專利名稱：抑制人VEGF基因的表達的siRNA和表達載體及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，特別是涉及一種抑制人VEGF基因的表達的siRNA和表達載體及其在制藥中的應用。
背景技術：
腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤區(qū)血管有著密切的關系，腫瘤血管為腫瘤細胞的生長輸送營養(yǎng)物質(zhì)并排泄代謝廢物，腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展也依賴于腫瘤血管的形成。因此，切斷腫瘤的血供可能達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。在已發(fā)現(xiàn)的多種刺激新生血管形成的生長因子中，只有VEGF專一作用于血管內(nèi)皮細胞。VEGF是1979年首次從腫瘤分泌物中分出的生長因子，它高效、特異作用于血管內(nèi)皮細胞，是新生血管形成的中心調(diào)控因子，它在正常組織細胞中不表達，在腫瘤細胞以及受到腫瘤刺激的周圍基質(zhì)細胞中表達，而且，惡性腫瘤的血管形成程度與VEGF mRNA表達具有高度相關性，因此，通過抑制VEGF的異常表達和新生血管的形成，為腫瘤的治療提供了新方法。
已有研究用VEGF的單克隆或多克隆抗體有效抑制新生血管形成和腫瘤的生長，也有采用專一性高、毒副作用較低的反義寡核苷酸技術抑制腫瘤的生長，但用反義寡核苷酸技術的基因治療通常所用劑量大，抑制VEGF基因表達僅達20-90％，采用小雙鏈RNA(19-23bp)干涉技術(RNAi)靶向作用明顯、有放大持續(xù)作用效果，劑量小，體外抑制靶向基因mRNA表達穩(wěn)定抑制在90％以上，如改變一個堿基則抑制作用消失，因此，用小雙鏈RNA干涉不影響正?；虻淖饔茫膶Ｒ恍院桶邢蛐詮?。
RNAi技術就是利用雙鏈RNA(double-stranded RNA)誘導序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing)。2001年5月和2001年12月，德國科學家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.Cell Sci.》上相繼發(fā)表了用RNAi技術分別使哺乳類細胞中16個基因表達水平降低或沉默，從而證明RNAi對哺乳類細胞也起作用，這使得這項技術應用于治療某些由于特定基因表達過多引起的疾病，如癌基因的過度表達引起的癌癥成為可能。有望此項技術能成為新的癌癥基因治療的有效手段。
與用反義寡核苷酸技術的基因治療相比，雙鏈RNA干涉技術的優(yōu)點為①靶向性、專一性強。②雙鏈RNA干涉技術有放大持續(xù)作用，時間短，見效快，且實驗重復性和穩(wěn)定性均很好。③雙鏈RNA干涉技術所用合成的雙鏈RNA劑量小，比反義技術所用劑量小近萬倍。④雙鏈RNA可用載體進行表達，一次轉(zhuǎn)染可持續(xù)表達一個月以上，穩(wěn)定并且表達量較高。
為此，本發(fā)明提供一種抑制人VEGF基因表達的小雙鏈RNA，它們可以特異地靶向作用于人VEGFmRNA，從而抑制腫瘤細胞VEGF基因表達，抑制整體動物體內(nèi)腫瘤組織新生血管的形成與生長和抑制腫瘤的生長，可用于制備治療與血管增生有關疾病的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性抑制人VEGF基因表達的siRNA。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種能夠產(chǎn)生上述siRNA的表達載體。
本發(fā)明的再一個目的是提供上述siRNA或產(chǎn)生該siRNA的表達載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明的目的通過以下方式實現(xiàn)一種特異性抑制人VEGF基因表達的siRNA，其特征在于它包含下列任意六種siRNA的其中一種或幾種，它們的堿基序列及作用部位見表1。
所述的siRNA，它們可通過人工合成、T7體外合成和質(zhì)粒載體表達形成，該siRNA在3’端有2～6個dT修飾或2～6個U修飾。
包括表1中所述的siRNA的表達載體。
所述的siRNA在制備治療和預防腫瘤及與新生血管異常增生相關的疾病的藥物中的應用。
所述的表達載體在制備治療和預防腫瘤及與新生血管異常增生相關的疾病的藥物中的應用。
本發(fā)明的詳細描述根據(jù)人VEGF mRNA序列，從ATG后第75個核苷酸開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(其中N19任意19個mRNA核苷酸序列)，并符合核苷酸中G+C比例為占30～70％左右，將符合要求的21個堿基序列通過BLAST證實EST基因庫靶向作用的基因是唯一的。設計19～23個堿基的反義RNA序列，并通過機器合成或T7體外合成2條RNA鏈(見表1)，在2條RNA鏈的3’端各加上2～6個dT序列進行修飾，以減少細胞內(nèi)降解。兩條鏈通過PCR連接成小雙鏈RNA，并通過Oligofectamine試劑將小雙鏈RNA轉(zhuǎn)導入VEGF高表達的細胞中，例Hela細胞和SMMC-7721細胞，作用培養(yǎng)48～72小時后，進行westernblot和熒光免疫組化觀察，用VEGF抗體進行檢測VEGF蛋白表達含量的下降，確認這六種小雙鏈RNA均有不同程度的抑制人VEGF基因表達效果；然后采用雙向或發(fā)夾狀結構合成DNA鏈，通過表達小雙鏈RNA的啟動子，如U6啟動子和H1啟動子，由質(zhì)粒載體或病毒載體在真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成帶有2～6個U小雙鏈RNA或帶有發(fā)夾狀結構的小雙鏈RNA，把這些質(zhì)粒載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導或病毒轉(zhuǎn)染癌細胞，抑制癌細胞VEGF基因表達，從而抑制腫瘤生長。結果表明，通過質(zhì)粒載體或病毒載體可產(chǎn)生小雙鏈RNA，并可抑制癌細胞中VEGF基因表達和抑制移植于動物的腫瘤血管生長和腫瘤生長。
