專利名稱：一種基于dna適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種基因多態(tài)性測(cè)定方法，具體說(shuō)是一種利用酶切技術(shù)、酶聯(lián)技術(shù)和等位基因擴(kuò)增技術(shù)測(cè)定基因多態(tài)性的方法，可用于檢測(cè)基因組DNA的多態(tài)性和基因突變等。
為了解決這一問(wèn)題，有多種方法，其中常用的方法是先用PCR法預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA，然后將之作為模板再擴(kuò)增成小的片段[1]。然而這種方法不是一個(gè)通用方法，不適用于同時(shí)擴(kuò)增復(fù)雜基因組中的不同部分。另一種方法[2]是通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)，第一輪是用低濃度的基因特異性引物來(lái)擴(kuò)增，各引物的5′端含有相同的錨定部分，第二輪是采用高濃度的通用型短引物來(lái)擴(kuò)增，該引物與上述基因特異性引物的錨定部分序列相同。然而不管怎樣，這種用常規(guī)PCR方法進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增的片段數(shù)仍然在10左右，并且需要精心設(shè)計(jì)引物，不能用于常規(guī)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提出一種用n+1個(gè)引物進(jìn)行n-重PCR擴(kuò)增反應(yīng)的方法，使得n-重PCR擴(kuò)增的通量及準(zhǔn)確性得到進(jìn)一步提高。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于(a)采用限制性內(nèi)切酶將長(zhǎng)的DNA鏈切割成含有酶切切口的短的DNA片段；(b)在連接酶的存在下用雙鏈部分互補(bǔ)的DNA適配器與(a)中短的DNA片段連接；(c)用一個(gè)通用引物和一個(gè)等位基因特異性引物對(duì)(b)中經(jīng)與DNA適配器連接的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(d)采用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)(c)中經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段。
上述的長(zhǎng)的DNA鏈，其中DNA鏈?zhǔn)侵富蚪MDNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄后的雙鏈cDNA。
所述的DNA適配器中，其由兩條DNA單鏈組成，其中一端互補(bǔ)，另一端不互補(bǔ)，是一分叉型結(jié)構(gòu)；其雙鏈互補(bǔ)的一端含有與權(quán)利要求項(xiàng)1(a)中所述的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)一致的序列；其雙鏈不互補(bǔ)一端中的5′端鏈含有8個(gè)堿基以上的不互補(bǔ)序列。
所述的通用引物，其序列與DNA適配器的不互補(bǔ)端中5′端鏈的序列相同。
所述的等位基因特異性引物，其3′端正好位于單堿基多態(tài)性位點(diǎn)或突變點(diǎn)。
所述的適當(dāng)方法，包括電泳分離方法和色譜分離方法等，電泳分離方法包括毛細(xì)管電泳，芯片電泳，凝膠電泳等。
所述的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，每個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)由兩次PCR擴(kuò)增完成，兩次擴(kuò)增所用引物對(duì)中的等位基因特異性引物的3′端分別用于確定等位基因的兩種類型?；蛘?，每個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)可在單管中由一次PCR擴(kuò)增完成；擴(kuò)增所用引物為三個(gè)，其中兩個(gè)引物為等位基因特異性引物，其5′端分別標(biāo)記有發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光染料，另一個(gè)為通用引物；兩個(gè)等位基因特異性引物分別用于確定等位基因的兩種類型。或者，用n個(gè)不同的等位基因特異性引物和1個(gè)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明的主要特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)等位基因位點(diǎn)的分析。由于擴(kuò)增中采用了一個(gè)共用引物P1，當(dāng)進(jìn)行n重等位基因擴(kuò)增時(shí)，在單管中僅需加入n+1個(gè)引物，因此可以大大減少多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)中多個(gè)引物的相互作用，使擴(kuò)增效率顯著提高，也可以減少優(yōu)化多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的時(shí)間。
圖2是用本發(fā)明的方法檢測(cè)基因多態(tài)性位點(diǎn)CYP2D6*10的凝膠電泳圖譜。
如

圖1所示，假設(shè)某段基因組DNA 1上有兩個(gè)待測(cè)等位基因位點(diǎn)2和3，利用限制性內(nèi)切酶，如Mbo I(切點(diǎn)序列為“GATC”)，將1切成末端含有酶切位點(diǎn)的DNA短片段，如分別含有2和3的DNA片段4和5。在酶解產(chǎn)物中，加入一個(gè)由兩條鏈組成的DNA適配器6，6的一端為含有酶切切口的粘性端，另一端為分叉型結(jié)構(gòu)，其中5′端的不互補(bǔ)部分鏈較長(zhǎng)，約含有10-30個(gè)堿基，在連接酶的作用下，6與4和5分別連接成DNA片段7和8。為了同時(shí)測(cè)定等位基因的兩個(gè)類型，取含有DNA片段7和8的酶連產(chǎn)物適量，分別加于兩支PCR用擴(kuò)增小管中，分別記為管A和管B，其中管A中加入與等位基因位點(diǎn)2和3的一種類型相互補(bǔ)的特異性引物P2和引物P3。由于等位基因通常僅有兩種可能的類型，故在管B中加入與等位基因位點(diǎn)2和3的另一種類型相互補(bǔ)的特異性引物P2’和P3’。在管A和管B中同時(shí)加入PCR擴(kuò)增必需的另一條共用引物P1，P1的序列與DNA適配器6分叉端一條鏈的5′端序列完全一致。在加入必要的PCR擴(kuò)增試劑后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，如果3為雜合子，2為純合子，P2為與2相匹配的特異性引物，則在管A中含有兩條DNA擴(kuò)增產(chǎn)物9和10；在管B中僅有擴(kuò)增片段10。最后采用分離方法，如瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)了如圖1中所示的凝膠電泳圖像11和12。根據(jù)DNA條帶的大小就可快速判斷2和3的基因多態(tài)性類型。
