng)于含15％胎牛血清、200μl/ml新霉素的DMEM完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2)中。
2、測定方法將N2AC細胞接種于96孔板上100μl無血清培養(yǎng)基中，細胞密度為30000/孔。24h后加入不同劑量的5μM藜蘆定和毒素。吸去培養(yǎng)基，加入20μl細胞裂解液(1％Triton X-100，5mM Tris，0.4mM CDTA(反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸)，10％丙三醇，pH7.8，1mM DTT(二硫蘇糖醇)，在室溫下裂解20-30min.每孔加入100μl熒光素酶和ATP混合液(熒光素酶測定試劑，Promega公司)，10s后測定熒光強度。
該方法最大的優(yōu)點是直接利用了毒素的作用機理，因而不僅能夠給出毒素量的信息，更重要的是能夠反映毒素的毒力水平。用熒光素酶作報告基因來檢測毒素有許多優(yōu)點，如對樣品的要求不高，對設備和技術的要求不高，檢測的時間短，檢測的精確度也比較高等等。
但是由于實驗中所用熒光素酶的活性測定需要裂解細胞，不能活體檢測，提取酶的過程相對比較麻煩，因而不利于方法的推廣和利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是公開一種含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒，而該報告基因的活性測定不需要裂解細胞，能活體檢測，提取過程也方便。
本發(fā)明的又一目的是公開一種產(chǎn)生上述含c-fos啟動子和報告基因的質(zhì)粒的方法。
本發(fā)明的再一個目的是公開一種上述含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的用途。
本發(fā)明是通過如下技術方案來實現(xiàn)的。以綠色熒光蛋白GFP為報告基因，構(gòu)建含c-fos啟動子和EGFP報告基因的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒。
用上述pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒載體體外轉(zhuǎn)染真核細胞；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株；通過毒素對細胞鈉通道的阻滯或激活引起的細胞熒光蛋白表達的變化，即熒光強度的變化來檢測赤潮毒素(如GTX)。
因本發(fā)明中采用的報告基因是GFP，表達不受生物類型、基因型或細胞組織類型的限制，活性測定不需要裂解細胞，能進行活體檢測，對細胞無毒害、無需底物或共反應因子，所以用本發(fā)明的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒來檢測GTX赤潮毒素可彌補和克服熒光酶的缺陷，具有檢測方便，檢測結(jié)果可靠，適用范圍廣，能同時反映毒素水平與毒力的特點。


圖1是熒光報告基因表達強度與不同濃度GTX毒素的關系曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步描述。綠色熒光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)是源于水母(jellyfish)、海筆(sea pen，seapansy)等海洋無脊椎動物的一種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)在體外經(jīng)適當波長激發(fā)便可發(fā)出綠光，所發(fā)綠光可用普通熒光顯微鏡或熒光激活細胞分揀器檢測。作為報告基因，GFP的表達不受生物類型、基因型或細胞組織類型的限制，被認為是一種在生物界較為“通用’’的基因。由于其檢測方便、對細胞無毒害、無需底物或共反應因子，因而已廣泛應用于分子生物學、病毒學、生物醫(yī)學和環(huán)境檢測等領域?，F(xiàn)已在多種哺乳動物細胞(中國倉鼠卵巢細胞系、人體胚性腎細胞系、猿猴cos-1細胞系以及鼠NIH3 T3細胞系等)中表達成功。作為一種優(yōu)良的報告基因，GFP在藻毒素的檢測方面亦應當存在很好的應用前景。
本發(fā)明的具體步驟為構(gòu)建含c-fos啟動子和EGFP報告基因的pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒；用上述pEGFP-c-fos重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染真核細胞；篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。通過毒素對細胞鈉通道的阻滯或激活引起的細胞綠色熒光蛋白表達的變化，即熒光強度的變化來檢測赤潮毒素。
一、實驗材料1、菌株、質(zhì)粒1)菌株大腸桿菌E.coliDH5-α2)質(zhì)粒HP443質(zhì)粒由日本東京大學醫(yī)學院內(nèi)科學系IshikawaToshio教授惠贈。
2、生化試劑1)VspI，EcoRI，T4-DNALigase等工具酶購自美國MD公司；RNaseA購自Sigma公司；DL2000 Marker，DL15000 Marker購自Takara公司；PCR引物由上海博亞生物工程公司合成。
2)Tris，EDTA，Trytone，Yeast Extract、G418、飽和酚等試劑購自寶泰克生物工程公司。
3)Gel Extraction Kit，PCR Purification Kit購自德國QIAGEN公司；Promix Taq PCR試劑盒購自Takara公司。