表1抑制人VEGF基因表達的小雙鏈RNA序列、修飾和作用位點

本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明根據(jù)人VEGF mRNA序列設計合成和通過質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄形成的小雙鏈RNA，作用劑量小，特異性高，可有效抑制癌細胞內(nèi)VEGF基因表達85～90％以上，可抑制移植于整體動物體內(nèi)的腫瘤血管生長和腫瘤生長，它比VEGF單克隆抗體或多克隆抗體有更高的底物專一性和更低的毒副作用，并經(jīng)動物試驗證明本發(fā)明可應用于配制成治療腫瘤及新生血管異常增生相關的疾病的藥物。


圖1通過T7RNA聚合酶合成的siRNA抑制肝癌和宮頸癌細胞中VEGF基因的表達westernblot2鑒定有U6啟動子的pRK5質(zhì)粒的瓊脂糖電泳3psiRNA質(zhì)粒鑒定瓊脂糖電泳4裸鼠接種Hela細胞22天后瘤體重量直方5pcDNA3.1(+)圖譜圖6pRK5質(zhì)粒圖譜圖7pAVU6+27圖譜具體實施方式
通過以下實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1、機器合成小雙鏈干涉RNA(siRNA)抑制Hela宮頸癌細胞中VEGF基因的表達(1)通過機器合成siRNA先從GenBank查找VEGF基因的mRNA序列(Xm166457)，從上述基因序列中的起始密碼后75個堿基開始尋找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19個mRNA核苷酸序列。一般從中找出21個核苷酸中G+C比例為50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸序列。將符合要求的21個堿基序列在NCBI database中通過BLASU搜索小核苷酸序列同源性核ESTLibrary，以保證所靶向的目的基因是唯一的。
以序列3(SEQ ID NO.3)為例首先設計好含21個堿基的正鏈(sense)RNA和反鏈(antisense)RNA序列，為減少細胞內(nèi)降解，3’端用兩個dU修飾，通過siACE-RNAi合成，sense5’GUG GUG AAG UUC AUG GAU GdTdT 3’antisense5’dTdTCAC CAC UUC AAG UAC CUA C 3’分別將兩條RNA鏈引物用無RNA酶的水配成50μM，將兩條RNA鏈引物各30μl加入15μl的5×配對緩沖液(100mM醋酸鉀，30mM HEPES-KOH pH7.4和2mM醋酸鎂)，共計75μl，用PCR儀90℃ 1分鐘，37℃ 1小時，然后關掉PCR儀使之冷卻到室溫后，-20℃貯存，并反復凍融5次，這樣dsRNA的最終濃度為20μM。
(2)siRNA抑制Hela宮頸癌細胞中VEGF基因的表達HeLa細胞24孔板上用RPMI-1640培養(yǎng)液，含6％的小牛血清(FBS)和雙抗(青霉素、鏈霉素，下同)在37℃ 5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至滿瓶的50％。然后，吸去培養(yǎng)液，用不含雙抗和FBS的RPMI-1640洗1次。在轉(zhuǎn)染siRNA前，加入無血清和雙抗的DMEM197μl/孔。接下來取20μM siRNA 3μl(終濃度為60pM)，加入40μl Opti-MEM混合稀釋，另一試管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl OpUi-MEM混合稀釋。兩試管在室溫無菌條件下放置10分鐘，兩試管合并混合后室溫無菌條件下放置15～20分鐘，待溶液變稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共計250μl/每孔培養(yǎng)介質(zhì)，37℃ 5％ CO2下培養(yǎng)4小時，每孔再加入含3倍FBS和3倍雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液250μl，37℃ 5％ CO2下分別培養(yǎng)48小時和72小時。
轉(zhuǎn)染siRNA后，細胞培養(yǎng)48小時和72小時吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用0.1M PBS液洗細胞一次，每孔加入50μl 1％ SDS，取出細胞后，輕微超聲粉碎細胞10分鐘，-70℃凍存。同時取出3μl用Bio-Rad DC測蛋白濃度，OD750測吸收值，從標準曲線查出蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白濃度使每個樣品的的蛋白量為100μg作10％SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進行westernblot。含有樣品的硝酸纖維素膜用2％脫脂奶粉配制的PBS洗30分鐘，用兔多抗(兔抗人VEGF多克隆抗體一抗)按1∶250用2％脫脂奶粉-PBS稀釋后，振蕩反應1.5小時，用2％脫脂奶粉-PBS洗30分鐘。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶50 2％脫脂奶粉-PBS稀釋后反應1小時，PBS洗30分鐘，DAB試劑盒顯色處理，計算蛋白表達抑制率。
