專利名稱：一種基因組dna為模板的pcr方法及其反應(yīng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及對(duì)基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其反應(yīng)液。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種簡(jiǎn)單，快速，靈敏和專一的擴(kuò)增特定DNA的方法。完成PCR反應(yīng)只需普通的生化試劑和一臺(tái)能在三個(gè)不同溫度循環(huán)的儀器即可，與分子生物學(xué)其他技術(shù)相比可謂簡(jiǎn)單之極。PCR反應(yīng)的每一循環(huán)通常只需2-3分鐘，能在1-2小時(shí)內(nèi)完成全部反應(yīng)，所需時(shí)間是其他基因擴(kuò)增方法的幾十分之一。PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)方式累積，理論上經(jīng)25循環(huán)能放大800萬(wàn)倍(223)能檢出僅幾個(gè)拷貝的基因可謂非常靈敏。PCR的這三項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)幾乎無(wú)可挑剔也非其他方法能匹比。PCR能從成千上萬(wàn)個(gè)基因中擴(kuò)增出特定的DNA片段的確也稱得上專一。但是，標(biāo)準(zhǔn)PGR方法在擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物的同時(shí)往往伴隨形成非專一產(chǎn)物，有時(shí)嚴(yán)重到比目標(biāo)產(chǎn)物更強(qiáng)甚至抑制了目標(biāo)產(chǎn)物的形成。所以，從擴(kuò)增產(chǎn)物的純一性角度而言，標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在專一性方面還存在著嚴(yán)峻的問題。正因?yàn)榉菍Ｒ粩U(kuò)增產(chǎn)物相當(dāng)普遍地存在，就使得在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物成為常規(guī)和必要。這種復(fù)雜的PCR后檢測(cè)步驟往往比PCR本身耗費(fèi)多得多的時(shí)間和勞力，極大影響了PCR在醫(yī)學(xué)核酸檢測(cè)上的廣泛應(yīng)用。
非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成是由于在并非十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏囟?，例如在引物設(shè)計(jì)軟件推薦的最適溫度下退火，引物不僅與完全匹配的目標(biāo)模板退火，也能與有一些錯(cuò)配甚至是有嚴(yán)重錯(cuò)配的非目標(biāo)模順序退火從而引發(fā)DNA聚合酶啟動(dòng)，形成非專一的半擴(kuò)增鏈和最初的非專一擴(kuò)增產(chǎn)物。由于最初形成的非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的二側(cè)已與引物完全匹配，在隨后的循環(huán)中非專一產(chǎn)物就能以與目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物一樣甚至更高的效率繼續(xù)擴(kuò)增。試驗(yàn)表明在較低的退火溫度下，即使在引物的3’端第一個(gè)核苷酸發(fā)生錯(cuò)配仍能完成擴(kuò)增；在引物不同部位有連續(xù)的或間隔的2，3，4，5個(gè)或更多的錯(cuò)配也能完成擴(kuò)增。Scott等(Protocols for GeneAnalysis，Methods in Molecular Biology，1991，P307)報(bào)導(dǎo)當(dāng)引物堿基有50％錯(cuò)配包括3’端第4位和第10-14位的錯(cuò)配也能完成擴(kuò)增。為了減少和消除非專一擴(kuò)增產(chǎn)物提高PCR專一性，從而能簡(jiǎn)化PCR后的檢測(cè)步驟和產(chǎn)物分離過程擴(kuò)大PCR的應(yīng)用，已發(fā)展了多種技術(shù)和方法，但都有較大局限和缺陷。
各種各樣的引物設(shè)計(jì)軟件能根據(jù)理論計(jì)算，各種經(jīng)驗(yàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)從輸入的順序中尋找出那些3’端堿基內(nèi)部穩(wěn)定性合適，與模板順序假性結(jié)合率低于一定數(shù)值的引物。但是，各種軟件只能在數(shù)千堿基的模板順序范圍內(nèi)進(jìn)行比較和篩選，而人和其他高等生物基因組DNA的總順序高達(dá)幾十億堿基，輸入軟件進(jìn)行分析的順序的堿基數(shù)只是引物在反應(yīng)中實(shí)際面對(duì)的順序的十萬(wàn)分之一。所以，引物軟件選擇的高嚴(yán)謹(jǐn)性引物確實(shí)克服了引物3’端互補(bǔ)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)造成的弊端，但往往不能避開與非目標(biāo)順序有較高的匹配，從擴(kuò)增產(chǎn)物專一性角度講各種引物設(shè)計(jì)軟件篩選的優(yōu)選引物帶有相當(dāng)大的隨機(jī)性和盲目性。即任一種原件不能解決標(biāo)準(zhǔn)PCR非專一產(chǎn)物的問題。
