專利名稱：泛酸與潰瘍藥物療效檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體泛酸與 潰瘍藥物療效的試劑盒，通過檢測質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、 CYP3A4基因和CYP3A5基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個體泛酸與潰瘍藥物療效。
背景技術(shù)：
消化性潰瘍(p印tic ulcer)主要指發(fā)生在胃和十二指腸的慢性潰瘍，即胃潰瘍 (gastric ulcer，⑶)和十二指腸潰瘍(duodenal ulcer，DU)，因潰瘍形成與胃酸/胃蛋白 酶的消化作用有關(guān)而得名。潰瘍的大小可從幾毫米至幾厘米大小不等。潰瘍與糜爛的區(qū)別 在于穿透的深度前者粘膜缺損超過粘膜肌層；后者比較表淺，不累及粘膜肌層。由于對幽門螺桿菌在消化性潰瘍中的主要作用認(rèn)識的加深，對消化性潰瘍的診斷 和治療發(fā)生了巨大變化?；瘜W(xué)藥物治療始終扮演著重要的角色，其中質(zhì)子泵抑制劑類治療 泛酸與潰瘍類藥物為消化性潰瘍的首選臨床藥物。然而，對于此類藥物來說，其藥效往往因 人而異，受藥物代謝酶影響很大。隨著藥代學(xué)、藥效學(xué)和藥物基因組學(xué)的不斷發(fā)展，使得人 們能夠通過更加靈敏、有效的基因檢測手段來預(yù)測此類藥物的臨床使用療效和規(guī)避各種可 能發(fā)生的不良反應(yīng)。質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物主要經(jīng)CYP2C19代謝。對于弱代謝型(PM)個體，PPI 的抑制胃酸分泌作用比泛代謝(EM)者強(qiáng)。埃索拉唑依賴于CYP2C19代謝的程度較奧美拉 唑弱，因此在EM者中，埃索拉唑的抑酸作用比奧美拉唑強(qiáng)。對于由CYP2C19催化代謝的藥 物，在人群中可表現(xiàn)為2種代謝型，一種為強(qiáng)代謝型(extensive metabolizer，EM)，另一種 為弱代謝型(poor metabolizer，PM)。多數(shù)人一般表現(xiàn)為強(qiáng)代謝，弱代謝則主要是由于2 個等位基因的突變和(或)缺失引起的。PM發(fā)生率存在著明顯種族差異，白種人和非洲黑 人中PM發(fā)生率為2% 4%，東方人高達(dá)13% 23%。在一個大樣本量的研究中，中國人 CYP2C19的PM所占的比例為14%，也就是有1. 8億人為PM.質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物，如奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑除主要是經(jīng) CYP2C19代謝外，也通過CYP3A4，5代謝清除。因此，CYP3A4，5基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改 變將在一定程度上反應(yīng)到PPI類藥物的用藥效果，CYP3A4，5基因的分型檢測對于臨床PPI 類藥物的用藥指導(dǎo)也具有的重要現(xiàn)實(shí)意義。CYP3A4*18是目前已確定的CYP3A4 SNP中等位基因突變率最高的位點(diǎn)，為外顯子 10上T878C突變，引起第293位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所取代。L293氨基酸殘基被包裹 在CYP3A4蛋白質(zhì)的里面。由于L293P非組成性突變，影響了 CYP3A4蛋白的構(gòu)成、底物結(jié)合 能力和酶催化活性。Gotoh(1992)證明了哺乳動物CYP450存在6種底物識別位點(diǎn)。根據(jù)這 一結(jié)論，L293P就位于第4種底物識別位點(diǎn)，而這種位點(diǎn)在不同動物中是高度保守的，并與 底物特異性相關(guān)。目前對CYP3A4*18等位基因?qū)υ撁富钚缘挠绊懘嬖谥煌囊庖?。有?究認(rèn)為該等位基因可能會提高CYP3A4酶活性，比如CYP3A4*18增加了對睪酮、氯螨硫磷的 催化活性；也有研究認(rèn)為該等位基因降低了 CYP3A4酶活性。這種相互矛盾的結(jié)果可能與作
3用底物，及試驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)，因此有必要研究該位點(diǎn)對特定藥物的影響。肝、腸、食道、胃、膽囊、膽管、胰腺、肺、氣管、鼻黏膜、腎、腎上腺、甲狀旁腺、前列 腺、乳腺、卵巢、腦、垂體前葉等組織均有CYP3A5表達(dá)，提示它在這些組織中具有重要的生 理功能。CYP3A5曾經(jīng)一度被認(rèn)為是缺乏功能意義的假基因，但是近年來逐漸成為新的研 究熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)的等位基因有多種，包括CYP3A5*1A、CYP3A5*1B、CYP3A5*1C、CYP3A5*2、 CYP3A5*3A、CYP3A5*3B、CYP3A5*3C、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7。CYP3A5 的表 達(dá)在人群中呈多態(tài)分布，它的功能僅在10 20%的白人，33%的東方人和55%的美國黑人 中存在，這主要是因?yàn)镃YP3A5*3突變導(dǎo)致了不適當(dāng)?shù)膍RNA剪接，使終止密碼子提前，導(dǎo)致 CYP3A5缺乏。CYP3A5*3等位基因的發(fā)生頻率的變化范圍由50% (美國黑人)到90% (白 人)。CYP3A5*3/*3純合子的肝微粒體表達(dá)CYP3A5的水平很低，表現(xiàn)為咪達(dá)唑倫的代謝活 性降低。CYP3A5*3/*3純合子個體CYP3A5活性低于CYP3A5*3/*1雜合子，而CYP3A5*1/*1 純合子活性最高，表現(xiàn)出明顯的基因劑量效應(yīng)。CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7也可形成可 變剪切，從而導(dǎo)致編碼的提前結(jié)束或外顯子的丟失。

發(fā)明內(nèi)容
基于質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、CYP3A4基因和 CYP3A5基因多態(tài)性可用來評估個體泛酸與潰瘍藥物療效的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個 體泛酸與潰瘍藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、CYP3A4基因和 CYP3A5基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括1(^熒光定量？0 反應(yīng)緩沖液311，25mM dNTP 混合液 0. 3u 1,25mM MgC12 溶液 1. 8ii 1，5units/ul Taq DNA 聚合酶 0. 075 u 1,20iiM特異性引物對每條引物各0. 225 iil，10 P M特異性熒光探針對每條探針各0.25 iil，去離子水 15. 975 ill。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測試劑盒的使用
步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每次 反應(yīng)的體系為總體積lOyl，包含濃度為20ng/iil的DNA模板2iil、lia 10X熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA聚合酶、20 u M的有義引物和反義引物各0. 225 yl、10 y M的帶VIC熒光探針和帶 FAM熒光探針各0. 25 ill，去離子水5. 325 ill。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個體泛酸與潰瘍藥物療效的試劑盒，其特征在于包括檢測質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、CYP3A4基因和CYP3A5基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液3 μ 1，·25mM dNTP 混合液 0. 3 μ 1，·25mM MgCl2 溶液 1. 8 μ 1，·5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 075 μ 1,·20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，·10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水15. 975 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體泛酸與潰瘍藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、CYP3A4基因和CYP3A5基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測質(zhì)子泵抑制劑(PPI)類藥物用藥靶向位點(diǎn)CYP2C19基因、CYP3A4基因和CYP3A5基因多態(tài)性位點(diǎn)來評估個體泛酸與潰瘍藥物療效。
文檔編號G01N21/64GK101928764SQ200910053959
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司