實施例2、通過T7RNA聚合酶合成的小雙鏈干涉RNA(siRNA)抑制SMMC-7721肝癌細胞中VEGF基因的表達(一)通過T7RNA聚合酶合成siRNA本發(fā)明所提供的雙鏈RNA(siRNA)，是根據(jù)發(fā)明人由GenBank中所查找到的關于人VEGFmRNA的序列而得到的，這些RNA序列及其所對應的人VEGF mRNA的作用位點見表1，以序列1(SEQ ID NO.1)為例先設計合成引物T75’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’(SEQ ID NO.7)sense5’-TCG TGA TGA TTC TGC CCT CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3’(SEQ ID NO.8)antisense5’-AAG GAG GAG GGC AGA ATC ATC ACT ATA GTG AGT CGT ATT A-3’(SEQ ID NO.9)將三種引物各溶于100μl中。
(1)先形成雙鏈DNA(dsDNA)取1nmol的T7引物和1nmol的VEGF的sense引物溶于50μl TE buffer(10mmol Tris-HCL pH8.0，1mmol EDTA)作為A1；取1nmol的T7引物和1nmol的VEGF的antisense引物溶于50μl TE buffer(10mmol Tris-HCL pH8.0，1mmol EDTA)作為B1，分別將A1和B1管95℃加熱2分鐘后逐步冷卻至4℃。
轉(zhuǎn)錄在50μl的轉(zhuǎn)錄反應體系中200pmol dsDNA(A1或B1)1mmol rNTPsU yeast pyrophosphatase40U RNA酶抑制劑(RnaseOUT)100U T7RNA聚合酶(T7RNA polymerase)1×T7轉(zhuǎn)錄緩沖液(40mmol Tris-HCL pH8.06mmol MgCl210mmol DTT10mmol NaCl2mmol spermidine)分別稱為A2和B2。將A2和B2置37℃加熱2小時后，各加入1U無RNA酶的DNA酶(RNase free Dnase)后再37℃加熱15分鐘得到A3和B3。
形成siRNA將A3和B3混合，95℃加熱5分鐘，37℃加熱1小時，逐步冷卻至4℃。
此液體用3M醋酸鈉調(diào)pH值為5.2，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀，離心后沉淀再用70％乙醇洗一次，吹干，溶于50μl無RNA酶的水(RNase-free)水中，-20℃凍存待用。
(二)siRNA抑制SMMC-7721肝癌細胞中VEGF基因的表達SMMC-7721細胞24孔板上用RPMI-1640培養(yǎng)液，含6％的小牛血清(FBS)和雙抗(青霉素、鏈霉素，下同)在37℃ 5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至滿瓶的50％。然后，吸去培養(yǎng)液，用不含雙抗和FBS的RPMI-1640洗1次。在轉(zhuǎn)染siRNA前，加入無血清和雙抗的DMEM197μl/孔。接下來取20μM siRNA 3μl(終濃度為60pM)，加入40μl Opti-MEM混合稀釋，另一試管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl Opti-MEM混合稀釋。兩試管在室溫無菌條件下放置10分鐘，兩試管合并混合后室溫無菌條件下放置15～20分鐘，待溶液變稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共計250μl/每孔培養(yǎng)介質(zhì)，37℃5％CO2下培養(yǎng)4小時，每孔再加入含3倍FBS和3倍雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液250μl，37℃ 5％ CO2下培養(yǎng)72小時。
轉(zhuǎn)染siRNA后，細胞培養(yǎng)72小時吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用0.1M PBS液洗細胞一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出細胞后，輕微超聲粉碎細胞10’，-70℃凍存。同時取出3μl用Bio-Rad DC測蛋白濃度，OD750測吸收值，從標準曲線查出蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白濃度使每個樣品的的蛋白量為100μg作10％SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進行westernblot。含有樣品的硝酸纖維素膜用2％脫脂奶粉配制的PBS洗30分鐘，用兔多抗按1∶200用2％脫脂奶粉-PBS稀釋后，振蕩反應1.5小時，用2％脫脂奶粉-PBS洗30分鐘。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶100 2％脫脂奶粉-PBS稀釋后反應1小時，PBS洗30分鐘，DAB試劑盒顯色處理，結果見圖1，圖中1為SMMC7721細胞，2為轉(zhuǎn)染T7-siRNA的SMMC7721細胞，3為Hela細胞，4為轉(zhuǎn)染T7-siRNA的Hela細胞?？捎^察到與未轉(zhuǎn)染腫瘤相比轉(zhuǎn)染細胞中VEGF量顯著減少，計算蛋白表達抑制率。
實施例3構建的發(fā)夾狀雙鏈RNA抑制SMMC-7721肝癌細胞中VEGF基因的表達(一)U6啟動子的制備1、U6啟動子PCR引物的設計和PCR的過程引物3’端引物AATCTGCAGAAAAAGCGGACCGAAGTCCGCTCTAGATGCATGCTCGAGGTCGTCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC(SEQ ID NO.10)5’端引物CGCGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC(SEQ ID NO.11)PCR模板pTZU6+27PCR的過程94℃ 1分，57℃ 1分，72℃ 1分，35個循環(huán)后，72℃ 10分，4℃保存。
