專利名稱:一種嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù),特別是涉及嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)發(fā)明于八十年代中期,是一種擴(kuò)增特定DNA的方法,在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用十分廣泛。近二十幾年來(lái)發(fā)展了特點(diǎn)和用途各異的改良方法。其中,應(yīng)用最廣泛的莫過(guò)于嵌套式PCR(巢式PCR,Nested-PCR),美國(guó)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)庫(kù)收錄嵌套式PCR的論文近4000篇。我國(guó)萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的近幾年期刊的嵌套式PCR論文也超過(guò)200篇。嵌套式PCR先后使用外套引物和內(nèi)套引物進(jìn)行PCR,可使擴(kuò)增產(chǎn)物專一性增強(qiáng),正因?yàn)閷R恍詸C(jī)制的增強(qiáng),嵌套PCR的總循環(huán)數(shù)可比標(biāo)準(zhǔn)PCR方法多20循環(huán)左右而非專一產(chǎn)物干擾未增加,使檢測(cè)的靈敏度有大幅度提高。
但是,現(xiàn)行的嵌套式PCR存在較嚴(yán)重的缺陷,阻礙了該方法在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用和推廣。第一,現(xiàn)行的嵌套式PCR需用二個(gè)反應(yīng)管分二輪進(jìn)行反應(yīng),第一步先用外套引物擴(kuò)增約20個(gè)循環(huán),然后取少量含外套產(chǎn)物的反應(yīng)液加入含內(nèi)套引物和新鮮反應(yīng)液的第二個(gè)反應(yīng)管,用內(nèi)套引物再擴(kuò)增約30個(gè)循環(huán)。顯然,分二步操作是臨床高通量檢測(cè)的一大障礙。第二,分二步反應(yīng)的操作使外套擴(kuò)增產(chǎn)物造成污染的機(jī)會(huì)顯著增加,對(duì)臨床檢測(cè)而言這是嚴(yán)重的弊端。第三,為了使外套引物被稀釋以使其在第二輪反應(yīng)時(shí)停止工作,通常僅將五十至一百分之一或更少量的外套擴(kuò)增反應(yīng)液加入第二輪反應(yīng)液,95%以上的可作為第二輪反應(yīng)模板的外套擴(kuò)增產(chǎn)物也隨著被棄之未得到充分的應(yīng)用,相當(dāng)于約5-10個(gè)外套引物PCR循環(huán)被浪費(fèi)了。第四,在第二輪反應(yīng)中外套引物雖被稀釋,但仍有可能繼續(xù)起擴(kuò)增外套產(chǎn)物的作用。
為了克服上述缺陷,曾出現(xiàn)了一些所謂單管一步的嵌套式PCR方法,但效果均不理想。第一,這種單管一步方法的設(shè)計(jì)原理是內(nèi)套引物的解鏈溫度較低,用調(diào)節(jié)退火溫度來(lái)控制內(nèi)套引物的停止和啟動(dòng),第一階段在較高的溫度下內(nèi)套引物不能退火,但是第二階段在較低的溫度下外套引物仍能退火擴(kuò)增。第二,為了在后階段停止外套引物的作用必須通過(guò)計(jì)算,憑經(jīng)驗(yàn)或試驗(yàn)來(lái)確定外套引物的濃度。若外套引物濃度偏高會(huì)在后階段繼續(xù)擴(kuò)增,外套引物的非專一擴(kuò)增也會(huì)繼續(xù);若外套引物濃度偏低則會(huì)嚴(yán)重影響反應(yīng)之初引物與模板的退火速度,這二者之間往往難取得良好的平衡。另一種單管方法已被專利ESP9801642(July,31,1998),論文發(fā)表于Nucleic Acid Research(1999)27(6)1564,該方法將含外套引物的第一輪反應(yīng)液包括Taq酶放在普通的PCR反應(yīng)管內(nèi),同時(shí)將含內(nèi)套引物的第二輪反應(yīng)液但不包括Taq酶放在一個(gè)特定規(guī)格的細(xì)管內(nèi),并小心地將此細(xì)管置于PCR反應(yīng)管內(nèi)。由于毛細(xì)管現(xiàn)象細(xì)管內(nèi)的反應(yīng)液不會(huì)與含Taq酶的細(xì)管外反應(yīng)液混合。第一輪反應(yīng)結(jié)束合將反應(yīng)管離心,在離心力作用下細(xì)管內(nèi)的液體與外面的液體混合,然后開始第二輪反應(yīng)。外套引物的解鏈溫度比內(nèi)套引物低,第二輪反應(yīng)采用較高的退火溫度,外套引物就停止工作。這種設(shè)計(jì)煞費(fèi)苦心固然有其獨(dú)特之處,但正如作者自己所指出的必須十分小心地控制細(xì)管的質(zhì)量和操作才能避免細(xì)管內(nèi)液體的逸出造成失敗。另外,第一輪反應(yīng)與第二輪反應(yīng)之間需要離心,這種在常溫下的操作步驟,使內(nèi)套引物的熱啟動(dòng)操作難以實(shí)現(xiàn),容易形成非專一擴(kuò)增產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容
