專利名稱：植物乳桿菌st-iii菌株及其在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳桿菌屬的新菌株，及通過培養(yǎng)該菌株在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用。
因而本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌ST-III；本發(fā)明的另一目的是公開上述植物乳桿菌ST-III在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III制備過程如下將泡菜汁或苜蓿汁作為樣品冷藏，測(cè)定其PH值，并接種于MRS平板(Merck公司購得)且進(jìn)行總菌落計(jì)數(shù)；然后采取上述樣品，根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果用pH6.8的PBS緩沖溶液浸泡混勻并梯度稀釋；吸取合適的稀釋度(每毫升含有100個(gè)左右細(xì)菌)100微升涂布于LBS平板，進(jìn)行培養(yǎng)；挑取典型菌落轉(zhuǎn)接到MRS平板進(jìn)一步純化；挑取理想單菌落轉(zhuǎn)接于MRS液體進(jìn)行增菌，獲得乳酸菌菌株并冷藏保存；將上述新鮮的乳酸菌菌株以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌(USMAN and A.HOSONO.Bile tolerance，taurocholate deconjugation，andbinding of cholesterol by lactobacillus gasseri strains.J.Dairy Sci.199982243-248.)，進(jìn)行菌種鑒定，其中可獲得植物乳桿菌ST-III。
本發(fā)明的植物乳桿菌ST-III已于2002年12月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)保藏，并收到保藏登記號(hào)CGMCC No.0847。
該植物乳桿菌ST-III(CGMCC No.0847)的微生物學(xué)特性示于表1。
表1植物乳桿菌ST-III的微生物學(xué)特性


上述操作均在無菌條件下進(jìn)行。
本發(fā)明的植物乳桿菌ST-III除具有一般乳桿菌的有益作用外，將該菌株應(yīng)用于調(diào)節(jié)血脂方面，如開發(fā)功能性的乳制品，作為人類膳食補(bǔ)充劑，還起到輔助降低人們血清膽固醇濃度的功效。
通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅為說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例限制。
本發(fā)明的植物乳桿菌ST-III已于2002年12月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，并收到保藏號(hào)CGMCCNO.0847。
實(shí)施例3LBS平板分離取泡菜汁和苜蓿汁，根據(jù)實(shí)施例2中所測(cè)定的結(jié)果，無菌條件下用PBS緩沖溶液(pH6.8)梯度稀釋，吸取合適的稀釋度溶液(每毫升含有100個(gè)左右細(xì)菌)100微升涂布于LBS平板，平板倒置放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，37℃厭氧培養(yǎng)36-72小時(shí)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，平板4℃保存。
實(shí)施例4菌株鏡檢無菌操作，接種環(huán)挑取實(shí)施例3所得典型菌落培養(yǎng)物，涂于載玻片，制片并革蘭氏染色，油鏡觀察菌體形態(tài)，挑取革蘭氏陽性細(xì)菌作為目的菌株。
實(shí)施例5菌株平板純化無菌條件下，接種環(huán)挑取實(shí)施例4所初步確定的目的菌落，在MRS平板上劃線分離，37℃倒置厭氧培養(yǎng)24-36小時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，直至確定所得的菌株已經(jīng)純化。
實(shí)施例6菌株的增菌過程挑取實(shí)施例5所得的理想單菌落，轉(zhuǎn)接到1毫升MRS液體，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)左右，再按1％(體積比)的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的MRS液體，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，再在液體MRS中重復(fù)擴(kuò)增2次，所得培養(yǎng)液4℃保存。
實(shí)施例7以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌15毫升無菌具塞離心管加入10毫升以無菌雞蛋黃液為膽固醇源的高膽固醇培養(yǎng)液MRSO-CHOL，按1％(體積比)的接種量接入實(shí)施例6獲得的新鮮的菌株，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)液12,000×g離心10分鐘，按照鄰苯二甲醛測(cè)定膽固醇的方法測(cè)定上清夜中膽固醇的含量，以未接種的MRSO-CHOL作為對(duì)照，計(jì)算出各個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)膽固醇的降低率(S.E.Glliland，C.R.Nelson，C.Maxwell.Applied and EnviromentalMicrobiology，1985，49377～381.)，從中選出具有較好的降低膽固醇功效的菌株，結(jié)果見表2。
膽固醇的降低率計(jì)算公式為D=C-AC×100%]]>其中A為各實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液OD550nm[波長(zhǎng)550nm(納米)處的吸收光度值]；C為空白對(duì)照的OD550nm；D為膽固醇降低率。
表2降膽固醇益生乳酸菌初步篩選結(jié)果膽固醇降低率 菌株數(shù) 比例 來源(％) (株)(％) 泡菜 腌制苜蓿40以上 6 9.09 4 230-40 9 13.64 5 220-30 13 19.70 2 820以下 38 57.28 12 16其中，ST-III具有最高的膽固醇降低率，達(dá)到47.68％，對(duì)應(yīng)的膽固醇降低量為244.84微克/毫升。另外還有5株菌株的膽固醇降低率在40％以上。
實(shí)施例8ST-III菌種鑒定該ST-III的微生物學(xué)特性如上述表1示。
實(shí)施例9菌體懸浮液制備方法將本發(fā)明的植物乳桿菌ST-III(CGMCC No.0847)接入MRS液體，32℃靜置培養(yǎng)16小時(shí)，計(jì)數(shù)；根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用脫脂奶做適當(dāng)?shù)南♂尅腋〉玫饺绫?中所需的菌液濃度。ST-III死菌懸浮液制備方法懸浮108cfu/ml(每毫升中所含菌體個(gè)數(shù))ST-III脫脂奶置于100℃水浴加熱15分鐘，冷卻，冰箱保存待用。