2.PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在280bp有一條很深很亮的條帶，這就是U6啟動子的條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，取17μl回收的DNA，加10×限制性內(nèi)切酶PstI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶PstI 1μl，混勻，37℃保溫酶解5小時，反應后，反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶BamHI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，混合，37℃保溫酶解2小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在280bp有一條很深很亮的條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為A液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)pRK5質(zhì)粒的酶切和與U6啟動子的連接1.取質(zhì)粒pRK5(4716bp)0.5μg(0.5μl)，加10×限制性內(nèi)切酶PstI緩沖液2μl，無菌水17μl和限制性內(nèi)切酶PstI 1μl，混勻，37℃保溫酶解5小時，反應后，反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶BamHI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，混合，37℃保溫酶解2小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在4500bp上方有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為B液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。
在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18小時，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI酶切，反應液在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，結果見圖2，圖中，4、7、8為陽性菌。選擇出現(xiàn)300bp左右插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> (三)VEGF抑制基因的制備和連接本發(fā)明所提供的發(fā)夾狀雙鏈RNA(siRNA)，是根據(jù)發(fā)明人由GenBank中所查找到的關于人VEGF mRNA的序列而得到的，這些RNA序列及其所對應的人VEGF mRNA的作用位點見表1，發(fā)明人根據(jù)以上原則，設計合成了權利要求書1中序列2(SEQ ID N0.2)5’AA UCA UCA CGA AGU GGU GAA G 3’3’UU AGU AGU GCU UCA CCA CUU C 5’作用于VEGF mRNA的第146-164位。
兩端留下SalI和XbaI的酶切位點，具體的發(fā)夾狀RNA的基因序列為N端5’TCGACC TCATCACGAAGTGGTGAAGTTCAAGAGACTTCACCACTTCGTGATGATTTTTTGGAAAT(SEQ ID N0.12)C端5’CTAGATTCCAAAAAATCATCACGAAGTGGTGAAGTCTCTTGAAGCTTCACCACTTCTGATGACGG(SEQ ID NO.13)1.把分別合成的上述兩條單鏈DNA配成雙鏈把配成50μM的單鏈DNA各取2μl，加入46μl的annealing Buffer(100mM醋酸鉀，30mM Hepes-KOH pH7.4，2mM醋酸鎂)，在PCR儀中，95℃ 4分鐘，70℃ 10分鐘，關機后冷卻至室溫，4℃存放后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.合成雙鏈DNA的磷酸化2μl合成雙鏈DNA1μl T4多聚核苷酸激酶的緩沖液A1μl 1mMATP1μl T4PNK5μl無菌水把總體積為10μl的液體混勻，37℃ 30分鐘，70℃10分鐘，然后冷卻至室溫，4℃存放后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.取已經(jīng)連接上U6啟動子的pRK5質(zhì)粒16μl(1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶SalI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI各1μl，混勻，37℃保溫酶解5小時，反應后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在5000bp下方有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中， -20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.將上述酶切的質(zhì)粒1μl和磷酸化的VEGF的雙鏈DNA 7μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。
5.在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18小時，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI酶切，反應液在2.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)64bp插入片段的質(zhì)粒，此即pRI質(zhì)粒。