所需要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供了嵌套式PCR方法及其應(yīng)用,以克服現(xiàn)行各種嵌套式PCR方法步驟煩瑣、易污染、內(nèi)外套引物的擴(kuò)增相互影響或需要特殊反應(yīng)容器的缺點(diǎn)。
發(fā)明構(gòu)思本發(fā)明的嵌套式PCR反應(yīng)液同時(shí)含有外套和內(nèi)套引物。設(shè)計(jì)的外套引物有極高的解鏈溫度,而內(nèi)套引物解鏈溫度相對(duì)較低,在PGR的前半階段采用常規(guī)變性溫度和高退火溫度,此階段只有外套引物能退火完成擴(kuò)增,而內(nèi)套引物因達(dá)不到退火條件而不能擴(kuò)增。同時(shí),所設(shè)計(jì)的外套引物的擴(kuò)增產(chǎn)物有較高的解鏈溫度,而內(nèi)套引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度相當(dāng)?shù)?,在PCR的后半階段采用低的變性溫度和低的退火溫度,此階段內(nèi)套引物能以外套引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板完成內(nèi)套產(chǎn)物的擴(kuò)增。外套引物雖也能在較低退火溫度下完成退火,卻不能在較低變性溫度下完成變性,故外套引物在后半階段不能擴(kuò)增。所以,通過(guò)引物設(shè)計(jì)和調(diào)節(jié)退火及變性溫度可實(shí)現(xiàn)一步法嵌套式PCR。
技術(shù)方案根據(jù)通常原則,借助引物物軟件設(shè)計(jì)外套和內(nèi)套引物,本發(fā)明均采用Oligo進(jìn)行設(shè)計(jì)。
本發(fā)明的嵌套的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,是由2對(duì)相互嵌套的引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行如下反應(yīng)模板變性;引物退火;DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈;按上述步驟循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。外套和內(nèi)套引物在同一反應(yīng)體系內(nèi),反應(yīng)期間無(wú)需開蓋。
上述PGR分二階段進(jìn)行第一階段退火溫度和變性溫度均較高,循環(huán)數(shù)為5-25個(gè)循環(huán),優(yōu)選占總循環(huán)數(shù)的30-60%,第二階段退火溫度和變性溫度均較低,循環(huán)數(shù)為5-25個(gè),優(yōu)選占總循環(huán)數(shù)的40-70%;在第一階段和第二階段之間有2-4循環(huán)的過(guò)渡階段,此階段變性溫度與第一階段相同而退火溫度與第二階段相同。
在PCR第一階段退火溫度范圍為60-80℃,優(yōu)選72-78℃。退火溫度需超過(guò)內(nèi)套引物的最高允許退火溫度,即比所設(shè)計(jì)使用的內(nèi)套引物的解鏈溫度高3℃以上,使內(nèi)套引物在第一階段不能退火擴(kuò)增。所設(shè)計(jì)和使用的外套引物的解鏈溫度至少需比第一階段退火溫度高,以利在第一階段能順利退火而有效地完成擴(kuò)增。按此原則,外套引物的解鏈溫度范圍為60-94℃,優(yōu)選82-90℃。內(nèi)套引物解鏈溫度范圍50-75℃,優(yōu)選55-68℃。同時(shí)應(yīng)滿足外套引物與內(nèi)套引物的解鏈溫度之差的范圍為10-40℃,優(yōu)選15-25℃。
PCR第二階段的變性溫度范圍為65-87℃,優(yōu)選75-82℃,內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度需比第二階段變性溫度低1℃以上,優(yōu)選低2℃以上,在第二階段變性溫度下內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物能充分變性而有效地完成擴(kuò)增。外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度需比第二階段變性溫度高1℃以上,優(yōu)選高2℃以上,在第二階段變性溫度下外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物不能完成變性而使擴(kuò)增流產(chǎn)。根據(jù)此原則,外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍為75-94℃,優(yōu)選85-90℃。內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍64-86℃,優(yōu)選74-80℃。同時(shí)應(yīng)滿足外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度與內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度之差的范圍為2-25℃,優(yōu)選4-15℃。
