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格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效檢測(cè)的制作方法

文檔序號(hào):6231451閱讀:387來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱:格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,更具體的,本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體格列衛(wèi) 輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效的試劑盒,通過(guò)檢測(cè)格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因多態(tài)性位點(diǎn) 來(lái)評(píng)估個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效。
背景技術(shù)
胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)是一種獨(dú)立的腫瘤,臨 床并非十分罕見(jiàn)。目前國(guó)際上多數(shù)采用嚴(yán)格的GIST定義免疫組化表達(dá)⑶117陽(yáng)性、細(xì)胞 形態(tài)可以是梭形或上皮樣,或二者混和,但必須排除胃腸道平滑肌腫瘤(平滑肌瘤和平滑 肌肉瘤)、神經(jīng)鞘瘤及神經(jīng)纖維瘤。該腫瘤可發(fā)生于胃腸道的全長(zhǎng)范圍,也可發(fā)生在胃腸道 外包括網(wǎng)膜、腸系膜、腹膜和后腹膜。GIST作為一個(gè)獨(dú)特的胃腸道腫瘤,已經(jīng)得到病理和臨 床的廣泛認(rèn)同。甲磺酸伊馬替尼,商品名為格列衛(wèi)(Gleevec或Glivec),英文名稱=Imatinib Mesylate,又稱CGP57148B或者STI 571,其活性成份為甲磺酸伊馬替尼。一般為膠囊,內(nèi)容 物為白色至類(lèi)白色粉末。該產(chǎn)品用于治療慢性髓性白血病(CML)急變期、加速期或α-干 擾素治療失敗后的慢性期患者,近年來(lái)用于治療不能切除和/或發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性胃腸道間 質(zhì)腫瘤(GIST)的成人患者。以上說(shuō)明KIT基因突變與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生存在緊密的聯(lián)系,特別是四個(gè)外顯 子發(fā)生的突變產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致激酶自活化及不受調(diào)控是胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生的重要原因。 它們不僅影響腫瘤的發(fā)生,還對(duì)預(yù)測(cè)格列衛(wèi)治療的效果有重要意義。已經(jīng)知道格列衛(wèi)是胃腸道間質(zhì)瘤的分子靶向治療藥物,它能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ATP結(jié)合 區(qū)域,阻止了下游底物的磷酸化,從而抑制了 KIT信號(hào)通路的傳導(dǎo),見(jiàn)下圖。2002年,F(xiàn)DA就 批準(zhǔn)格列衛(wèi)可以應(yīng)用于胃腸道間質(zhì)瘤的治療,特別針對(duì)不能手術(shù)切除和已有轉(zhuǎn)移的腫瘤。已有的研究證實(shí)KIT基因的突變類(lèi)型與格列衛(wèi)治療的有效性間存在緊密的聯(lián)系,綜 合768個(gè)病例的數(shù)據(jù),KIT外顯子11突變、外顯子9突變、野生型,格列衛(wèi)治療的有效率分別 為72%、38%、28%,而它們對(duì)格列衛(wèi)治療的首次治療耐受率則為5%、16%、23%。比較總的 生存率等指標(biāo),存在KIT外顯子11突變的病例使用格列衛(wèi)治療的效果也明顯好于其他類(lèi)型。已經(jīng)知道KIT的突變類(lèi)型與格列衛(wèi)的療效具有相關(guān)性,同樣的分清PDGFRA的突變 類(lèi)型也對(duì)療效具有預(yù)測(cè)意義。雖然目前大部分的研究都是針對(duì)KIT突變個(gè)體,但Heinrich MC, Hirota S, Corless CL, Weisberg E 的研究證實(shí)了 exonl8 (D842V)突變個(gè)體對(duì)格列衛(wèi)幾 乎完全耐藥,此外有超過(guò)1/3的PDGFA突變類(lèi)型對(duì)格列衛(wèi)治療敏感。由此可以看出基因檢 測(cè)的重要意義,已經(jīng)認(rèn)為exonlS突變者應(yīng)用格列衛(wèi)的作用不是很明顯,而對(duì)于eXonl2突變 的患者需要對(duì)其療效進(jìn)行觀察,進(jìn)一步?jīng)Q定治療藥物及劑量。

發(fā)明內(nèi)容
基于格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效的基礎(chǔ)上,本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒 光探針對(duì);熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的,特異性熒光探針對(duì) 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1,25mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1,25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1,5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,20 μ M特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 μ 1,10 μ M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 μ 1,去離子水 5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用,試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法,通常按照常規(guī)條件,或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1,包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0. 25μ 1,去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為50°C、2分鐘,95°C、10分鐘,進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒,60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量,根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效的試劑盒,其特征在于包括檢測(cè)格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1,25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1,5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,'20 μ M特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 μ 1,'10 μ M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 μ 1,去離子水5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用,試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)格列衛(wèi)用藥靶向位點(diǎn)KIT基因多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)評(píng)估個(gè)體格列衛(wèi)輔助治療胃腸道間質(zhì)瘤療效。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101928755SQ200910053950
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司
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