(四)含G418抗性基因雙鏈RNA質(zhì)粒pCI的構建方法1.把已經(jīng)構建好的pRI質(zhì)粒，取17μl(約1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶EcoRI 1μl，混勻，37℃保溫酶解1小時，反應后，反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI 1μl，混合，37℃保溫酶解5小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在400bp有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為A液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.取pcDNA3.0質(zhì)粒17μl(約1μg)，加10×限制性內(nèi)切酶EcoRI緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶EcoRI 1μl，混勻，37℃保溫酶解2小時，反應后，反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI 1μl，混合，37℃保溫酶解5小時。最后，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在5400bp有一條帶，切下，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收凝膠上的雙鏈DNA，溶解于20μl無菌水中，是為B液，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化和鑒定(1)取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。
(2)在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)18小時，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切，反應液在1％瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)400bp插入片段的質(zhì)粒，即為pCI質(zhì)粒。
(五).pCI質(zhì)粒對SMMC-7721肝癌細胞VEGF基因表達的抑制作用1.SMMC-7721肝癌細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細胞細胞來自上海中科院細胞所，1640培養(yǎng)基+10％小牛血清培養(yǎng)，待培養(yǎng)到細胞的貼壁率在80％左右，鋪6孔細胞培養(yǎng)板，1.5×105個細胞/孔，過夜培養(yǎng)后，細胞的貼壁率在90％左右時，吸去培養(yǎng)液，用不含雙抗和小牛血清的1640洗1次。接下來取pCI質(zhì)粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀釋，另一試管加入10μl lipofectamin2000，用250μl Opti-MEM混合稀釋。兩試管在室溫無菌條件下放置5分鐘，兩試管合并混合后室溫無菌條件下放置20分鐘，待溶液變稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培養(yǎng)介質(zhì)，37℃ 5％ CO2下培養(yǎng)4小時，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍雙抗的1640培養(yǎng)液1440μl，37℃ 5％ CO2下培養(yǎng)72小時。
2.細胞的篩選吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用含200μg/ml G418的1640培養(yǎng)基篩選陽性細胞，中間不斷更換新鮮的含200μg/ml G418的1640培養(yǎng)基，待細胞完全貼壁后，此即為含有pCI質(zhì)粒的SMMC-7721肝癌細胞(陽性細胞株)。
3.細胞的回收和抑制效果的鑒定把含有pCI質(zhì)粒的SMMC-7721肝癌細胞在不含G418的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時后，吸去培養(yǎng)介質(zhì)，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出細胞后，輕微超聲粉碎細胞10秒，-70℃凍存。同時取出3μl用Bio-Rad DC測蛋白濃度，OD750測吸收值，從標準曲線查出蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白濃度使每個樣品的的蛋白量為100μg作10％SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進行westernblot。含有樣品的硝酸纖維素膜用2％脫脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分鐘，用兔多抗按1∶200用2％脫脂奶粉-PBS稀釋后，振蕩反應1.5小時，用2％脫脂奶粉-PBS洗30分鐘。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶50 2％脫脂奶粉-PBS稀釋后反應1小時，PBS洗30分鐘，DAB試劑盒顯色處理。結果發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染細胞比較，計算轉(zhuǎn)導有pCI質(zhì)粒的細胞其VEGF基因蛋白表達抑制率。
實施例4構建雙向表達sense和antisense形成小雙鏈RNA表達載體1、包含目的基因的雙鏈DNA的形成為了將設計好的小雙鏈RNA序列能在質(zhì)粒中表達出來，首先合成3個引物，利用PCR技術形成相應的分別包含U6+27啟動子的雙鏈DNA片段。