不少研究者用BLAST對(duì)所設(shè)計(jì)的引物和整個(gè)基因庫(kù)所儲(chǔ)存的順序進(jìn)行同源性分析，用以進(jìn)一步判斷引物在與非目標(biāo)順序假性結(jié)合方面的優(yōu)劣。但是對(duì)于20堿基左右的寡核苷酸順序，BLAST所指出的同源順序遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于實(shí)際上可能與引物退火的順序，極大影響了該方法實(shí)際使用價(jià)值。
各種熱啟動(dòng)PCR技術(shù)包括在低溫下配制反應(yīng)溶液，將DNA聚合酶等和反應(yīng)液的其他成分用低熔點(diǎn)石蠟分開，用含抗體的Taq酶和用熱激活酶等方法能有效防止那些在室溫下引物與非目標(biāo)順序結(jié)合引發(fā)反應(yīng)而導(dǎo)至的非專一產(chǎn)物，但不能克服在通常PCR反應(yīng)退火溫度下仍與引物結(jié)合的非目標(biāo)順序的干擾。
用有溫度梯度功能的基因擴(kuò)增儀來確定PCR反應(yīng)的最高允許退火溫度，然后選擇在既能高效高擴(kuò)增而又不形成非專一條帶的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增常常能得到理想的效果。但是符能合要求的最適溫度范圍往往很窄，有時(shí)則找不到一個(gè)合適的退火溫度能完全消除非專一產(chǎn)物的形成。
以上方法都是從改進(jìn)引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件角度來提高PCR的專一性。本發(fā)明則采用了與上面各種方法完全不同的思路和角度。本發(fā)明用對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物順序不切割的一種或幾種限制性核酸內(nèi)切酶，特別是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶，將基因組DNA切割成短片段后再進(jìn)行PCR。該方法簡(jiǎn)單能普遍應(yīng)用，能有效減少或完全消除在通常PCR反應(yīng)條件下形成的非專一擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)用前景廣泛。
發(fā)明構(gòu)思本發(fā)明基于以下幾點(diǎn)原理和事實(shí)1.非專一擴(kuò)增產(chǎn)物形成的必要條件之一是在一段核酸順序的上下游與正反引物分別有較高程度的匹配。如果用限制性核酸內(nèi)切酶在正反引物的假性結(jié)合部位之間將該核酸順序切割為二個(gè)或更多的片段，則正反引物雖能分別退火卻不能以該核酸順序?yàn)槟０逋瓿蓴U(kuò)增，原來可能形成的非專一產(chǎn)物就流產(chǎn)。
2.非專一擴(kuò)增產(chǎn)物形成的另一必要條件是在既定的延伸時(shí)間內(nèi)完成擴(kuò)增鏈的延伸。標(biāo)準(zhǔn)PCR的延伸反應(yīng)時(shí)間通常為30秒至2分種，無(wú)論使用那一種DNA聚合酶在該時(shí)間內(nèi)最多能延伸2000堿基左右。出現(xiàn)與正反引物高度匹配順序的幾率與順序的長(zhǎng)短直接有關(guān)，順序較短如小于500堿基，在其上下游同時(shí)與正反引物有高度匹配的可能性就相當(dāng)?shù)?。順序較長(zhǎng)如超過幾千甚至幾萬(wàn)堿基，在其上下游同時(shí)與正反引物有高度匹配的可能性就較高，但因?yàn)檎匆锵喔舻木嚯x太長(zhǎng)不可能在30秒至2分鐘內(nèi)完成鏈的延伸。所以，標(biāo)準(zhǔn)PCR的非專一產(chǎn)物長(zhǎng)度實(shí)際上主要落在500至2000堿基的范圍內(nèi)。如果將基因組DNA切割成小于500-2000堿基長(zhǎng)的片段則形成非專一產(chǎn)物的機(jī)會(huì)就大大減小。
3.對(duì)每一個(gè)指定的識(shí)別順序?yàn)?，5或6個(gè)堿基的限制性核酸內(nèi)切酶，平均每隔256，1024或4096堿基就會(huì)出現(xiàn)一次，換言之，理論上用一個(gè)上述內(nèi)切酶可將基因組DNA切割成平均長(zhǎng)度為256，1024或4096堿基的片段。同時(shí)使用二個(gè)或更多的內(nèi)切酶特別是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶，就能使總順序?yàn)閹资畠|堿基對(duì)平均長(zhǎng)度為5萬(wàn)堿基的DNA原始模板切割成平均長(zhǎng)度低于幾百堿基的片段。假定基因組DNA總順序?yàn)?0億堿基對(duì)則用一個(gè)識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶切割平均能產(chǎn)生1000萬(wàn)以上的小片段，在這1000萬(wàn)片段中那些本來上下游二側(cè)存在與正反引物高度匹配順序，因而可能形成非專一產(chǎn)物的機(jī)會(huì)因順序被內(nèi)切酶切割而阻斷了。
4.至今已商業(yè)化的識(shí)別專一性不同的限制性核酸內(nèi)切酶有200多種，其中，識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的也有20多種，概率計(jì)算和實(shí)際測(cè)試均表明在標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150-800堿基范圍內(nèi)，幾乎每一擴(kuò)增片段都能找到一種或幾種識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶對(duì)該擴(kuò)增順序不切割，使用這些內(nèi)切酶就能在將基因組DNA切割成小片段的同時(shí)保持目標(biāo)基因片段完整。