按同樣的原理可設(shè)計(jì)由1對(duì)外套、1對(duì)中套和一對(duì)內(nèi)套引物構(gòu)成的、分三階段進(jìn)行的單管三重嵌套PCR。即由3對(duì)嵌套引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行PCR反應(yīng)第一階段5 20個(gè)循環(huán),退火溫度范圍65-80℃;第二階段5-20個(gè)循環(huán),變性溫度范圍65-87℃,退火溫度范圍60-75℃;第三階段5-20個(gè)循環(huán),變性溫度范圍為65-87℃;而且,在第一階段和第二階段之間、第二階段和第三階段之間分別有2-4個(gè)循環(huán)的過(guò)渡階段,此階段的變性溫度與前一階段相同而退火溫度與下一階段相同。
本發(fā)明的嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法也可以在單一反應(yīng)體系中進(jìn)行2組嵌套PCR反應(yīng),即由上述的2對(duì)引物或3對(duì)引物的嵌套PCR進(jìn)行組合,進(jìn)行2對(duì)與2對(duì)引物,或者,2對(duì)與3對(duì)引物的多重嵌套PCR。也就是說(shuō),在反應(yīng)中有2組共4對(duì)嵌套引物且2組外套產(chǎn)物的序列不相重疊,或者僅有3對(duì)引物其中2對(duì)為外套、1對(duì)為內(nèi)套且2對(duì)外套相嵌套,或者僅有3對(duì)引物其中1對(duì)為外套2對(duì)為內(nèi)套,2對(duì)內(nèi)套的相對(duì)位置相分離。按需要多重嵌套PCR可設(shè)計(jì)成各種形式,如針對(duì)不同目標(biāo)基因的二個(gè)各自獨(dú)立的嵌套PCR,針對(duì)同一目標(biāo)基因的二個(gè)各自獨(dú)立的嵌套PCR,針對(duì)同一目標(biāo)基因的二個(gè)外套和一個(gè)內(nèi)套的嵌套PCR,針對(duì)同一目標(biāo)基因的一個(gè)外套內(nèi)和二個(gè)內(nèi)套的嵌套PCR,針對(duì)同一目標(biāo)基因的二個(gè)相互重疊外套內(nèi)的二個(gè)分離內(nèi)套的嵌套PCR。
本發(fā)明所述的各種嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法可應(yīng)用于核酸檢測(cè),模板DNA來(lái)源于人或病原微生物。
有益效果1.本發(fā)明通過(guò)引物設(shè)計(jì)和調(diào)節(jié)退火及變性溫度可實(shí)現(xiàn)真正意義上的一步法嵌套式PCR。
2.與普通嵌套PCR相比檢測(cè)靈敏度顯著提高,專一性增強(qiáng)強(qiáng),同時(shí)又克服了普通嵌套PCR需分二管或二步進(jìn)行,因而較麻煩,容易帶來(lái)產(chǎn)物污染。
3.在單一試管進(jìn)行的三重嵌套PCR使檢測(cè)的專一性和靈敏度進(jìn)一步提高。
4.一個(gè)外套二個(gè)內(nèi)套、一個(gè)內(nèi)套二個(gè)外套或二組獨(dú)立的多重嵌套PCR還能減少因模板順序變異而導(dǎo)致的檢測(cè)假陰性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
單管法超低變性溫度嵌套PCR提高反應(yīng)專一性。
在人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物,其順序和特性示于表1和2。
表1.實(shí)施例1引物順序
表2.實(shí)施例1引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
外套引物解鏈溫度大于88.9℃,能在72-78℃高溫下退火,內(nèi)套引物解鏈溫度64.1℃,最高允許退火溫度為67.1℃,在72-78℃高溫下不能退火。內(nèi)套引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度80.9℃,在83℃以上變性溫度能充分變性,而外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度為90.2℃,在83℃時(shí)完全不能變性。PCR反應(yīng)的程序示于表3。以常規(guī)條件作G外套和G內(nèi)套的多重PCR,除出現(xiàn)388和69堿基2條帶和非專一條帶外,還出現(xiàn)由非配對(duì)引物間擴(kuò)增造成的長(zhǎng)321和136堿基的干擾條帶。
表3.實(shí)施例1反應(yīng)條件同時(shí)加外套和內(nèi)套引物
PCR反應(yīng)試劑采用Clontech的Advantage-2試劑盒,每管反應(yīng)體積5微升,含cDNA1微升,cDNA以Poly(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物由人組織總RNA用Colntech的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成,PCR反應(yīng)每一引物的濃度為0.2uM。反應(yīng)結(jié)果得到預(yù)期的69堿基長(zhǎng)條帶,無(wú)任何非專一擴(kuò)增條帶。對(duì)照試驗(yàn)用G外套引物和G內(nèi)套引物用相同試劑盒按標(biāo)準(zhǔn)PCR方法,在變性95℃30秒鐘,退火55℃30秒鐘,延伸72℃60秒鐘條件下擴(kuò)增,結(jié)果分別得到388堿基和69堿基條帶,但均有非專一條帶出現(xiàn)。
實(shí)施例2.