以序列4(No.260)為例，3個引物的序列分別是a.3’末端正鏈(sense)引物序列為5’ATT GGG CCC GTC GAC ATC GAT AAA AAA GTT CAT GGA TGT CTA TCA GTT CGG TGTTTC GTC CTT TCC AC 3’(SEQ ID NO.14)
b.3’末端負鏈(antisense)引物序列為5’CCG GAA TCC TCT AGA AAA AAA CAA GTA CCT ACA GAT AGT CTT CGG TGT TTC GTCCTT TCC AC 3’(SEQ ID NO.15)5’末端引物序列為5’ATA AGA ATG CGG CCG CCC CGG GGA TCC AAG GTC GGG 3’(SEQ ID NO.16)分別將3’末端的正鏈和負鏈引物與5’末端引物通過PCR擴增形成兩條DNA雙鏈(sense鏈、antisense鏈)，PCR模板為pTZU6+27，PCR的過程94℃ 1分，57℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，35個循環(huán)后，72℃ 10分鐘，4℃保存，稱為PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物2。
2、酶切包含目的基因U6+27-antisense的雙鏈DNA及質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb)PCR產(chǎn)物2經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在350bp左右有一條很深很亮的條帶，是U6+27-antisense DNA條帶，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收。取17μl回收的含U6+27-antisense DNA，加10×限制性內(nèi)切酶XbaI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶XbaI1μl，混勻，37℃酶切過夜，再在反應體系中加限制性內(nèi)切酶BamHI 1μl，37℃酶切3h。同樣的方法用XbaI和BamHI酶切質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb)。電泳并回收，得到含U6+27-antisense小片段DNA(酶切位點為XbaI和BamHI)以及大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點為XbaI和BamHI)。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、酶切包涵目的基因U6+27-sense的雙鏈DNA及質(zhì)粒載體pcDNA3.1(5.428kb)PCR產(chǎn)物1經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下在350bp左右有一條很深很亮的條帶，是U6+27-sense DNA條帶，用Qiagen凝膠回收試劑盒回收。取17μl回收的含U6+27-senseDNA，加10×限制性內(nèi)切酶NotI緩沖液2μl，再加入限制性內(nèi)切酶NotI 1μl，混勻，37℃酶切過夜，然后反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，混合，-20℃ 30分鐘，14000g 4℃ 15分鐘離心，去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶ApaI，酶切3h。同樣的方法用NotI和ApaI酶切pcDNA3.1。得到含U6+27-sense小片段DNA(酶切位點為NotI和ApaI和)以及大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點為NotI和ApaI)。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、將目的基因U6+27-antisense連接到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中取酶切大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點為XbaI和BamHI)1μl，再取U6+27-antisense小片段DNA(酶切位點為XbaI和BamHI)7μl，加入10μl的無菌水，2μl的10×T4 DNA連接酶緩沖液和1μl的T4 DNA連接酶，22℃孵育1小時。在孵育液中加入100μl的感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI酶切鑒定，反應液在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，選擇出現(xiàn)350bp插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> 5、將目的基因U6+27-sense連接到質(zhì)粒載體pcDNA3.1中取酶切大片段質(zhì)粒載體pcDNA3.1(酶切位點為NotI和ApaI)1μl，再取U6+27-sense小片段DNA(酶切位點為NotI和ApaI)7μl，同步驟(4)進行連接、轉(zhuǎn)化，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶NotI和ApaI酶切鑒定，反應液在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，出現(xiàn)350bp插入片段的質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?br> 6、psiRNA質(zhì)粒的構建將步驟(4)中的陽性克隆菌提質(zhì)粒，并用Apa I酶切3h后，在反應液中加0.5μl平頭酶，37℃孵育15min，75℃滅活10min，然后反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，沉淀，離心。去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶HindIII緩沖液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，得到350bp的含U6+27-antisense小片段DNA，其酶切位點為HindlII和Apa I(平)。膠回收備用。
