專利名稱：殺菌劑萬隆霉素及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)及農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種殺菌劑萬隆霉素及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)用抗生素具有選擇性較強、高效、低毒等特點，研究開發(fā)抗生素是農(nóng)藥研究的熱點。目前報道的防治植物病害的抗生素種類雖多，但能在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的種類卻較少，尚缺乏防治病害的高效、低毒的農(nóng)用抗生素。卵菌病害是指由卵菌綱藻狀真菌侵染蔬菜、果樹等主要經(jīng)濟作物而引起的病害，常見的如瓜類疫病、辣椒疫病、番茄晚疫病、馬鈴薯晚疫病、十字花科蔬菜霜霉病、瓜類霜霉病、荔枝霜霉病等，這些病害病情發(fā)展迅速，危害很大，常常造成大面積毀滅、失收。目前對植物卵菌病害的防治，主要依靠化學(xué)防治，常用殺菌劑主要是進(jìn)口的瑞毒霉、殺毒礬及國產(chǎn)的甲霜靈等藥物，這些藥劑價格昂貴，且使用多年，部分地區(qū)已產(chǎn)生抗藥性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供一種殺菌劑萬隆霉素及其應(yīng)用。該殺菌劑由一個新的鏈霉菌屬菌種產(chǎn)生，它適用于防治植物病害等，特別是細(xì)菌和卵菌綱真菌引起的病害，而且不污染環(huán)境，具有吸引人的防治效果。
本發(fā)明首先提供一個新的鏈霉菌屬的菌株，所述菌株被命名為Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.GAAS2507，它是從土壤樣品中分離所得，所述菌株于2003年7月7日在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NOM203059。
本發(fā)明所述的一種殺菌劑萬隆霉素，其特征是，它的有效成分的分子式為C53H67N13O13S2，分子量為1157，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

本發(fā)明所述的一種殺菌劑萬隆霉素，適用于防治細(xì)菌和卵菌病害，包括青枯病、水稻細(xì)菌性條斑病、水稻白葉枯病、細(xì)菌性軟腐病以及植物疫病、霜霉病、霜疫霉病、晚疫病，對鐮刀菌引起的病害以及枯草桿菌和大腸桿菌有效。
本發(fā)明所述一種殺菌劑萬隆霉素，可以通過下述方法制備第一步 將GAAS2507的培養(yǎng)物接種入營養(yǎng)培養(yǎng)基，在32℃和250rpm的振蕩下生長36小時；第二步 取成熟的第一階段營養(yǎng)培養(yǎng)物接種營養(yǎng)培養(yǎng)基，取得二次營養(yǎng)培養(yǎng)物，在32℃和300rpm條件下培養(yǎng)48小時，將成熟的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，在32℃和300rpm下保持培養(yǎng)4天；可用合適的溶劑提取成熟的發(fā)酵物，并通過色譜分離而獲得代謝物。
本發(fā)明所述菌株GAAS2507的培養(yǎng)物特征如下表表1


本發(fā)明所述菌株GAAS2507的形態(tài)特征為2507產(chǎn)生菌的孢子絲為松散螺旋形，孢子表面光滑。在高氏一號培養(yǎng)基上，其氣絲呈煙灰色，基絲無色至黃折色，不產(chǎn)色素。在形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理生化特性上與灰色變異鏈霉菌相似，修正又存在顯著的差異，因此定名為灰色變異鏈霉菌萬隆亞種(Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.)。
本發(fā)明所述菌株GAAS2507的生理特征為明膠液化可疑；牛奶凝固且強烈胨化；水解淀粉能力較強；纖維素上不生長；不產(chǎn)生H2S?？衫闷咸烟恰⑷樘?、棉子糖、麥芽糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、甘露糖、半乳糖；不利用D-果糖、山梨糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、菊糖、甜醇、山梨醇。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果1.本發(fā)明的制備工藝簡單、易操作、易制備。
2.本發(fā)明的殺菌劑萬隆霉素對卵菌劑細(xì)菌等植物病害防治效果好，比常規(guī)藥劑用量少，可以克服植物病害對常規(guī)農(nóng)藥的抗藥性。
3.本發(fā)明的殺菌劑使用安全，不污染環(huán)境，是一種無公害的生物農(nóng)藥。


圖1是本發(fā)明菌株GAAS2507的形態(tài)示意圖；圖2是本發(fā)明實施例四中被萬隆霉素抑制的節(jié)瓜枯萎病菌菌落示意圖。
