專利名稱：一種植物多基因表達(dá)載體、含有該載體的轉(zhuǎn)化子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效植物多基因表達(dá)載體、含有該載體的轉(zhuǎn)化子及其應(yīng)用。
除了雜草的危害之外，蟲(chóng)害又是農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素之一。目前，抗植物蟲(chóng)害的基因有多種，其中最常用的就是從蘇云金芽孢桿菌中分離出來(lái)的殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白基因，即Bt基因。其產(chǎn)物伴孢晶體蛋白可特異地毒殺鱗翅目，雙翅目或鞘翅目昆蟲(chóng)。其作用機(jī)理就是當(dāng)昆蟲(chóng)取食含有ICP(殺蟲(chóng)結(jié)晶蛋白)后，在昆蟲(chóng)的消化道內(nèi)，ICP被活化，活化的ICP與昆蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞的受體蛋白結(jié)合，結(jié)合以后，ICP全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中，使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道，從而導(dǎo)致細(xì)胞由于滲透平衡被破壞而破裂。伴隨著上述過(guò)程，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)將停止進(jìn)食，最終導(dǎo)致死亡。由于殺蟲(chóng)晶體蛋白的毒性是高度專一的，對(duì)人類和動(dòng)物沒(méi)有影響，因此，它作為生物殺蟲(chóng)劑，已廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)，林業(yè)，蔬菜以及環(huán)境害蟲(chóng)等。目前，國(guó)內(nèi)外已用改造后的Bt基因經(jīng)植物轉(zhuǎn)化獲得了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米，棉花，水稻，馬鈴薯等多種轉(zhuǎn)基因植物，有的已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但是，這些Bt基因產(chǎn)物一般都在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的高水平表達(dá)和積累，必然會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的生理功能產(chǎn)生一定的干擾，使轉(zhuǎn)基因植物的某些性狀受到影響。有些轉(zhuǎn)Bt基因植株往往抗蟲(chóng)性越高，其農(nóng)藝性狀與原始受體植物的差別就越大，造成這種現(xiàn)象的原因是多方面的，外源基因產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累應(yīng)是其中之一。
本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體，其特征是該載體含有抗生素抗性基因、草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因。
本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體可以是在基本載體pCAMBIA的MCS位點(diǎn)處插入草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因而構(gòu)成的。所用的基本載體pCAMBIA中含有Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右邊界序列(LB和RB)，在該段DNA中含有多克隆位點(diǎn)(MCS)，在該載體的MCS位點(diǎn)處插入草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因。所得到的植物多基因表達(dá)載體之一命名為pBts1m/aroM12，其所攜帶的抗生素抗性基因?yàn)镹PTII，抗草甘膦基因?yàn)閍roAM12(中國(guó)專利申請(qǐng)CN1358858)，抗蟲(chóng)基因?yàn)锽tS1m(中國(guó)專利申請(qǐng)CN1393561A)，這些基因位于載體的T-DNA左右邊界序列LB和RB區(qū)域之內(nèi)；其中，抗生素抗性基因所處的表達(dá)框?yàn)镹osp-NPTII-Nos；抗草甘膦基因aroAM12所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子CaMV35s，(II)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列ASP，(III)抗草甘膦基因aroAM12編碼序列和(IV)3′端的非翻譯區(qū)PolyA片段；抗蟲(chóng)基因BtS1m所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，包含有2個(gè)增強(qiáng)子的35s啟動(dòng)子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段，(III)帶分泌信號(hào)肽的嵌合Bt殺蟲(chóng)蛋白編碼序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的轉(zhuǎn)錄終止序列。