將步驟(5)中的陽性克隆菌提質(zhì)粒，并用EcoR I酶切2h后，在反應液中加0.5μl平頭酶，37℃孵育15min，75℃滅活10min，然后反應體系中加入16μl 4M醋酸銨溶液，84μl無水乙醇，沉淀，離心。去上清，吹干后，加入17μl無菌水和10×限制性內(nèi)切酶HindIII緩沖液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，得到包含U6+27-sense的大片段，其酶切位點為HindIII和EcoR I(平頭酶)。膠回收備用。
取步驟(7)中的包含U6+27-sense的大片段1μl，再取步驟(6)中的U6+27-antisense小片段DNA(酶切位點為XbaI和BamHI)7μl，按步驟(4)中的連接方法將小片段介入大片段中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)16-18h，隨機挑取菌落于含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴增細菌，抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切鑒定，電泳分離，出現(xiàn)350bp片段的為陽性克隆菌，結果見圖3，圖中1號為陽性菌。陽性菌測序。結果表明新構建的質(zhì)粒載體中包含U6+27-antisense和U6+27-sense，命名為psiRNA。
實施例5構建的小雙鏈RNA抑制SMMC-7721細胞表達VEGF1.SMMC-7721肝癌細胞培養(yǎng)實驗分別將SMMC-7721肝癌細胞和轉(zhuǎn)染小雙鏈RNA的陽性細胞株在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)繁殖到一定數(shù)目，0.25％胰酶消化，離心收集，PBS洗三次，改換無血清培養(yǎng)基，種至96孔板上，每孔為200μl體積，含有10×103個細胞.相同條件下培養(yǎng)，第三天收集培養(yǎng)液，4℃離心收集上清。
2.VEGF的測活實驗將該上清加入96孔板人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中，每孔50μl，72小時后收集臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，MTT染色法檢測內(nèi)皮細胞生長情況，以下式計算生長抑制率。
抑制率＝(1-Nn/N)×100％，其中N為用SMMC-7721腫瘤細胞的上清處理后的細胞數(shù)，Nn為用轉(zhuǎn)染小雙鏈RNA的陽性細胞株上清處理后細胞數(shù)(加收集上清后的細胞數(shù))，No為初始細胞數(shù)。實驗得到平均生長抑制率為72.4％實施例6構建的小雙鏈RNA體內(nèi)抑瘤實驗將BALB/C裸鼠隨機分為對照組(未處理組)、轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒細胞組(轉(zhuǎn)pcDNA3.0的細胞)、轉(zhuǎn)pcDNA3.0-VEGF發(fā)夾狀小雙鏈RNA的腫瘤細胞組，分別取對數(shù)生長期的腫瘤細胞、轉(zhuǎn)pcDNA3.0的腫瘤細胞和陽性轉(zhuǎn)染細胞株，0.25％胰酶消化后置于無血清1640培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為5×107/ml，分別接種于BALB/C裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可見腫瘤后，隔日用游標卡尺測量腫瘤的長、寬，腫瘤體積按下列公式計算V＝(L×W2)×0.52。各組在注射腫瘤細胞22天后，頸椎脫臼處死，剖出腫瘤，測量腫瘤重量，結果見圖4，圖中1為對照組，2為轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒細胞(轉(zhuǎn)pcDNA3.0的細胞)，3為轉(zhuǎn)pcDNA3.0-VEGF發(fā)夾狀小雙鏈RNA的腫瘤細胞。計算抑瘤率，并進行腫瘤組織中微血管密度測定和腫瘤細胞凋亡檢測。結果表明，pcDNA3.0-VEGF發(fā)夾狀小雙鏈RNA有明顯的抑制腫瘤生長的作用。
序列表<110>徐根興<120>抑制人VEGF基因的表達的siRNA和表達載體及其在制藥中的應用<160>16<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>1ggaggagggc agaatcatc 19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA
<400>2ucaucacgaa guggugaag 19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>3guggugaagu ucauggaug19<210>4<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>4guucauggau gucuaucag19
<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>5gccauccugu gugccccug 19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA<400>6caucaccaug cagauuaug 19