5.從技術(shù)層面看限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)和PCR反應(yīng)的條件有相當(dāng)程度的相互兼容性，所以，基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶處理后可直接用于PCR反應(yīng)，甚至可在PCR反應(yīng)管內(nèi)先進(jìn)行酶切然后轉(zhuǎn)換至PCR反應(yīng)能以單管操作完成全部反應(yīng)。本發(fā)明的簡(jiǎn)便特點(diǎn)使他有廣泛實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供用限制性核酸內(nèi)切酶水解的基因組DNA作模板的PCR方法，以克服標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物的同時(shí)往往伴隨形成非專一產(chǎn)物、抑制目標(biāo)產(chǎn)物形成的缺陷，避免在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的過程中引入不確定的誤差因素。
技術(shù)方案本發(fā)明的以基因組DNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)選擇對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增順序沒有切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)模板DNA進(jìn)行酶切；(2)模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(5)步驟(2)-(4)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；上述限制性內(nèi)切酶采用識(shí)別順序?yàn)?-6個(gè)堿基的酶，優(yōu)選識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶?？梢栽谕幻盖蟹磻?yīng)中使用1-5種限制性內(nèi)切酶，優(yōu)選同時(shí)使用2-4種限制性內(nèi)切酶。
酶切反應(yīng)完成后移出模板DNA，在另一管中進(jìn)行PCR，也可以在同一反應(yīng)管內(nèi)直接繼續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
酶切反應(yīng)完成后可采用加熱的方法滅活限制性內(nèi)切酶，比如65-95℃加熱20分鐘，也可不加熱直接接續(xù)PCR。
在采用單一反應(yīng)管方法完成本發(fā)明酶切和PCR反應(yīng)的技術(shù)方案中，酶切反應(yīng)液與PCR反應(yīng)液相同；酶的總用量體積為反應(yīng)體積的1-10％。
進(jìn)行本發(fā)明所述的酶切模板DNA和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，其包含如下組分PCR緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸、耐熱DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和模板DNA，其中內(nèi)切酶的總用量體積為反應(yīng)體積的1-10％。
為理解上述技術(shù)方案的操作過程及其原理，現(xiàn)就幾個(gè)關(guān)鍵步驟說明如下第一，首先確定對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增順序沒有切割位點(diǎn)的所有限制性內(nèi)切酶，特別是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶。
對(duì)于每一個(gè)引物確定、順序已知的擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶圖譜分析軟件如WebCutter2.0(www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)或NEBcutter1.0(www.neb.com)等列出對(duì)目標(biāo)順序不切割的酶，特別是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的那些酶。表1列出16種識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的已商品化的限制性內(nèi)切酶的主要特征。根據(jù)概率任何一個(gè)指定的4堿基順序在核酸序列中出現(xiàn)的平均頻率是1/256。對(duì)一個(gè)指定的識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶和一個(gè)指定的256堿基核酸序列，最大的可能是有一個(gè)切點(diǎn)，但也可能沒有切點(diǎn)或有2個(gè)、3個(gè)或更多的切點(diǎn)。我們用New-England-Labs提供的軟件(www.neb.com)測(cè)試表1所列16種酶對(duì)從人肌動(dòng)球蛋白基因(基因庫(kù)編號(hào)BC016045)隨機(jī)選取的9個(gè)長(zhǎng)度為128堿基的核酸片段，從人腫瘤抑制基因P53的第二外顯子(基因庫(kù)編號(hào)AF136270)中隨機(jī)選取的9個(gè)長(zhǎng)度為256堿基的核酸片段，和從人RNA結(jié)合蛋白2基因全mRNA(基因庫(kù)編號(hào)NM 006267)中隨機(jī)選取的9個(gè)長(zhǎng)度為512堿基的核酸片段進(jìn)行了測(cè)試，切割情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果例于表2。
表1.16種識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶

