一種大批量開發(fā)苧麻基因組ssr標記的方法及其開發(fā)的引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種大批量開發(fā)苧麻基因組SSR的方法及其開發(fā)的引物；具體包括如下步驟：(1)提取苧麻的DNA；(2)利用Rsal酶對苧麻基因組進行酶切，獲得214-314bp的小片段；(3)對酶切獲取的小片段進行測序，獲得SLAF標簽；(4)對標簽，利用SSRhunter搜索SSR序列；(5)對搜索到的SSR序列進行引物設計，經(jīng)引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即為基因組SSR標記。相對于傳統(tǒng)的磁珠富集法，方法易行，操作簡便，效率高，成本低。大批量苧麻基因組SSR標記的獲得，為苧麻分子生物學和遺傳學奠定了堅實基礎。
【專利說明】-種大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法及其開發(fā)的引 物

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領域】，具體涉及一種從苧麻基因組中高通量開發(fā)SSR標 記的方法及其開發(fā)的引物。

【背景技術(shù)】
[0002] 簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR)，也稱微衛(wèi)星（microsatellite), 是指以1?6個核苷酸為單位在基因組中多次串聯(lián)重復的DNA序列（Akkaya M, Bhagwata A, Cregan B. 1992.Length polymorphisms of simple repeat DNA in soybean. Genetics. 132:1131-1139)。SSR標記與其它分子標記技術(shù)相比，具有易檢測、共顯性遺 傳、重復性好、數(shù)量豐富和多態(tài)性高以及遍布整個基因組等優(yōu)點，因此在植物遺傳研究的 眾多方面受到重視（Schlotterer C. 2004. The evolution of molecular markers-just a matter offashion. Nat Rev Genet. 5:63-69)。SSR 可分為基因組 SSR 和 EST-SSR。傳 統(tǒng)的基因組SSR標記開發(fā)一般使用文庫篩選法、磁珠富集法，開發(fā)過程繁瑣、時間長、成本 高，而且效率低（Roder MS，Korzun V，WendehakeK，Plaschke J，Tixier MH，Leroy P, Ganal MW. 1998.A microsatellite map of wheat. Genetics. 149:2007-2023)。此外，傳統(tǒng)方法開 發(fā)的基因組SSR不但數(shù)量較少，而且重復基序也限制在2?3個核苷酸，極大地限制了基因 組SSR的應用范圍（林元震，郭海，黃少偉，劉純鑫，劉天頤，陳曉陽.2009. EST-SSR標記在 木本植物中的開發(fā)和應用.植物生理學通訊.45(12) : 1221-1225)。
[0003] 隨著具有高通量、低成本、測序錯誤率低、測序讀長短特點的新一代測序技術(shù)和生 物信息學的發(fā)展，使得高通量標記開發(fā)成為可能。目前，苧麻開發(fā)的SSR標記主要采用磁珠 富集法和從EST中開發(fā)SSR標記，開發(fā)的SSR標記不足2000對。利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā) SSR標記尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供一種大批量開發(fā)苧麻基因組SSR的方法及其開發(fā)的引 物；相對于傳統(tǒng)的磁珠富集法，方法易行，操作簡便，效率高，成本低。大批量苧麻基因組 SSR的獲得，為苧麻分子生物學和遺傳學奠定了堅實基礎。
[0005] -種大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，具體包括如下步驟：
[0006] (1)提取苧麻的DNA ;
[0007] (2)將苧麻基因組DNA酶切為小片段；
[0008] (3)對酶切后獲取的小片段進行測序，獲得SLAF標簽；
[0009] (4)對步驟（3)獲得的標簽，利用SSR hunter搜索SSR序列；
[0010] (5)對搜索到的SSR序列進行引物設計，經(jīng)引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即 為基因組SSR標記。
[0011] 步驟（2)中采用RsaI酶酶切苧麻基因組DNA。酶切后獲取長度為214-314bp的片 段。步驟（4)的SSR hunter搜索SSR序列的標準為：單核苷酸的重復次數(shù)> 16,二核苷酸 的重復次數(shù)> 8,三核苷酸的重復次數(shù)> 5,四核苷酸的重復次數(shù)> 4,五核苷酸的重復次數(shù) > 3,或者六核苷酸的重復次數(shù)> 3 ;
[0012] 步驟（5)的引物設計參數(shù)：擴增產(chǎn)物長度在100-180bp，引物長度在18-25bp。
[0013] 采用上述方法設計并經(jīng)過多態(tài)性檢測的15對基因組SSR引物序列如下：
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，其特征在于，具體包括如下步驟： (1) 提取苧麻的DNA ; (2) 將苧麻基因組DNA酶切為小片段； (3) 對酶切后獲取的小片段進行測序，獲得SLAF標簽； (4) 對步驟（3)獲得的標簽，利用SSR hunter搜索SSR序列； (5) 對搜索到的SSR序列進行引物設計，經(jīng)引物多態(tài)性檢測，得到多態(tài)性引物，即為基 因組SSR標記。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，其特征在于，步驟 (2)中采用RsaI酶酶切苧麻基因組DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，其特征在于，酶切后 獲取長度為214-314bp的片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，其特征在于，步驟 (4) 的SSR hunter搜索SSR序列的標準為：單核苷酸的重復次數(shù)> 16,二核苷酸的重復次 數(shù)> 8,三核苷酸的重復次數(shù)> 5,四核苷酸的重復次數(shù)> 4,五核苷酸的重復次數(shù)> 3,或者 六核苷酸的重復次數(shù)> 3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法，其特征在于，步驟 (5) 的引物設計參數(shù)：擴增產(chǎn)物長度在100_180bp，引物長度在18-25bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的大批量開發(fā)苧麻基因組SSR標記的方法， 其特征在于，設計并經(jīng)過多態(tài)性檢測的15對基因組SSR引物序列如下：
7. 用于苧麻基因組SSR標記的引物，其特征在于，15對基因組SSR標記引物序列如下：
【文檔編號】C12N15/11GK104212897SQ201410449957
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】欒明寶, 劉晨晨, 陳建華, 王曉飛, 許英, 孫志民 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所