同時(shí)進(jìn)行2組雙重嵌套PCR。
在人肌動(dòng)蛋白球基因設(shè)計(jì)2組共4對(duì)引物,引物順序,引物和目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物特性,引物非配對(duì)產(chǎn)物特性和反應(yīng)條件分別示于表4,5,6和7。每管反應(yīng)體積等條件與實(shí)施例1相同。
表4.實(shí)施例2引物順序
表5.實(shí)施例2引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
表6.實(shí)施例2的各種可能的非配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特性
表7.實(shí)施例2反應(yīng)條件
實(shí)施例3.
多重嵌套PCR,外套2是外套1的內(nèi)套套,最終產(chǎn)物為由內(nèi)套引物擴(kuò)增的DNA。
在實(shí)施例2引物對(duì)A3(作為外套2〕和A4(作為內(nèi)套〕區(qū)域之外,設(shè)計(jì)另1對(duì)人肌動(dòng)蛋白球基因引物A5作為多重嵌套的另一對(duì)外套引物(作為外套1〕。外套1,外套2和內(nèi)套引物的順序,目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物特性,引物非配對(duì)產(chǎn)物特性和反應(yīng)條件分別示于示于表4,8,9,10和11。每管反應(yīng)體積等條件與實(shí)施例1相同。
表8.實(shí)施例3引物順序*
表9.實(shí)施例3引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
表10.實(shí)施例3的各種可能的非配擴(kuò)增產(chǎn)物的特性
表11.實(shí)施例3反應(yīng)條件
實(shí)施例4.
多重嵌套PCR,2對(duì)內(nèi)套引物相分離,即最終產(chǎn)物為2段DNA鏈。
實(shí)施例4外套引物對(duì)為A5,其順序見表8。實(shí)施例4內(nèi)套1引物對(duì)為A4,其順序見表4。實(shí)施例4內(nèi)套2引物對(duì)順序示于表12。實(shí)施例4目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物特性,引物非配對(duì)產(chǎn)物特性和反應(yīng)條件分別示于示于表13,14和15。每管反應(yīng)體積等條件與實(shí)施例1相同。
表12.實(shí)施例4引物順序
表13.實(shí)施例4引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
表14.實(shí)施例4的各種可能的非配擴(kuò)增產(chǎn)物的特性
表15.實(shí)施例4反應(yīng)條件
實(shí)施例5.
三重嵌套PCR,外套引物,中套引物和內(nèi)套引物的順序示于表8和16,目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物特性,引物非配對(duì)產(chǎn)物特性和反應(yīng)條件分別示于示于表17,18和19。。每管反應(yīng)體積等條件與實(shí)施例1相同。
表16.實(shí)施例5引物順序
表17.實(shí)施例5引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
表18.實(shí)施例5的各種可能的非配擴(kuò)增產(chǎn)物的特性
表19.實(shí)施例5反應(yīng)條件
結(jié)果第三階段反應(yīng)退火溫度為40,42.9,45.0,47.6,50.6,53.1,55.2和56.6℃時(shí)均得到51堿基長(zhǎng)內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物,無(wú)任何非專一產(chǎn)物條帶。
實(shí)施例6.