由于等位基因擴(kuò)增的特異性有時(shí)不夠理想，如果出現(xiàn)這種情況，可通過(guò)改變特異性引物3’端的序列來(lái)提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。實(shí)施例1 凝膠電泳法測(cè)定CYP2D6基因多態(tài)性位點(diǎn)CYP2D6*10按照本發(fā)明中的方法，測(cè)定了CYP2D6基因中的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)CYP2D6*10。該位點(diǎn)的堿基類型為C/T，為了說(shuō)明本法的每一步操作過(guò)程，并用電泳結(jié)果表示，首先用一對(duì)引物擴(kuò)增基因組DNA，產(chǎn)生含有該位點(diǎn)的片段，引物P1和P2的序列分別為5′-AACACAGCAGGTTCACTCACAG-3′和5′-CCCAGACTA CAG GTC CTA GTC C-3′。擴(kuò)增DNA的片段長(zhǎng)度為1009bp，如圖2中的槽1結(jié)果所示。將該片段用限制性內(nèi)切酶Mbo I切割，應(yīng)產(chǎn)生918bp和95bp的兩條DNA片段。根據(jù)圖2中槽2的檢測(cè)結(jié)果，酶切成功，產(chǎn)生了918bp的DNA片段。由于95bp太短，未能在電泳中產(chǎn)生可觀察到的清晰條帶，在本例中僅使用918bp的片段進(jìn)行測(cè)定。
用DNA連接酶(DNA ligase)將上述酶解產(chǎn)物與DNA適配器相連接。DNA適配器的兩條鏈的序列分別為5’-ccc cac ttc ttg ttc tct cat cag gcg cat cac t cg-3’和5’-gatccg agt gat gcg cta ag-3’，連接后產(chǎn)生約950bp的條帶，如圖2中槽3的檢測(cè)結(jié)果所示。再將連接產(chǎn)物分成兩份，在其中一份中加入一條共用引物P3(序列為5’-ccc cacttc ttg ttc tct cat-3’)和一條用于特異性擴(kuò)增CYP2D6*10等位基因C型的引物P4(序列為5’-acg ctg ggc tgc acg cta ct-3’)，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)，產(chǎn)生一條鏈長(zhǎng)為670bp的DNA片段，如圖2中的槽4結(jié)果所示；在另一份連接產(chǎn)物中加入一條共用引物P3和一條用于特異性擴(kuò)增CYP2D6*10等位基因T型的引物P5(序列為5’-acg ctg ggc tgcacg cta cc-3’)，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中未見(jiàn)DNA條帶。
當(dāng)以基因組DNA為模板直接測(cè)定時(shí)，其實(shí)驗(yàn)步驟為取50-200μg基因組DNA(預(yù)先用試劑盒將血液中的DNA提取出來(lái))，加入到20μl試管中，另加入MbOI內(nèi)切酶10U(Takara)，反應(yīng)緩沖液(10倍，Takara)2μl，加水至20μl，在37℃水浴中保溫反應(yīng)2小時(shí)。將該反應(yīng)液在75℃保溫15min，使內(nèi)切酶去活。取酶切液2μl至PCR反應(yīng)試管中，加入DNA適配器(由20pmol的5’-ccc cac ttc ttg ttc tct catcag gcg cat cac t cg-3’和20pmol的5’-gat ccg agt gat gcg cta ag-3’退火產(chǎn)物組成)，2μl 25％的PEG-8000，2μl 5mmol/LATP溶液，1μl 100mmol/L DTT溶液，T4DNA連接酶20U，加水至20μl，在16℃水浴中保溫2小時(shí)。取此連接產(chǎn)物各2μl置兩支PCR反應(yīng)管中，在一支中加入20pmol P4和20pmol共用引物P3；在另一支中加入20pmol P5和20pmol P3，然后在兩管中均加入2.5μl 10倍緩沖液，1.5μl 50mmol/L MgCl2溶液，2μl 2.5mmol/L的dNTP溶液和1.25μl 0.5U/μl Taq聚合酶(Takara)，加水至25μl，在PCR擴(kuò)增儀(PT-225，MJ Research，美國(guó))上擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃5min，然后按下列程序循環(huán)反應(yīng)35次94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min。最后在72℃繼續(xù)延伸反應(yīng)7min，于4℃保存。在2％瓊脂糖凝膠電泳上點(diǎn)樣分析。實(shí)施例2兩重基因多態(tài)性位點(diǎn)的同時(shí)測(cè)定在本實(shí)施例中，以同時(shí)測(cè)定基因多態(tài)性位點(diǎn)CYP2D6*10和ABCA1基因中的I823M為例來(lái)闡述本專利的特點(diǎn)。測(cè)定CYP2D6*10等位基因類型的兩條特異性引物的序列分別為P4和這P5，序列同實(shí)施例1。測(cè)定ABC1基因I823M等位基因類型的兩條特異性引物的序列分別為P65’-gtt cca acc aga aga gat ta-3’和P75’-gtt cca acc aga aga gat tg-3’。