表2.16種酶對(duì)隨機(jī)選擇的核酸片段的切割情況

表2說明當(dāng)測(cè)試核酸順序長(zhǎng)度在500堿基以下時(shí)，至少有2個(gè)列于表1的內(nèi)切酶對(duì)測(cè)試順序不切割，平均有5個(gè)以上的酶對(duì)測(cè)試順序不切割。核酸順序越短不切割順序的酶就越多。
第二，用上述內(nèi)切酶特別是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶來分解模板DNA。
用一個(gè)或幾個(gè)對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增順序不切割的酶或他們的同功酶與模板DNA保溫2小時(shí)左右。目標(biāo)擴(kuò)增順序DNA被完整保留下來而基因組DNA的其他部位則被切成大小不等的小片段。我們用NEB提供的軟件測(cè)試了表1所列16種酶對(duì)Lamda噬菌體的切割情況分析結(jié)果列于表3，表中各個(gè)豎項(xiàng)的數(shù)據(jù)均以數(shù)值的大小為序列出。
表3.16種酶對(duì)Lamda噬菌體的切割

表3說明識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶能將含5萬(wàn)堿基對(duì)的Lamda噬菌體切割成幾十至幾百個(gè)片段，平均值為196個(gè)片段，與按隨機(jī)原則計(jì)算的片段數(shù)189(48,506/256)非常接近。以人基因組順序?yàn)?0億堿基對(duì)來計(jì)算則一個(gè)識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶酶能將基因組DNA平均分解成1千余萬(wàn)個(gè)片段。通過酶切阻斷了那些本來在這些片段的上下游與正、反引物均有較高互補(bǔ)順序形成非專一產(chǎn)物的機(jī)會(huì)?；蚪MDNA酶切后的殘留片段大多數(shù)是短片段，與正反引物均有較高互補(bǔ)的可能性就相當(dāng)?shù)?。?顯示殘留片段中大于500堿基的片段平均占總片段數(shù)的15％，而大于1000堿基的片段平均只占5％。
第三，確定同時(shí)使用2種或2種以上的限制性內(nèi)切酶。
從宏觀來看各種內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)的出現(xiàn)是彼此獨(dú)立互不關(guān)聯(lián)的。所以，如果同時(shí)用2，3，4或5種的上述內(nèi)切酶來切割基因組DNA，目標(biāo)擴(kuò)增順序仍能不受任一種酶切割而保持其完整，但基因組DNA中的非目標(biāo)順序則被切割成更大量的更短的片段，這些小片段成為非專一擴(kuò)增的模板的可能性就更小。按數(shù)學(xué)推算如果使用2至5種酶來分解基因組DNA，大于500堿基的片段比例將遠(yuǎn)小于0.1％，而大于1000堿基的片段的比例將小于0.001％。為了達(dá)到較好的效果通常使用2-5種內(nèi)切酶，這些酶可以分別在其最適條件下先后作用。為了使操作簡(jiǎn)便，優(yōu)選使用幾種酶混合同時(shí)作用的方法。下述事實(shí)使幾種酶同時(shí)使用具有普遍的現(xiàn)實(shí)可行性。1.許多限制性內(nèi)切酶有識(shí)別順序相同的各種同功酶(表1)，同功酶之間的最適作用緩沖液種類可能不同，這就提供了較多的選擇機(jī)會(huì)。2.雖然每一種內(nèi)切酶都有其最適緩沖液種類，但是在其他種類緩沖液中往往也顯示100％的活力或相當(dāng)高的活力(表4)。3.通過增加酶量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間能使一些在非最適緩沖液中作用的酶也完成對(duì)模板的完全切割。
表4列出16種識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶的技術(shù)數(shù)據(jù)。
表4.16種酶的主要技術(shù)數(shù)據(jù)