超低變性溫度嵌套式PCR檢測(cè)HBV的設(shè)計(jì)和實(shí)施方案。
選取文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的檢測(cè)HBV引物,在5’區(qū)域調(diào)整其長(zhǎng)度后分別作為外套和內(nèi)套引物,其順序和測(cè)算特性列于表20和21。
表20.實(shí)施例6引物順序
*以基因庫(kù)編號(hào)為E00010的HBV變種順序?yàn)闇?zhǔn)表21.實(shí)施例6引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
外套正引物與內(nèi)套反引物和內(nèi)套正引物與外套反引物的非配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度和解鏈溫度經(jīng)測(cè)算分別為310堿基,85.6℃和292堿基,85.6℃。根據(jù)這些數(shù)據(jù),設(shè)定第一階段退火溫度為78℃,在此溫度下僅外套引物能退火而完成擴(kuò)增,內(nèi)套引物的擴(kuò)增和非配對(duì)擴(kuò)增則被阻斷。設(shè)定第二階段退火溫度為65℃,變性溫度為80℃,在此條件下內(nèi)套引物能以第一階段的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增,外套引物和非配對(duì)引物擴(kuò)增雖能通過(guò)退火步驟,但均因不能完成變性步驟而流產(chǎn)。用最鄰近堿基法計(jì)算的引物與模板有若干錯(cuò)配堿基時(shí)的近似解鏈溫度示于表22。
表22.實(shí)施例6引物的近似解鏈溫度
為了檢測(cè)與引物可能有若干錯(cuò)配的HBV變種,可以將第一階段的退火溫度降低至71℃,在此溫度下外套引物能與有1-4個(gè)錯(cuò)配的模板完成退火,從而使檢測(cè)的假陰性顯著減少或完全消除;在此溫度下內(nèi)套引物仍不能完成退火。71℃第二階段的退火溫度可降低至45℃左右,在此溫度下內(nèi)套引物能與有1-3個(gè)錯(cuò)配的模板完成退火。在45℃的退火溫度下內(nèi)套引物可能有非專一擴(kuò)增,但經(jīng)過(guò)第一階段的擴(kuò)增,內(nèi)套引物的目標(biāo)模板的數(shù)量比各種干擾模板高幾個(gè)數(shù)量級(jí),不會(huì)對(duì)測(cè)定構(gòu)成干擾。
實(shí)施例7.
三重嵌套式PCR檢測(cè)HCV的設(shè)計(jì)和實(shí)施方案。
設(shè)計(jì)2套外套引物以減少和消除檢測(cè)的假陰性。外套引物和內(nèi)套引物均在HCV基因組的較保守的5’端非編碼區(qū)和C基因區(qū),均根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的引物,調(diào)整其長(zhǎng)度和解鏈溫度并重新配組。三對(duì)引物的順序和特性時(shí)于表23和24。
表23.實(shí)施例7引物順序
*以基因庫(kù)編號(hào)為AF177039的HCV變種順序?yàn)闇?zhǔn)表24.實(shí)施例7引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
設(shè)定第一階段變性溫度為94℃,退火溫度為75℃,在此條件下二個(gè)外套引物能順利擴(kuò)增。外套1正引物與外套2反應(yīng)物及外套2正引物與外套1反引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度和解鏈溫度經(jīng)測(cè)算分別為720,91.4℃和679和91.6℃,在上述條件下也能順利擴(kuò)增,4個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物都是第二階段內(nèi)套引物擴(kuò)增的模板。第二階段設(shè)定變性溫度為85℃,退火溫度為55-65℃,內(nèi)套引物能以外套擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繼續(xù)擴(kuò)增得到目標(biāo)條帶,4個(gè)外套擴(kuò)增產(chǎn)物均因不能完成變性步驟而停止擴(kuò)增。
實(shí)施例8.