本發(fā)明菌株Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensisn.subsp.GAAS2507于2003年7月7日在位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NOM203059。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
實施例一通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株GAAS2507而制備殺菌劑萬隆霉素。將1ml的冷凍的GAAS2507營養(yǎng)培養(yǎng)基融化，接種入500ml三角瓶內(nèi)的100ml營養(yǎng)培養(yǎng)基，在32℃和250rpm的振蕩下生長48小時。
表2 營養(yǎng)培養(yǎng)基成分成分名稱含量(％)葡萄糖 3玉米漿 1.5黃豆餅粉1.5淀粉1NaCl0.5(NH4)2SO40.5CaCO30.5pH 7.2取3500ml成熟的第一階段營養(yǎng)培養(yǎng)物用于接種50L攪拌式發(fā)酵罐的35L的營養(yǎng)培養(yǎng)基的二次營養(yǎng)培養(yǎng)物，在32℃和300rpm條件下培養(yǎng)48小時，將成熟的菌種接種到500L的攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)在32℃、300rpm下保持培養(yǎng)4天?？捎煤线m的溶劑提取成熟的發(fā)酵物，并通過色譜分離而獲得代謝物——殺菌劑萬隆霉素。
實施例二本發(fā)明可通過測試發(fā)酵液的提取物而在發(fā)酵期間跟蹤殺菌劑萬隆霉素的制備，例如通過生物測定法分析發(fā)酵液提取物。
發(fā)酵完畢，來自500L的發(fā)酵物，用板框壓濾的方法分離獲取菌絲，將菌絲用1∶2的丙酮溶液浸取10小時，將浸取液濃縮去丙酮，再用乙酸乙酯萃取有效物，將乙酸乙酯萃取液減壓濃縮獲取油狀物，提取濃縮液拌硅膠過柱，用乙酸乙酯、石油醚多次硅膠柱層析和濃縮，獲得油狀物質(zhì)純品。
實施例三本發(fā)明所述的一種殺菌劑萬隆霉素適用于防治細(xì)菌和卵菌病害，包括在田間使用病菌抑制量。通過殺菌劑萬隆霉素來防治植物病害的效果與使用次數(shù)和使用方法有關(guān)，同時與被防治的病害的種有關(guān)。本發(fā)明是通過中國發(fā)明專利申請(專利申請?zhí)枮?9117029.6)公開的技術(shù)方案來實現(xiàn)使用制劑的。
將殺菌劑萬隆霉素丙酮溶液用無菌水2倍稀釋，采用雙層瓊脂管碟法測定對枯草桿菌和細(xì)菌性條斑病菌的抑制曲線和MIC。使用結(jié)果如表3、4所示。
表3 殺菌劑萬隆霉素對枯草桿菌的抑制作用濃度 抑菌圈半徑(mm)(μg/ml)1 23 4 平均*100 8.258.50 10.50 11.50 9.688±0.786A50 8.008.25 9.759.758.938±40.472A25 7.107.10 8.008.757.738±0.399B12.56.406.50 7.007.756.913±0.308BC6.255.506.25 6.106.406.063±0.197C3.125 4.755.00 5.005.104.963±0.075D1.563 4.254.40 4.255.504.600±0.302D0.781 3.253.50 3.503.903.538±0.134E0.391 2.752.90 2.753.002.850±0.061E0.195 2.502.50 2.502.502.500±0.000ECK(無菌水) 2.502.50 2.502.502.500±0.000E回歸方程**Y＝0.0288484890X-0.4820479049*經(jīng)SAS統(tǒng)計軟件DUNCAN氏多重比較，R＝0.938006，P＝0.0001。
**根據(jù)殺菌劑萬隆霉素的濃度對數(shù)Y和抑菌圈半徑的平方值X，用SAS統(tǒng)計軟件求得回歸方程(R＝0.940579，P＝0.0001)。
表4 殺菌劑萬隆霉素對水稻細(xì)菌性條斑病菌的抑制作用濃度(μg/ml) 抑菌圈半徑(mm)1 2 3 4 5 平均*50 7.25 7.25 6.50 7.75 8.00 7.35±0.257A25 7.00 4.75 5.50 6.50 7.25 6.20±0.470B12.5 4.50 5.00 4.25 4.50 4.50 4.55±0.122C6.25 5.25 4.75 4.00 3.50 4.00 4.30±0.310C3.125 3.50 3.50 3.50 3.25 3.25 3.40±0.061D1.563 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00±0D0.781 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75 12.75±0D
CK(無菌水)回歸方程**Y＝0.0348525860X-0.0003572797*經(jīng)SAS統(tǒng)計軟件DUNCAN氏多重比較，R＝0.916090，P＝0.0001。