表4說明對(duì)任何一個(gè)指定的擴(kuò)增產(chǎn)物通過選擇酶及他們的同功酶，不難找到一種緩沖液使所使用的2，3，4或5種不同識(shí)別順序的酶均顯示最大的或較高的活力。從本發(fā)明的原理看即使某一種或幾種酶在水解模板DNA時(shí)未能發(fā)揮出最佳效果，實(shí)際上對(duì)克服和消除非專一產(chǎn)物也不一定有負(fù)面影響。
第四，混合使用的酶的數(shù)量的限制。
理論上對(duì)混合使用的酶的數(shù)量沒有限制，但是從必要性、方便性和效果等方面考慮，一般混合使用的酶不宜超過5種。為了保持限制性核酸內(nèi)切酶在儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性，商品化內(nèi)切酶溶液均含有50％的甘油，而當(dāng)酶切液甘油濃度大于5％時(shí)，一部分限制性內(nèi)切酶可能會(huì)切割正常切點(diǎn)以外的位點(diǎn)，即出現(xiàn)所謂的“星活力”。為了避免這種現(xiàn)象發(fā)生導(dǎo)至可能對(duì)目標(biāo)模板的切割，無(wú)論使用一種還是幾種內(nèi)切酶，酶的總用量體積應(yīng)不超過反應(yīng)體積的10％。表5列出當(dāng)使用的酶從1-5種時(shí)反應(yīng)液的配制。其中DNA的加量根據(jù)模板DNA的濃度和PCR反應(yīng)液所需濃度決定。以高等生物基因組DNA為模板時(shí)，模板DNA的加量通常為每50微升PCR反應(yīng)液0.2-1微克。表5列出使用1-5種內(nèi)切酶時(shí)酶切溶液的配制。
表5.內(nèi)切酶反應(yīng)液的配制


第五，酶切反應(yīng)液完成后可以直接作為PCR反應(yīng)的模板。
含基因組DNA酶切片段的反應(yīng)液可以在65℃保溫20分種使酶失活，或者直接加入PCR反應(yīng)液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。表6列出有代表性的PCR反應(yīng)緩沖液組成和NEB的4種緩沖液做成，及按表5操作時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)液的影響。
表6.PCR和酶切反應(yīng)液組成