二個(gè)相互獨(dú)立的嵌套式PCR檢測(cè)HIV的設(shè)計(jì)和實(shí)施方案。
第一套引物在HIV病毒的gag基因區(qū),第二套引物在env基因區(qū),二對(duì)外套引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)引物在長(zhǎng)度上作修改。二對(duì)引物在各自的外套擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)選擇。4對(duì)引物的順序和特性列于表24和25。
表25.實(shí)施例8引物順序
*以基因庫(kù)編號(hào)為U23487的HIV變種順序?yàn)闇?zhǔn)表26.實(shí)施例8引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性
第一階段設(shè)定退火溫度75℃,在此溫度下二對(duì)內(nèi)套引物均不能退火完成擴(kuò)增。第二階段設(shè)定變性溫度為77℃,退火溫度為55-65℃,在此溫度下內(nèi)套引物可以外套擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繼續(xù)擴(kuò)增,外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物不能變性而流產(chǎn)。gag和env基因相距5000堿基以上,二個(gè)嵌套PCR反應(yīng)之間互不干擾。第一個(gè)嵌套的二個(gè)非配對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度分別為83.5℃和78.3℃;第二個(gè)嵌套的二個(gè)非配對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度分別為81.5℃和83.6℃,在第二階段也不能變性。
權(quán)利要求
1.一種嵌套的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,由2對(duì)相互嵌套的引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行如下反應(yīng)(1)模板變性;(2)引物退火;(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈;(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng);其特征在于,整個(gè)反應(yīng)分為三階段,在第一階段的5-25個(gè)循環(huán)中,退火溫度范圍60-80℃,在第二階段的5-25個(gè)循環(huán)中,變性溫度范圍為65-87℃,在第一階段和第二階段之間有2-4個(gè)循環(huán)的過(guò)渡階段,此階段變性溫度與第一階段相同而退火溫度與第二階段相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于第一階段退火溫度為72-78℃,且比內(nèi)套引物的解鏈溫度高3℃以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于第二階段的變性溫度范圍為75-82℃,且高于內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度1℃以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于外套引物的解鏈溫度范圍為60-94℃,內(nèi)套引物解鏈溫度范圍為50-75℃,且外套引物與內(nèi)套引物的解鏈溫度之差為10-40℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于外套引物的解鏈溫度范圍為82-90℃,內(nèi)套引物解鏈溫度范圍為55-68℃,且外套引物與內(nèi)套引物的解鏈溫度之差為15-25℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于外套擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍為75-94℃,內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍為64-86℃,且外套與內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度之差為2-25℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于外套擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍為85-90℃,內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度范圍為74-80℃,且外套與內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度之差為4-15℃。
8.一種三重嵌套的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,由外套、中套和內(nèi)套三對(duì)引物同時(shí)針對(duì)模板DNA鏈進(jìn)行如下反應(yīng)(1)模板變性;(2)引物退火;(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈;(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng);其特征在于,整個(gè)反應(yīng)分為三階段第一階段5-20個(gè)循環(huán),退火溫度范圍65-80℃;第二階段5-20個(gè)循環(huán),變性溫度范圍65-87℃,退火溫度范圍60-75℃;第三階段5-20個(gè)循環(huán),變性溫度范圍為65-87℃;而且,在第一階段和第二階段之間、第二階段和第三階段之間分別有2-4個(gè)循環(huán)的過(guò)渡階段,此階段的變性溫度與前一階段相同而退火溫度與下一階段相同。
9.權(quán)利要求1所述的多重嵌套的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于在單一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行2組嵌套PCR反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法,其特征在于反應(yīng)中有2組共4對(duì)嵌套引物且2組外套產(chǎn)物的序列不相重疊,或者僅有3對(duì)引物其中2對(duì)為外套、1對(duì)為內(nèi)套且2對(duì)外套相嵌套,或者僅有3對(duì)引物其中1對(duì)為外套2對(duì)為內(nèi)套,2對(duì)內(nèi)套的相對(duì)位置相分離。
11.權(quán)利要求1、8或9所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供嵌套聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用,通過(guò)控制PCR循環(huán)不同階段的退火和變性溫度,即在第一階段中,退火溫度為60-80℃,第二階段變性溫度為65-87℃,第一階段和第二階段之間有2-4個(gè)循環(huán)的過(guò)渡階段,此階段變性溫度與第一階段相同而退火溫度與第二階段相同,以克服現(xiàn)行各種嵌套式PCR方法步驟繁瑣、易污染、內(nèi)外套引物的擴(kuò)增相互影響或需要特殊反應(yīng)容器的缺點(diǎn),能有效地排除非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。反應(yīng)在單管內(nèi)進(jìn)行,簡(jiǎn)單方便,不開管無(wú)污染。進(jìn)一步提供的三重嵌套使專一性進(jìn)一步提高。適合用于人源和病原微生物的核酸檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1536087SQ0311632
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