**根據(jù)殺菌劑萬隆霉素的濃度對數(shù)Y和抑菌圈半徑的平方值X，用SAS統(tǒng)計軟件求得回歸方程(R＝0.857593，P＝0.0027)。
實施例四采用培養(yǎng)基液體稀釋法和接種瓊脂塊法測定黃瓜疫病菌、節(jié)瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌和芒果炭蛆病菌的抑制曲線和LD50，使用結(jié)果如表5所示。
實驗結(jié)果表明，殺菌劑萬隆霉素對黃瓜疫病菌菌絲生長有明顯的抑制作用(見表5)，當(dāng)2507A1的濃度為50μg/ml時，黃瓜疫病菌菌絲生長被完全抑制。
通過回歸方程求得殺菌劑萬隆霉素對黃瓜疫病菌菌絲生長的LD50＝1.256μg/ml。
表5 殺菌劑萬隆霉素對黃瓜疫病菌生長的抑制作用效果濃度菌絲生長直徑*菌絲生長抑制率 抑菌工作幾率值(μg/ml)(42hrmm (％)50 0±0F 100 -25 8.7±0.539E 78.7 5.796112.512.5±0.880D69.4 5.50726.2514.0±0.158CD 65.8 5.40703.125 14.5±0.447C64.5 5.37191.563 16.0±1.007C60.9 5.27670.781 26.0±0.447B36.4 4.6505CK(無菌水) 40.9±0.843A-回歸方程**Y＝0.612791330X+4.939325911*經(jīng)SAS統(tǒng)計軟件DUNCAN氏多重比較，R＝0.987862，P＝0.0001。
**根據(jù)抑菌工作幾率值Y和殺菌劑萬隆霉素的濃度對數(shù)X(后6組數(shù)據(jù))，用SAS統(tǒng)計軟件求得回歸方程(R＝0.826143，P＝0.0121)。
結(jié)果表明，殺菌劑萬隆霉素對節(jié)瓜枯萎病菌菌絲生長也有較好的抑制作用(見表6，圖1)。根據(jù)回歸方程求得殺菌劑萬隆霉素對節(jié)瓜枯萎病菌菌絲生長的LD50＝20.570μg/ml。
表6 殺菌劑萬隆霉素對節(jié)瓜枯萎病菌生長的抑制作用效果濃度菌絲生長直徑*菌絲生長抑制率 抑菌工作幾率值(μg/ml)(60hrmm)(％)50 15.6±1.317F56.75.168725 16.7±0.436F53.65.090412.519.8±1.114E45.04.87436.2523.4±0.030D35.04.61473.125 24.6±0.678D31.74.52391.563 27.8±1.800C22.84.25460.781 32.8±0.200B8.9 3.65310.391 34.3±0.200AB 4.7 3.32530.195 33.4±0.748AB 7.2 3.5462CK(無菌水) 36.0±1.049A—回歸方程**Y＝0.807660378X+3.939351467*經(jīng)SAS統(tǒng)計軟件DUNCAN氏多重比較，R＝0.939921，P＝0.0001。
**根據(jù)抑菌工作幾率值Y和殺菌劑萬隆霉素的濃度對數(shù)X，用SAS統(tǒng)計軟件求得回歸方程(R＝0.937433，P＝0.0001)。
從試驗結(jié)果看出，本發(fā)明所述殺菌劑萬隆霉素效果很好，不但對植物細(xì)菌性病害防治效果很好，而且對植物卵菌病害效果也很好，對環(huán)境沒有污染。同時，可以克服植物病菌對藥劑的抗藥性。作為植物病害的防治劑，將有利于農(nóng)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)，從而產(chǎn)生較大的經(jīng)濟和社會效益。
如上所述，即可較好地實現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌屬的菌株，其特征是，它是從土壤樣品中分離所得，所述菌株Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.GAAS2507在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NOM203059。
2.一種殺菌劑萬隆霉素，其特征是，它的有效成分的分子式為C53H67N13O13S2，分子量為1157，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
3.一種殺菌劑萬隆霉素的應(yīng)用，其特征是，所述殺菌劑萬隆霉素適用于防治細(xì)菌和卵菌病害，包括青枯病、水稻細(xì)菌性條斑病、水稻白葉枯病、細(xì)菌性軟腐病以及植物疫病、霜霉病、霜疫霉病、晚疫病，對鐮刀菌引起的病害以及枯草桿菌和大腸桿菌有效。
全文摘要
本發(fā)明是一種殺菌劑萬隆霉素及其應(yīng)用，該殺菌劑的有效成分的分子式為C
文檔編號C12N1/20GK1513983SQ0314009
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月6日
發(fā)明者謝雙大, 林壁潤, 江學(xué)斌, 周小毛, 沈會芳, 謝逢春, 楊麗梅 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所