為使植物表達(dá)的Bt殺蟲(chóng)蛋白能分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞間隙以提高殺蟲(chóng)蛋白的穩(wěn)定性，同時(shí)減輕Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)植物細(xì)胞正常功能的干擾作用，以有利于篩選到農(nóng)藝性狀變化不大的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明上述的植物多基因表達(dá)載體pBts1m/aroM12所用的Bt基因是由煙草致病相關(guān)蛋白(PR1b)的信號(hào)肽，Cry1Ab的N端331個(gè)氨基酸及Cry1Ac C端284個(gè)氨基酸的編碼序列組成的一個(gè)嵌合殺蟲(chóng)蛋白基因BtS1m(中國(guó)專利申請(qǐng)CN1393561A)。
由本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue可得到含有該質(zhì)粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。
由本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌可得到含有該質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。該農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子可用于轉(zhuǎn)化植物，獲得抗草甘膦抗蟲(chóng)植株。
本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404得到的含有該質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子用于轉(zhuǎn)化煙草或棉花，并以其中的抗生素抗性基因(NPTII)為篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，可獲得抗草甘膦抗蟲(chóng)的煙草或棉花植株。
試驗(yàn)證明，用本發(fā)明轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植物，不僅具有良好的抗草甘膦性狀，而且具有良好的抗蟲(chóng)性狀。
以下通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1是含有2E-35S+Ω片段的pCR2.1.2Ep質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2是含有2E-35S+Ω+aroAM12片段的質(zhì)粒pCR2.1.2EpM12構(gòu)建示意圖。
圖3是含有aroAM12基因和BtS1m基因的pBtS1m/aroAM12植物多價(jià)基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
圖4中a是轉(zhuǎn)基因煙草aroAM12基因的Southern blot檢測(cè)結(jié)果，b是轉(zhuǎn)基因煙草BtS1m基因的Southern blot檢測(cè)結(jié)果。
圖5中a是轉(zhuǎn)基因煙草的EPSPS蛋白Immunodot blot檢測(cè)結(jié)果，b是轉(zhuǎn)基因煙草的Bt毒蛋白Immunodot blot檢測(cè)結(jié)果。
圖6是轉(zhuǎn)基因煙草草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖7是轉(zhuǎn)基因棉花草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖8是轉(zhuǎn)基因煙草抗蟲(chóng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表1.1 HindIII+BamHI雙酶切反應(yīng)及電泳體系質(zhì)粒載體DNA 20.0μlHindIII(10U/μl) 4.0μlBamHI(10U/μl) 4.0μl10x反應(yīng)緩沖液8.0μlddH2O 44.0μl在37℃條件下保溫3小時(shí)，然后用1XTAE(0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA)電泳緩沖液配制1.0％的瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖凝膠里加入EB(溴化乙錠)至終濃度為0.5μg/ml，在3-5V/cm的電壓降下電泳。
表1.2連接反應(yīng)體系DNA片段1 5.0μlDNA片段2 5.0μl
ddH2O 7.5μlT4 Ligase(5weiss U/ul)0.5μlT4 Ligase緩沖液(10x) 2.0μl在16℃條件下連接反應(yīng)過(guò)夜。