按照實(shí)施例1的相同方法制備酶連產(chǎn)物，各取2μl該溶液分別置2支PCR反應(yīng)管中，在管1中加入20pmol的P4、P6和共用引物P3。在管2中加入20pmol的P5、P7和共用引物P3，按實(shí)施例1的方法在兩管中加入PCR擴(kuò)增反應(yīng)的試劑，并在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。根據(jù)兩管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的有無(wú)和長(zhǎng)短判定兩種等位基因的類型。
參考文獻(xiàn)[1]Van Orsouw NJ，Zhang X，Wei JY，Johns DR，Vijg J.Mutational scanning ofmitochondrial DNA by two-dimensional electrophoresis，Genomics.1998，15；52(1)27-36.[2]Shuber AP，Grondin VJ，Klinger KW.A simplified procedure for developingmultiplex PCRs.Genome Res.1995，5(5)488-93.
權(quán)利要求
1.一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于(a)采用限制性內(nèi)切酶將長(zhǎng)的DNA鏈切割成含有酶切切口的短的DNA片段；(b)在連接酶的存在下用雙鏈部分互補(bǔ)的DNA適配器與(a)中短的DNA片段連接；(c)用一個(gè)通用引物和一個(gè)等位基因特異性引物對(duì)(b)中經(jīng)與DNA適配器連接的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(d)采用適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)(c)中經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的長(zhǎng)的DNA鏈，其中DNA鏈?zhǔn)侵富蚪MDNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄后的雙鏈cDNA。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其由兩條DNA單鏈組成，其中一端互補(bǔ)，另一端不互補(bǔ)，是一分叉型結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其雙鏈互補(bǔ)的一端含有與權(quán)利要求項(xiàng)1(a)中所述的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)一致的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的DNA適配器中，其雙鏈不互補(bǔ)一端中的5′端鏈含有8個(gè)堿基以上的不互補(bǔ)序列。
6.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的通用引物，其序列與權(quán)利要求5中所述的DNA適配器的不互補(bǔ)端中5′端鏈的序列相同。
7.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的等位基因特異性引物，其3′端正好位于單堿基多態(tài)性位點(diǎn)或突變點(diǎn)。
8.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的適當(dāng)方法，包括電泳分離方法和色譜分離方法等。
9.如權(quán)利要求8所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的電泳分離方法，包括毛細(xì)管電泳，芯片電泳，凝膠電泳等。
10.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，每個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)由兩次PCR擴(kuò)增完成，兩次擴(kuò)增所用引物對(duì)中的等位基因特異性引物的3′端分別用于確定等位基因的兩種類型。
11.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，每個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)可在單管中由一次PCR擴(kuò)增完成；擴(kuò)增所用引物為三個(gè)，其中兩個(gè)引物為等位基因特異性引物，其5′端分別標(biāo)記有發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光染料，另一個(gè)為通用引物；兩個(gè)等位基因特異性引物分別用于確定等位基因的兩種類型。
12.如權(quán)利要求1所述的一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，其特征在于所述的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，用n個(gè)不同的等位基因特異性引物和1個(gè)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明一種基于DNA適配器的基因多態(tài)性測(cè)定法，屬于一種檢測(cè)DNA單核苷酸多態(tài)性的方法。具體來(lái)說(shuō)由以下四步組成(1)用內(nèi)切酶消化基因組DNA，將DNA長(zhǎng)鏈切割成含有粘性切口的短片段；(2)設(shè)計(jì)DNA適配器，并將其與上述含有粘性切口的短DNA片段連接；(3)采用等位基因特異性引物和一個(gè)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)用電泳或色譜法分離上述經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段；(5)根據(jù)DNA片段的長(zhǎng)度判斷等位基因的類型或基因的突變類型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1473944SQ0313228
公開(kāi)日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者周國(guó)華 申請(qǐng)人:周國(guó)華, 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)聯(lián)勤部軍事醫(yī)學(xué)研究所