<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述T7引物<400>7taatacgact cactatag18<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VEGF的正義鏈引物<400>8tcgtgatgat tctgccctcc tcctatagtg agtcgtatta40<210>9<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VEGF的反義鏈引物<400>9aaggaggagg gcagaatcat cactatagtg agtcgtatta 40<210>10<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6啟動子PCR 3’端引物<400>10aatctgcaga aaaagcggac cgaagtccgc tctagatgca tgctcgaggt cgtccggtgt 60ttcgtccttt ccac 74<210>11<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述U6啟動子PCR 5’端引物<400>11cgcggatcca aggtcgggca ggaagagggc30<210>12<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述單鏈DNA的N端序列<400>12tcgacctcat cacgaagtgg tgaagttcaa gagacttcac cacttcgtga tgattttttg 60gaaat 65<210>13<211>65<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述單鏈DNA的N端序列<400>13ctagattcca aaaaatcatc acgaagtggt gaagtctctt gaagcttcac cacttctgat 60gacgg 65<210>14<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 3’端正義鏈引物序列<400>14attgggcccg tcgacatcga taaaaaagt tcatggatgt ctatcagttc ggtgtttcgt 60cctttccac69<210>15<211>62<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 3’端反義鏈引物序列<400>15ccggaatcct ctagaaaaaa acaagtacct acagatagtc ttcggtgttt cgtcctttcc 60ac62<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述雙向作用的雙鏈RNA 5’端引物序列<400>16ataagaatgc ggccgccccg gggatccaag gtcggg 3權利要求
1.一種特異性抑制人VEGF基因表達的siRNA，其特征在于它包含下列任意六種siRNA的其中一種或幾種，它們的堿基序列及作用部位如下1 5’ GGA GGA GGG CAG AAT CAT C 3’3’ CCU CCU CCC GUC UUA GUA G 5’作用于人VEGFmRNA的第132～150位2 5’ UCA UCA CGA AGU GGU GAA G 3’3’ AGU AGU GCU UCA CCA CUU C 5’作用于人VEGFmRNA的第146～164位3 5’ GUG GUG AAG UUC AUG GAU G 3’3’ CAC CAC UUC AAG UAC CUA C 5’作用于人VEGFmRNA的第156～174位4 5’ GUU CAU GGA UGU CUA UCA G 3’3’ CAA GUA CCU ACA GAU AGU C 5’作用于人VEGFmRNA的第164～182位5 5’ GCC AUC CUG UGU GCC CCU G 3’3’ CGG UAG GAC ACA CGG GGA C 5’作用于人VEGFmRNA的第260～278位6 5’ CAU CAC CAU GCA GAU UAU G 3’3’ GUA GUG GUA CGU CUA AUA C 5’作用于人VEGFmRNA的第341～359位
2.根據(jù)權利要求1中所述的siRNA，它們可通過人工合成、T7體外合成和質(zhì)粒載體表達形成，其特征在于該siRNA在3’端有2～6個dT修飾或2～6個U修飾。
3.包括權利要求1或2所述的siRNA的表達載體。
4.權利要求1或2所述的siRNA在制備治療和預防腫瘤及與新生血管異常增生相關的疾病的藥物中的應用。
5.權利要求3所述的表達載體在制備治療和預防腫瘤及與新生血管異常增生相關的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性抑制人VEGF基因表達的siRNA及該siRNA的表達載體和它們在制備與人VEGF基因有關的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明利用生物計算機信息技術從GenBank中獲得一組人VEGF基因序列，并以RNA干擾技術為基礎，設計出一組能誘發(fā)RNA干擾的siRNA，通過化學法合成或質(zhì)粒、噬菌體表達一定量的siRNA，從而特異性抑制人VEGF基因的表達，達到抑制血管增生的目的。該siRNA及其表達質(zhì)?？捎糜谥苽涓咝Э焖佟⑻禺愋詮?、副作用少的抗腫瘤及與新生血管異常增生相關的疾病的藥物。
文檔編號C12N15/11GK1580259SQ0313226
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權日2003年8月7日
發(fā)明者樊燕蓉, 傅更鋒, 劉文華, 肖祥華, 劉新卷, 郭丹, 徐根興 申請人:徐根興