實(shí)施例2大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的獲得E.coli XL-1-blue感受態(tài)細(xì)胞的制備①將XL1-blue的單菌落接入5mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基(見(jiàn)表2.1)中，37℃、震蕩過(guò)夜；②按1％(v/v)的量轉(zhuǎn)入新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩至OD600＝0.3；③將50-100mL的LB液體培養(yǎng)基(LB配制見(jiàn)表2.1)加入兩個(gè)無(wú)菌離心管中，在冰上放置30分鐘；④在4℃、4000rpm(轉(zhuǎn)/分)離心10分鐘，去上清液，在每個(gè)離心管中加入10mL預(yù)冷的0.1％CaCl2溶液重懸菌體，冰浴30分鐘.⑤在4℃、4000rpm離心10分鐘，去上清液，將菌體懸浮于2mL預(yù)冷的0.1％的CaCl2溶液中，再加入300μL的無(wú)菌甘油，混勻，在每個(gè)無(wú)菌的離心管中加入100uL XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，于-70℃保存。
取實(shí)施例1中的連接產(chǎn)物(多價(jià)質(zhì)粒載體pBts1m/aroM12)10μl，加入到剛好融化的大腸桿菌XL-1-blue感受態(tài)細(xì)胞中，輕微混勻，冰浴半小時(shí)；42℃水浴熱激90秒鐘，然后冰浴1-2分鐘。加LB培養(yǎng)基1ml于Eppendorf管中，37℃水浴培養(yǎng)1小時(shí)，13000rpm離心5秒鐘，去上清，加入100μl LB培養(yǎng)基，混勻，涂在LB+Km(kanamycine，卡那霉素)平板上。37℃培養(yǎng)24小時(shí)左右時(shí)，挑取單菌落，搖菌過(guò)夜，采用E.Z.N.APlasmid miniprep Kit回收質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切檢測(cè)后，挑選出陽(yáng)性質(zhì)粒，保存相應(yīng)的菌落，即轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子用于提取多價(jià)質(zhì)粒載體pBts1m/aroM12。
表2.1 LB液體培養(yǎng)基成分細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 10g；細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g；NaCl 10g；去離子水 950mL(若配制固體培養(yǎng)基則再按18-20g/L的量加入瓊脂。)完全溶解后用5mol/L NaOH調(diào)pH7.2，再加入去離子水至總體積為1L，然后高壓滅菌即可。
實(shí)施例3根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備①?gòu)暮墟溍顾?str)和利福平(Rif)的YEB固體培養(yǎng)基(見(jiàn)表3.1)平板上挑取LBA4404菌落，接種到5ml含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基(按表3.1，不加瓊脂)中，28℃，200rpm震蕩過(guò)夜。②用YEB液體培養(yǎng)基稀釋至50ml，然后28℃、200rpm培養(yǎng)6-12小時(shí)，至OD600值為0.6左右。③置于冰上5分鐘，然后于4℃、2000rpm離心7分鐘。④取1ml濃度為20mmol/L冰冷的CaCl2溶液重懸沉淀，混勻。⑤分裝成10份，每份100μl，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 向-70℃冰箱中保存的桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞100μl中加入實(shí)施例2中所提取的質(zhì)粒5μl，37℃水浴5分鐘，之后加入1mlYEB液體培養(yǎng)基，室溫下放置3小時(shí)。6000rpm離心30秒，倒掉上清，加入100μlYEB，混勻，涂布在YEB+Str+Rif+Km平板上。48小時(shí)左右時(shí)，挑取單菌落(經(jīng)酶切和PCR檢測(cè)，確認(rèn)為含有多價(jià)質(zhì)粒載體pBts1m/aroM12)，搖菌過(guò)夜，培養(yǎng)至OD600值為0.4-0.6時(shí)用于感染。
表3.1YEB固體培養(yǎng)基成分細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 5g/L細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g/L蔗糖 5g/L硫酸鎂 2mmol/L調(diào)pH值至7.2，按18g/L的量加入瓊脂。
實(shí)施例4含有多基因表達(dá)載體的工程菌對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得將實(shí)施例3得到的工程菌感染煙草外植體(葉片，剪成0.5×0.5cm大小)5分鐘，用經(jīng)過(guò)高壓滅菌的濾紙吸干，移入到MS+6-BA(6-benzyladenine，6-芐基嘌呤)1mg/L+NAA(naphthalene acetic acid，萘乙酸)0.1mg/L+3％蔗糖+0.7％瓊脂的培養(yǎng)基中暗處共培養(yǎng)48小時(shí)。用無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌濾紙吸干，然后移入到含有頭孢霉素(400mg/L)的MS+6-BA 1mg/L+NAA0.1mg/L+Km 100mg/L分化培養(yǎng)基中，28±2℃，漫射光條件培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化。當(dāng)誘導(dǎo)出的不定芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，切下移入到MS+NAA(0.1mg/L)生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根的形成。一周后不定根出現(xiàn)。再過(guò)兩周后打開(kāi)瓶蓋煉苗2-3天，將苗取出，用自來(lái)水沖去根部培養(yǎng)基，移到盆中，保濕1周后即可成活。