表6表明PCR反應(yīng)緩沖液的強(qiáng)度比從酶切反應(yīng)帶入的強(qiáng)4-20倍，pH不會(huì)受到可檢測(cè)的或顯著的影響。酶切反所帶的鎂離子、鉀離子和巰基乙醇濃度低而且對(duì)PCR沒有負(fù)面影響。Promega和Roche等公司所推薦的各種緩沖液的組成與表6所述大同小異，也均可在酶切反應(yīng)后直接用于PCR反應(yīng)。不同公司產(chǎn)品的內(nèi)切酶溶液中還含有50-300mM的鉀或鈉鹽，10mM緩沖液，0.1mMEDTA和200-500ng/ml的白蛋白。在酶總用量不超過酶切反應(yīng)液體積10％的情況下，對(duì)PCR反應(yīng)沒有負(fù)面影響。
第六，酶切反應(yīng)可直接在PCR反應(yīng)液中進(jìn)行。
在PCR克隆和PCR-限制性內(nèi)切長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)等的研究中常常在PCR反應(yīng)后直接加限制性內(nèi)切酶來分解擴(kuò)增片段，說明內(nèi)切酶也能在PCR反應(yīng)液中分解DNA。NEB公司的研究指出在20微升含1微克DNA，1單位Vent-DNA聚合酶，dNTPs和緩沖液(pH8.8)等各種成份的PCR反應(yīng)液中加5U的限制性內(nèi)切酶，在經(jīng)測(cè)定的近百種內(nèi)切酶包括列于表1的13種酶中有8種能使DNA被完全分解，另5種酶也能將約50％的DNA分解。在含各種成份包括基因組DNA，引物和含抗體的TaqDNA聚合酶的PCR反應(yīng)液種加入一種或幾種選定的內(nèi)切酶，先在基因擴(kuò)增儀中37℃保溫2小時(shí)然后切換至通常的PCR反應(yīng)程序，即能完成酶切和PCR反應(yīng)。
有益效果1.本發(fā)明所需試劑有商品出售操作簡(jiǎn)單也不需要摸索反應(yīng)條件，但能有效減少或消除標(biāo)準(zhǔn)PCR方法通常會(huì)形成的非專一產(chǎn)物。
2.本發(fā)明能廣泛普遍被應(yīng)用，既可在標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍的150-800堿基內(nèi)應(yīng)用，又可擴(kuò)展至更短或更長(zhǎng)的產(chǎn)物。應(yīng)用于長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)應(yīng)考慮引物的選擇使擴(kuò)增產(chǎn)物順序內(nèi)含一定數(shù)量的不切割順序的限制性核酸內(nèi)切酶。
3.本發(fā)明對(duì)引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)條件沒有特殊要求，只在原有的引物和PCR條件下加入酶切步驟即可。
4.本發(fā)明對(duì)與其他各種改善標(biāo)準(zhǔn)PCR專一性的技術(shù)如熱啟動(dòng)，嵌套式PCR等完全兼容。應(yīng)用本發(fā)明不影響其他新技術(shù)的應(yīng)用又可在各項(xiàng)新技術(shù)上增加本技術(shù)。
5.本發(fā)明提高PCR專一性是基于一種隨機(jī)性的原則，除了需要知道目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的順序外，不需要考慮擴(kuò)增對(duì)象的其他各種背景和數(shù)據(jù)。
6.長(zhǎng)度為幾萬(wàn)堿基的大分子DNA在變性步驟后成為單鏈DNA，在與引物退火或自身退火之間會(huì)有復(fù)雜的空間構(gòu)型。PCR反應(yīng)之初在DNA聚合酶和引物與目標(biāo)DNA的退火部位之間可能存在位阻現(xiàn)象使擴(kuò)增的起始受到抑制。但DNA聚合酶能在一些與引物雖然不完全匹配但無(wú)空間位阻的非目標(biāo)順序結(jié)合部位引發(fā)擴(kuò)增。限制性內(nèi)切酶將大分子核酸切割成小片段，使引物的目標(biāo)和與非目標(biāo)順序的結(jié)合部位充分暴露，從而充分發(fā)揮引物與完全匹配順序結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
非專一產(chǎn)物形成與模板DNA的復(fù)雜性有關(guān)。
本實(shí)施例使用從人肌動(dòng)球蛋白基因(1841堿基對(duì)，基因庫(kù)編號(hào)BC016045)中找到的特殊引物進(jìn)行試驗(yàn)。正反引物完全相同引物順序?yàn)?’GCCCAGCGGGTGACGATGCC 3’，引物的解鏈溫度82.9℃，3’端堿基互補(bǔ)為2個(gè)核苷酸，能量為每克分子-3.1千卡，引物3’端堿基內(nèi)部穩(wěn)定度為9.6。引物與人肌動(dòng)球蛋基因的第134-153順序有16個(gè)匹配堿基和4個(gè)錯(cuò)配堿基，引物與模板的結(jié)合效率為349點(diǎn)。該引物同時(shí)又與人肌動(dòng)球蛋基因的第295-314位的互補(bǔ)順序有17個(gè)匹配堿基和3個(gè)錯(cuò)配堿基，引物與模板的結(jié)合效率為356點(diǎn)。使用該引物以互補(bǔ)DNA得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為181堿基，由于擴(kuò)增產(chǎn)物順序在同一外顯子內(nèi)，所以用基因組DNA為模板能得到相同長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物。本實(shí)施例用此引物分別以人基因組DNA和由人組織總RNA以poly(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄得到的互補(bǔ)DNA為模板，在完全相同條件下作PCR比較非專一產(chǎn)物的形成。人基因組DNA為Roche公司產(chǎn)品每微升0.2微克?？俁NA為ClonTech產(chǎn)品每微升1.0微克，用該公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA。無(wú)論基因組DNA還是互補(bǔ)DNA均用ClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。每50微升反應(yīng)液加基因組DNA或互補(bǔ)DNA5微升。引物終濃度為0.8uM。PCR反應(yīng)參數(shù)首次變性94℃1分鐘，循環(huán)變性94℃10秒，退火52-72℃1分鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)數(shù)30，每管反應(yīng)體積為5微升。試驗(yàn)結(jié)果列于表7。
表7.實(shí)施例1試驗(yàn)結(jié)果