二、方法步驟1、重組質(zhì)粒pEGFP-c-fos的構(gòu)建1)pEGFP質(zhì)粒的大量擴增、抽提pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行大量擴增；堿裂解法大量抽提pEGFP質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒純度和含量；用VspI、EcoRI對提取的質(zhì)粒pEGFP進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段酶切產(chǎn)物；回收pEGFP載體，去磷酸化后用PCR純化試劑盒純化去磷酸化產(chǎn)物。
2)c-fos啟動子的擴增、酶切及純化根據(jù)已公布的人c-fos啟動子的序列，設計兩端引物引物1為上游5’端引物，其中包含22個c-fos啟動子5’端互補的堿基，一個VspI識別位點，4個保護堿基。
引物2為下游3’端引物，其中包含21個與c-fos啟動子3’端互補的堿基，一個EcoRI識別位點，3個保護堿基Primer15’-TATAATTAATTTCTCATTCTGCGCCGTTCCCG-3’Primer25’-AAAGAATCCCCGCCGGCTCAGTCTTGGCTT-3’以含c-fos啟動子的HF443質(zhì)粒為模板，利用Takara公司的Promix Taq試劑盒進行PCR擴增。反應條件95℃，預變性5min，94℃40s；60℃，1min；72℃，1min，在PCR儀上進行30個循環(huán)，72℃延伸7min；反應結(jié)束后，各取5μl反應產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測；取200μl PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用QIAGEN公司凝膠回收試劑盒回收；將回收的PCR產(chǎn)物，用VspI和EcoRI雙酶切。
3)連接反應將雙酶切的pEGFP載體和c-fos啟動子片斷于在1.5ml的離心管中進行連接反應，16℃連接30min。
4)篩選重組子連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用。酶切、PCR、測序鑒定。
2.可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細胞株的建立1)細胞培養(yǎng)人膀胱移行細胞癌細胞系BIU-87細胞培養(yǎng)于含15％新生牛血清、100U/ml青霉素、25μg/ml鏈霉素的RMPI 1640完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2，飽和濕度)中，并使之維持單層貼壁生長，2天換液一次，用血清瓶大量培養(yǎng)BIU-87細胞，在細胞處于對數(shù)生長期時取少量細胞進行傳代，其他細胞進行實驗。
2)細胞轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選轉(zhuǎn)染細胞的前一天用0.25％胰酶和0.4％EDTA消化并記數(shù)細胞，使每瓶細胞濃度大約為1～2×105。分別溶解1～2μg DNA質(zhì)粒和5μl的Lipofect AMINE 2000于50μl的不含血清的培養(yǎng)基中，室溫溫育5min后混合20min。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用1ml的D-Hank’s液清洗細胞后，在培養(yǎng)瓶中加入2ml的RMPI 1640(不含雙抗，不含血清)。將DNA-Lipofect AMINE2000的混合物加入到RMPI 1640中，來回輕輕搖動混合均勻。37℃中溫育。在無血清溫育6h后，在培養(yǎng)體系中加入400μl的小牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h。次日用胰酶消化細胞，計數(shù)，使細胞濃度約為1～5×104。取一24孔培養(yǎng)板，按每孔1ml分別接種于各孔中。等細胞貼壁完全后，向每孔中加入G418篩選3～4周，直至抗性細胞克隆形成?？剐钥寺∩珊螅瑪U大培養(yǎng)，一部分凍存起來，一部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
3、赤潮毒素GTX的檢測取一24孔培養(yǎng)板，分別接種1ml濃度為1×105/ml的可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細胞，共7孔。等細胞貼壁完全后，先向每孔加入約100ng/ml的烏頭堿，30min后在向每孔依次加入不同濃度的PSP毒素GTX。12h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并拍照。采用美國Media Cybernetics公司的Image-pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對各濃度組圖片熒光強度進行分析統(tǒng)計，建立綠色熒光表達強度與不同濃度GTX毒素的關系曲線。
結(jié)果顯示，綠色熒光的表達強度與不同濃度GTX毒素的關系曲線大致成“V”字形。當GTX濃度小于50ng/ml時，熒光強度隨著GTX濃度的增加逐漸減弱；大于50ng/ml時熒光強度隨著GTX濃度的增加逐漸增強，與圖像觀察的結(jié)果相吻合。GTX對細胞中綠色熒光蛋白的表達存在一定的劑量依賴關系，特別是在低濃度范圍內(nèi)(小于50ng/ml)，GTX對綠色熒光蛋白表達的抑制作用更為靈敏、準確，GTX納克級的變化都會引起熒光強度的改變。說明利用該熒光報告基因的表達強度與不同濃度GTX毒素的關系曲線，可以用本發(fā)明的重組質(zhì)粒對赤潮毒素GTX進行定量的檢測。
權利要求
1.一種含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒，其特征是所述報告基因為EGFP基因。