實(shí)施例5含有多基因表達(dá)載體的工程菌對(duì)棉花的轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得將實(shí)施例3得到的工程菌感染棉花外植體(下胚軸，剪成0.3～0.5cm大小)7分鐘，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上(MS+0.1mg/L 2，4-D+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+200mg/L乙酰丁香酮+6％瓊脂，pH5.0)暗處培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)抗性愈傷組織培養(yǎng)基(MS+0.1mg/L 2，4-D+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+0.91g/L MgCl2+Km 100mg/L+2.0g/L Gelrite+500mg/L頭孢霉素，pH5.8)上培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗性愈傷的形成。在常規(guī)條件下(25℃)培養(yǎng)2個(gè)月左右，將誘導(dǎo)出的愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS+0.91g/L MgCl2+2.0g/L Gelrite+500mg/L頭孢霉素，pH5.8)上增殖，繼代2次后，將米粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上(MS+B5+1g/L天門(mén)冬酰胺+2g/L谷氨酰胺+30g/L葡萄糖+2.5g/LGelrite，pH5.8)，進(jìn)一步分化成胚狀體，胚狀體長(zhǎng)成小植株后，通過(guò)嫁接法獲得成苗，煉苗后轉(zhuǎn)移到溫室中盆栽。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因煙草Southern blot檢測(cè)用CTAB法提取植物DNA，取25μg總DNA，經(jīng)EcoRI完全酶切后，0.8％Agarose膠電泳，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，用α-32P-dCTP作為標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行分子雜交，結(jié)果如圖4所示。其中圖4a表示抗草甘膦基因aroAM12整合進(jìn)煙草植株(1～6)中，圖4b表示抗蟲(chóng)基因BtS1m整合進(jìn)煙草植株(1～4)中，且均具有不同的拷貝數(shù)。
轉(zhuǎn)基因煙草Immunodot blot檢測(cè)取煙草幼葉，液氮中研碎，加入提取緩沖液(10mmol/LTris.HCl，0.02％NaN3，0.001％PMSF pH9.0)，離心，取上清，得到植物總蛋白粗提物。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。參照BCPI/NBT System Blot試劑盒所提供的方法，分別用EPSPS抗血清(兔抗血清，效價(jià)1∶200，實(shí)驗(yàn)室自制)和Bt蛋白抗血清(兔抗血清，效價(jià)1∶250，)進(jìn)行Immunodot blot檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，表明aroAM12和BtS1m基因在翻譯水平上進(jìn)行了高效表達(dá)。
實(shí)施例7植株對(duì)草甘膦的抗性檢測(cè)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)草甘膦的抗性情況，取實(shí)施例4所獲得轉(zhuǎn)化煙草苗幼葉，剪成0.5×0.5cm大小，放在含有不同草甘膦濃度的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果表明所有轉(zhuǎn)基因煙草(A)葉片均能在含1.00mmol/L草甘膦濃度的培養(yǎng)基上萌芽，部分能抗1.20mmol/L草甘膦，而非轉(zhuǎn)基因煙草(B)在含0.02mmol/L草甘膦濃度的培養(yǎng)基上葉片逐漸失綠變白而死亡(圖6)，表明獲得的煙草植株抗性提高了50～60倍。