應(yīng)用實(shí)施例降血清膽固醇功能性實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn))動(dòng)物模型在益生乳酸菌降低血清膽固醇功能性實(shí)驗(yàn)研究中得到越來越廣泛的應(yīng)用(鄭建仙.功能性食品(第三卷).北京中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.9.408-412.)。高脂高膽固醇飼料誘發(fā)動(dòng)物脂代謝紊亂，血脂水平發(fā)生變化血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低。降血清膽固醇功能性實(shí)驗(yàn)通常做法是，飼喂高脂高膽固醇飼料的同時(shí)，飼喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣品，通過測(cè)定動(dòng)物血清脂類含量的變化來確定實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)動(dòng)物血脂的影響效果。
本發(fā)明篩選得到的益生乳酸菌是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III(CGMCC No.0847)，該菌株在體外實(shí)驗(yàn)中具有較高的降低膽固醇濃度的能力。
本發(fā)明采用SD大鼠，在常規(guī)飼料中添加重量比為1％的膽固醇、5％的豬油和0.25％的豬膽鹽來誘發(fā)SD大鼠高膽固醇血癥。同時(shí)飼喂懸浮植物乳桿菌的脫脂牛奶，最后檢測(cè)SD大鼠血清膽固醇等血脂含量，來判斷該菌株是否具有降低血清膽固醇的功效。
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物房條件雄性SD大鼠(8周齡)，64個(gè)。常規(guī)飼料喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分成8組，每組8個(gè)，分籠喂養(yǎng)。
動(dòng)物房條件溫度22±2℃，濕度56±5％，1周換2-3次鋸末?？刂?2小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗。
飼料常規(guī)飼料由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；高膽固醇飼料常規(guī)飼料添加重量比為1.0％的膽固醇，5％的豬油以及0.25％豬膽酸鹽，委托中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工；所有的飼料進(jìn)動(dòng)物房前輻射滅菌。
2、益生乳酸菌ST-III功能性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和飼喂安排64只SD大鼠隨機(jī)分成8組，飼喂不同的飼料和菌體懸浮液，具體的分組如表3所示。
表3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和飼喂計(jì)劃實(shí)驗(yàn)分組a日常飼喂b灌胃3毫升/個(gè)/天1.空白對(duì)照 常規(guī)飼料+水 水2.高脂對(duì)照 高脂飼料+水 水3.高脂SKMc對(duì)照高脂飼料+水 SKM4.L.bulgaricusd對(duì)高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml L.bulgaricus的SKM照5.L.acidophiluse對(duì)高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml L.acidophilus的SKM照6.ST-III活菌高 高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml活菌ST-III的SKM7.ST-III活菌低 高脂飼料+水 懸浮2.5×106cfu/ml活菌ST-III的SKM8.ST-III死菌 高脂飼料+水 懸浮2.5×108cfu/ml死菌ST-III的SKM注a每組8個(gè)SD大鼠b飼喂實(shí)驗(yàn)共持續(xù)21天
cSKM——滅菌10％脫脂奶dL.bulgaricus——保加利亞乳桿菌eL.acidophilus——嗜酸乳桿菌(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日常管理和飼喂SD大鼠按表3隨機(jī)分成1-8個(gè)組別，除空白對(duì)照組1飼喂常規(guī)飼料外，2-8組均飼喂高脂飼料。按照表3中方案，每日上午8點(diǎn)對(duì)SD大鼠灌胃3毫升/個(gè)/天，記錄每日飼料消耗量，實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束稱量大鼠的體重。
(3)大鼠血清采集和血脂和血清總膽酸濃度的檢測(cè)21天飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12小時(shí)，乙醚深度麻醉，摘眼球取血，裝入無菌離心管，離心(3000×g，10分鐘)收集血清，送上海華山醫(yī)院檢驗(yàn)中心測(cè)定血清中總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，和以及總膽酸(TBA)的含量。
(4)統(tǒng)計(jì)分析同組數(shù)據(jù)單因素方差分析。
不同組之間t檢驗(yàn)，p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01和p＜0.001差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3、結(jié)果分析(1)大鼠血清TC和TG濃度的測(cè)定結(jié)果21天飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12小時(shí)，收集大鼠血清，送上海華山醫(yī)院進(jìn)行血清脂類分析，測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C和TBA含量。具體結(jié)果見表4和表5。
表4大鼠血清TC和TG含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)分組aTC(mmol/L) TG(mmol/L)1 1.4±0.29 0.68±0.202 2.64±0.36 0.99±0.103 2.56±0.23 0.97±0.194 2.36±0.29 0.90±0.325 2.27±0.21*0.98±0.226 2.01±0.30**0.80±0.257 2.26±0.23*0.93±0.358 2.39±0.24 0.86±0.08注a實(shí)驗(yàn)分組見表3組4-8分別和組3進(jìn)行t檢驗(yàn)*p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**p＜0.01差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
比較表4中的空白對(duì)照組1和高脂對(duì)照組2的TC和TG含量，可以看出，組2的TC和TG含量分別比組1的高88.57％和45.59％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。由此本實(shí)驗(yàn)中，飼喂高脂飼料可以誘發(fā)大鼠高TC和TG水平，符合文獻(xiàn)的報(bào)道和實(shí)驗(yàn)要求。