2.一種按權利要求1所述的含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的產(chǎn)生方法，其特征是該質(zhì)粒的具體重組步驟為1)pEGFP質(zhì)粒的大量擴增、抽提用pEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行大量擴增；堿裂解法大量抽提pEGFP質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒純度和含量；用VspI、EcoRI對提取的質(zhì)粒pEGFP進行酶切，試劑盒凝膠回收大片段酶切產(chǎn)物；回收pEGFP載體，去磷酸化后用PCR純化試劑盒純化；2)c-fos啟動子的擴增、酶切及純化根據(jù)人c-fos啟動子的序列，設計兩端引物引物1為上游5’端引物，其中包含22個c-fos啟動子5’端互補的堿基，一個VspI識別位點，4個保護堿基；引物2為下游3’端引物，其中包含21個與c-fos啟動子3’端互補的堿基，一個EcoRI識別位點，3個保護堿基Primer1’-TATAATTAATTTCTCATTCTGCGCCGTTCCCG-3’Primer25’-AAAGAATCCCCGCCGGCTCAGTCTTGGCTT-3’以含c-fos啟動子的HF443質(zhì)粒為模板，利用Promix Taq試劑盒進行PCR擴增；反應條件95℃，預變性5min，94℃40s；60℃，1min；72℃，1min，在PCR儀上進行30個循環(huán)，72℃延伸7min；反應結(jié)束后，各取5μl反應產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測；取200μl PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，用凝膠回收試劑盒回收；將回收的PCR產(chǎn)物，用VspI和EcoRI雙酶切；3)連接反應將雙酶切的pEGFP載體和c-fos啟動子片斷于在1.5ml的離心管中進行連接反應，16℃連接30min；4)篩選重組子連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，擴增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用；酶切、PCR、測序鑒定。
3.一種按權利要求1所述的含c-fos啟動子和報告基因的重組質(zhì)粒的用途，其特征是該重組質(zhì)粒用于檢測GTX貝毒毒素，具體的應用步驟如下1)可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細胞株的建立(1)細胞培養(yǎng)人膀胱移行細胞癌細胞系BIU-87細胞培養(yǎng)于含15％新生牛血清、100U/ml青霉素、25μg/ml鏈霉素的RMPI 1640完全培養(yǎng)基(37℃，95％空氣5％CO2，飽和濕度)中，并使之維持單層貼壁生長，2天換液一次，用血清瓶大量培養(yǎng)BIU-87細胞，在細胞處于對數(shù)生長期時取少量細胞進行傳代，其他細胞進行實驗；(2)轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選轉(zhuǎn)染細胞的前一天用0.25％胰酶和0.4％EDTA消化并記數(shù)細胞，使每瓶細胞濃度大約為1～2×105/ml；分別溶解1～2μg DNA質(zhì)粒和5μl的Lipofect AMINE 2000于50μl的不含血清的培養(yǎng)基中，室溫溫育5min后混合20min；棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用1ml的D-Hank’s液清洗細胞后，在培養(yǎng)瓶中加入2ml不含雙抗、不含血清的RMPI 1640；將DNA-Lipofect AMINE2000的混合物加入到RMPI 1640中，來回輕輕搖動混合均勻；37℃中溫育；在無血清溫育6h后，在培養(yǎng)體系中加入400μl的小牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h；次日用胰酶消化細胞，計數(shù)，使細胞濃度約為1～5×104；取一24孔培養(yǎng)板，按每孔1ml分別接種于各孔中；等細胞貼壁完全后，向每孔中加入G418篩選3～4周，直至抗性細胞克隆形成；抗性克隆生成后，擴大培養(yǎng)，一部分凍存起來，一部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)；2)赤潮毒素GTX的檢測取一24孔培養(yǎng)板，分別接種1ml濃度為1×105的可穩(wěn)定表達pEGFP-c-fos的BIU-87細胞，共7孔；等細胞貼壁完全后，先向每孔加入約100ng/ml的烏頭堿，30min后在向每孔依次加入不同濃度的被測PSP毒素GTX；12h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并拍照；用專業(yè)圖像分析軟件對各濃度組圖片進行分析統(tǒng)計；將統(tǒng)計結(jié)果與圖1所示的綠色熒光表達強度與不同濃度GTX毒素的關系曲線進行比較；定量得出被測GTX赤潮毒素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含原癌基因c－fos啟動子和報告基因的pEGFP－c－fos重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和用途。該重組質(zhì)粒檢測GTX赤潮毒素，檢測方便、對細胞無毒害、無需底物或共反應因子，檢測結(jié)果可靠，適用范圍廣。
文檔編號C12Q1/68GK1492047SQ0314048
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權日2003年9月11日
發(fā)明者劉潔生, 楊維東, 吳春利 申請人:暨南大學