為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)草甘膦的抗性情況，將盆栽的轉(zhuǎn)基因棉花苗(TG)和野生型對(duì)照(CK)用1.85g/L濃度的草甘膦每隔7天噴灑一次，一共噴灑3次，結(jié)果如圖7所示，表明獲得的轉(zhuǎn)基因棉花具有很強(qiáng)的抗草甘膦特性。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株與常規(guī)煙草(對(duì)照)兩個(gè)處理。用于處理1齡幼蟲(chóng)的煙葉放入鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，葉柄基部用濕潤(rùn)的脫脂棉球包裹，以防葉片迅速萎焉。試驗(yàn)組和對(duì)照組各接入1齡棉鈴蟲(chóng)5頭。接蟲(chóng)后置于28±2℃，光照∶黑暗＝16∶8hrs的溫室中，3天后觀察幼蟲(chóng)的生存和發(fā)育的情況。結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出，多價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出良好的抗蟲(chóng)效果。
權(quán)利要求
1.一種植物多基因表達(dá)載體，其特征是該載體含有抗生素抗性基因、草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的載體，其特征是該載體是在基本載體pCAMBIA的MCS位點(diǎn)處插入草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因而構(gòu)成的。
3.按照權(quán)利要求2所述的載體，其特征是該載體為pBts1m/aroM12，其所攜帶的抗生素抗性基因?yàn)镹PTII，抗草甘膦基因?yàn)閍roAM12，抗蟲(chóng)基因?yàn)锽tS1m，這些基因位于載體的T-DNA左右邊界序列LB和RB區(qū)域之內(nèi)；其中，抗生素抗性基因所處的表達(dá)框?yàn)镹osp-NPTII-Nos；抗草甘膦基因aroAM12所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子CaMV35s，(II)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列ASP，(III)抗草甘膦基因aroAM12編碼序列和(IV)3′端的非翻譯區(qū)PolyA片段；抗蟲(chóng)基因BtS1m所在表達(dá)框的構(gòu)成是從5′到3′端方向(I)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，包含有2個(gè)增強(qiáng)子的35s啟動(dòng)子，即2E-35sp，(II)TMVRNA的Ω片段，(III)帶分泌信號(hào)肽的嵌合Bt殺蟲(chóng)蛋白編碼序列BtS1m，(IV)Nos，3′端的轉(zhuǎn)錄終止序列。
4.由權(quán)利要求1，2或3所述的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue所得到的含有該質(zhì)粒的細(xì)菌轉(zhuǎn)化子。
5.由權(quán)利要求1，2或3所述的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404所得到的含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。
6.權(quán)利要求5所述的含植物多價(jià)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子用于轉(zhuǎn)化植物，獲得抗草甘膦抗蟲(chóng)植株。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是轉(zhuǎn)化的植物是煙草或棉花，以抗生素抗性基因NPTII為篩選標(biāo)記，獲得抗草甘膦抗蟲(chóng)煙草或棉花植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效植物多基因表達(dá)載體、含有該載體的轉(zhuǎn)化子及其應(yīng)用。該載體含有抗生素抗性基因、草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因。該載體是在基本載體pCAMBIA的MCS位點(diǎn)處插入草甘膦抗性基因和抗蟲(chóng)基因而構(gòu)成的。該載體之一命名為pBtslm/aroM12，其所攜帶的抗生素抗性基因?yàn)镹PTII，抗草甘膦基因?yàn)閍roAM12，抗蟲(chóng)基因?yàn)锽tS1m。由本發(fā)明的植物多基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌可得到含有該質(zhì)粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌可得到含有該質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。該農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子可用于轉(zhuǎn)化植物，獲得抗草甘膦抗蟲(chóng)植株。由本發(fā)明多基因表達(dá)載體pBts1m/aroM12轉(zhuǎn)化植物后，以NPTII為選擇標(biāo)記，篩選出的轉(zhuǎn)基因植株具有很強(qiáng)的抗草甘膦和抗蟲(chóng)性狀，證明arM12基因和Bts1m基因都進(jìn)行了高效表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1478897SQ0313969
公開(kāi)日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者謝龍旭, 徐培林, 田穎川, 劉正德 申請(qǐng)人:中山大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所