##多少表示目標(biāo)條帶的強(qiáng)度++多少表示非專一條帶數(shù)的多少-表示沒有條帶互補(bǔ)DNA不含有不表達(dá)的基因順序，也不含內(nèi)含子順序，其總順序量約為基因組DNA的十分之一。表7說明以互補(bǔ)DNA為模板時(shí)由于模板DNA比基因組DNA簡(jiǎn)單目標(biāo)模板相對(duì)豐度又較高，在所試的寬達(dá)20℃的退火溫度范圍內(nèi)均能有效擴(kuò)增。非專一產(chǎn)物隨溫度升高而降低，當(dāng)退火溫度大于約67℃時(shí)非專一產(chǎn)物完全消失。當(dāng)退火溫度較低時(shí)雖有大量非專一產(chǎn)物但均不競(jìng)爭(zhēng)抑制目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增。以基因組DNA為模板時(shí)在同樣反應(yīng)件下非專一產(chǎn)物合成要嚴(yán)重得多。在較低退火溫度下大量的非專一產(chǎn)物的形成甚至完全抑制了目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，在較高退火溫度下非專一產(chǎn)物擴(kuò)增有所降低，但仍強(qiáng)于目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。這一結(jié)果提示降低基因組DNA的復(fù)雜性有可能改善PCR的專一性。
實(shí)施例2.
各種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA的酶切試驗(yàn)。
選擇了若干種識(shí)別順序?yàn)?-6堿基的酶單獨(dú)、2種或3種酶混合分解基因組DNA，每一反應(yīng)管總反應(yīng)體積10微升，每管加基因組DNA2微升內(nèi)含人和小鼠基因組DNA各0.5微克，無(wú)離子水6微升，緩沖液1微升。緩沖液種類和內(nèi)切酶的加量列于表8。在37℃保溫2小時(shí)用1％Agarose凝膠電泳然后用溴乙錠染色，用圖象分析儀測(cè)定不同區(qū)域的掃描強(qiáng)度分布，測(cè)試和計(jì)算結(jié)果結(jié)果列于表9。
表8.限制性內(nèi)切酶分解基因組DNA的反應(yīng)液組成

表9.實(shí)施例2試驗(yàn)結(jié)果

*接近點(diǎn)樣槽區(qū)域的核酸**以掃描區(qū)域的強(qiáng)度除以該區(qū)域核酸長(zhǎng)度的算術(shù)平均值來計(jì)算表9說明用識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的BamHI來分解基因組DNA，分解產(chǎn)物主要是較大分子DNA，1000堿基以上片段的掃描強(qiáng)度占總強(qiáng)度的90％。用識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶分解DNA，則切割后主要是小分子DNA，小于1000堿的DNA的掃描強(qiáng)度占總強(qiáng)度的40-60％。幾個(gè)酶同時(shí)作用則所產(chǎn)生的片段更小，以Sacll(識(shí)別順序6個(gè)堿基〕和3個(gè)識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶聯(lián)合作用，小于500堿基的片段數(shù)占總片段數(shù)的95％。
實(shí)施例3.
基因組DNA酶切后PCR擴(kuò)增人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因。
從人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(1283堿基對(duì)，基因庫(kù)編號(hào)XM 006959〕借助引物設(shè)計(jì)軟件得到一對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)性良好的引物，其順序和特性列于表10和11，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為348堿基。
表10.實(shí)施例3引物順序

表11.實(shí)施例3引物特性

用NEBCutter1.0得到對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物不切割的識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的內(nèi)切酶有Bfal，Taql，Hhal，Mbol，Rsal，和Tru9l。本例使用后4種酶混合來分解人基因組DNA，酶分解液組成列于表12。
表12.實(shí)施例3酶分解液組成

將上述反應(yīng)液在37℃保溫2小時(shí)，然后65℃加熱20分鐘使酶失活，對(duì)照組每50微升PCR反應(yīng)液加基因組DNA5微升，試驗(yàn)組加上述酶分解液10微升，內(nèi)含相當(dāng)于5微升的基因組DNA。PCR反應(yīng)液的組成和反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，正反引物濃度均為0.4uM。PCR結(jié)束后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，用溴乙錠染色后用圖像掃描儀分析目標(biāo)條帶和非專一條帶的強(qiáng)度，試驗(yàn)結(jié)果列于表13。
表13.實(shí)施例3試驗(yàn)結(jié)果

-沒有目標(biāo)擴(kuò)增條帶上述結(jié)果說明隨退火溫度升高非專一產(chǎn)物減少，當(dāng)退火溫度大于69℃時(shí)沒有非專一產(chǎn)物條帶，但目標(biāo)產(chǎn)物條帶也消失。退火溫度為52-67℃時(shí)，常規(guī)方法的對(duì)照組在500-1500堿基區(qū)域內(nèi)有嚴(yán)重的非專一產(chǎn)物形成，在低退火溫度下，非專一產(chǎn)物的總量甚至是目標(biāo)產(chǎn)物的幾倍，基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶水解后在所試退火溫度范圍內(nèi)非專一產(chǎn)物相對(duì)量均比對(duì)照組顯著減少。當(dāng)退火溫度較高時(shí)，長(zhǎng)度為1000-1500堿基的非專一產(chǎn)物幾乎完全消失，突顯了內(nèi)切酶水解對(duì)阻斷該區(qū)段長(zhǎng)度非專一產(chǎn)物的作用。
實(shí)施例4.
基因組酶切后擴(kuò)增人beta-2-腎上腺素受體基因擴(kuò)增。
從人的beta-2-腎上腺素受體基因(3451堿基對(duì)，基因庫(kù)編號(hào)M15169〕借助引物設(shè)計(jì)軟件得到一對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)性良好的引物，其順序和特性列于表14和15，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為252堿基。
表14.實(shí)施例4引物順序