組3和組2相比，TC和TG含量分別下降了3.03％和2.02％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SKM對(duì)TC含量沒有降低效果。和組3相比較，飼喂菌體的組4-8中，組6的TG含量最低，比組3下降了17.52％，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，其它4組的TG含量和組3相比差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)?？赡茱曃咕w對(duì)大鼠TG含量的降低沒有明顯的影響。
就TC而言，飼喂SKM懸浮L.bulgaricus的組4及ST-III死菌組8和飼喂SKM的高脂對(duì)照組3相比，分別下降了7.81％和6.64％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；而和組3相比，飼喂SKM懸浮L.acidophilus的組5和ST-III活菌低的組7的大鼠TC含量分別下降了11.33％和11.72％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，飼喂ST-III活菌高的組8大鼠TC含量下降了21.48％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。組6比組7多降低了11.06％的TC含量。可見本發(fā)明的ST-III具有降低TC的功效。
(2)飼喂ST-III菌體對(duì)大鼠HDL-C和LDL-C的影響如表5是實(shí)驗(yàn)大鼠HDL-C和LDL-C測(cè)定結(jié)果。
表5大鼠HDL-c和LDL-c含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)分組aHDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)AIb11.02±0.21 0.32±0.14 0.3220.75±0.10 1.54±0.29 2.0530.79±0.10 1.51±0.22 1.9340.90±0.12 1.15±0.32*1.30**51.05±0.25*1.04±0.16***1.06***60.91±0.07*0.94±0.24**1.03***70.94±0.12*1.13±0.22**1.21**81.09±0.20**1.10±0.28**1.07***注組4-8分別和組3進(jìn)行t檢驗(yàn)*p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**p＜0.01，***p＜0.001差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義a實(shí)驗(yàn)分組見表3；bAI-動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子，AI＝LDL-C/HDL-C從表5中可以看出，高脂對(duì)照組2的HDL-C含量比空白對(duì)照組1的下降26.47％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，LDL-C含量上升了381.25％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)，動(dòng)脈粥樣硬化因子AI上升了540.62％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)?？梢钥闯?，高脂飼料誘發(fā)了大鼠的脂蛋白代謝紊亂，HDL-c含量下降和LDL-c含量升高，而且AI危險(xiǎn)因子值升高非常明顯。
組3飼喂SKM的大鼠血清HDL-C和LDL-C含量分別比高脂對(duì)照組2升高5.33％和降低了1.95％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，AI因子差別也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明SKM對(duì)脂蛋白代謝沒有調(diào)節(jié)作用。
組4大鼠血清HDL-C含量和LDL-C含量分別比高脂SKM對(duì)照組3升高13.92％和降低23.84％，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。說明L.bulgaricus對(duì)大鼠的脂蛋白代謝沒有影響。
組5大鼠血清HDL-c含量比組3高32.91％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，LDL-C含量比組2低31.12％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；并且AI因子降低了45.08％(p＜0.001)，差異也有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明L.acidophilus具有升高大鼠HDL-C和降低LDL-C含量的功效。
飼喂SKM懸浮的108cfu/ml濃度ST-III活菌高組6的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了15.19％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，LDL-C含量分別降低了37.75％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；同時(shí)AI因子下降了46.63％，差異也有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
飼喂SKM懸浮的106cfu/ml濃度ST-III活菌低組7的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了18.98％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，LDL-C含量降低了37.75％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；同時(shí)AI因子下降了46.63％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
飼喂SKM懸浮的108cfu/ml濃度ST-III死菌組8的大鼠血清HDL-C含量比組3升高了37.98％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，LDL-C含量下降了27.15％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；同時(shí)AI因子下降了44.56％，差異有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
組6，組7和組8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，ST-III活菌和死菌對(duì)大鼠血清脂蛋白代謝具有調(diào)節(jié)作用，可以升高HDL-C含量，降低LDL-C含量。比較發(fā)現(xiàn)，菌體量升高，效果明顯。
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ST-III CGMCC NO.0847。
2.權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ST－IIICGMCC NO.0847，及其在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23C9/12GK1467290SQ0311637
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者蔣能群, 孫立國(guó), 郭本恒 申請(qǐng)人:上海光明乳業(yè)股份有限公司