表15.實(shí)施例4引物特性

用WebCutter2.0得到不切割目標(biāo)順序的酶譜，分別選用2-5種酶來分解基因組DNA。酶分解液的配制列于表16。
表16.實(shí)施例4酶分解液配制

酶分解條件，試驗(yàn)組與對(duì)照組的PCR反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件均與實(shí)施例3相同。試驗(yàn)結(jié)果列于表17。
表17.實(shí)施例4結(jié)果

表17結(jié)果說明無(wú)論對(duì)照組還是試驗(yàn)組在所試的52-72℃的退火溫度下均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但對(duì)照組在任一試驗(yàn)溫度下都有可檢測(cè)的非專一條帶，在低退火溫度下，大量非專一產(chǎn)物對(duì)引物的競(jìng)爭(zhēng)甚至明顯影響了目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度。在各試驗(yàn)組中非專一產(chǎn)物的數(shù)量隨退火溫度升高而降低，也隨混合使用的內(nèi)切酶種類增加而減少，當(dāng)使用Alul等5種酶時(shí)，在60-72℃的退火溫度范圍內(nèi)都得到強(qiáng)的目標(biāo)產(chǎn)物條帶而無(wú)任何非專一產(chǎn)物條帶。
實(shí)施例5.
限制性核酸內(nèi)切酶水解反應(yīng)與PCR在同一管進(jìn)行。
實(shí)施例5的PCR引物和反應(yīng)條件與實(shí)施例4相同，但每反應(yīng)管體積為10微升。分解基因組DNA的酶的種類與實(shí)施例4的試驗(yàn)C相同，即用5種不同的識(shí)別順序?yàn)?或4堿基的內(nèi)切酶。內(nèi)切酶直接加在PCR反應(yīng)液中，每100微升PCR反應(yīng)液加每一種內(nèi)切酶1微升，PCR反應(yīng)液的其他組成成分的濃度均不變。在基因擴(kuò)增儀上先37℃保溫2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入常規(guī)PCR程序。試驗(yàn)結(jié)果列于表18。
表18.實(shí)施例5結(jié)果

+陽(yáng)性條帶，其數(shù)量表示強(qiáng)度-陰性表18說明在PGR反應(yīng)液中內(nèi)切酶仍顯示活力，對(duì)克服非專一產(chǎn)物形成有明顯效果。
權(quán)利要求
1.一種以基因組DNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)選擇對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增順序無(wú)切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切；(2)模板變性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(5)按步驟(2)-(4)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于限制性內(nèi)切酶是識(shí)別順序?yàn)?-6個(gè)堿基的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于限制性內(nèi)切酶是識(shí)別順序?yàn)?個(gè)堿基的酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于在同一反應(yīng)中使用1-5種限制性內(nèi)切酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于在同一反應(yīng)中使用2-4種限制性內(nèi)切酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于酶切反應(yīng)完成后移出模板DNA進(jìn)行PCR或者在同一反應(yīng)管內(nèi)直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于酶切反應(yīng)完成后加熱滅活限制性內(nèi)切酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4中任一項(xiàng)所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于酶切反應(yīng)液與PCR反應(yīng)液相同。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于內(nèi)切酶的總用量體積為反應(yīng)體積的1-10％。
10.進(jìn)行權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液，包含如下組分PCR緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸、耐熱DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和模板DNA，其特征在于內(nèi)切酶的總用量體積為反應(yīng)體積的1-10％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用限制性核酸內(nèi)切酶水解的基因組DNA作模板的PCR方法及其反應(yīng)液，以克服標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物的同時(shí)往往伴隨形成非專一產(chǎn)物、抑制目標(biāo)產(chǎn)物形成的缺陷。通過選擇對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增順序無(wú)切點(diǎn)的1－5種內(nèi)切酶，特別是識(shí)別4－6堿基序列的酶對(duì)模板DNA進(jìn)行酶切，然后直接接續(xù)PCR的方法，即可避免在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測(cè)產(chǎn)物的過程中引入不確定的誤差因素。利用PCR儀完成反應(yīng)，步驟簡(jiǎn)便易于控制，檢測(cè)專一性大大提高，適用于核酸樣品的快速分析和微量病原體檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1536086SQ0311632
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月11日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 孫崇榮, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