專利名稱：雜交部分控制寡核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析樣品核酸中的選定核苷酸序列的核酸雜交領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及具有新結(jié)構(gòu)的雜交部分控制寡核苷酸及其應(yīng)用，其中該雜交部分控制寡核苷酸具有產(chǎn)生特異性雜交和檢驗(yàn)雜交結(jié)果的雙重功能。
背景技術(shù)：
DNA鏈與其互補(bǔ)鏈結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA雜交是分子生物學(xué)的基本過程。雙鏈體的形成受離子強(qiáng)度、堿基組成、核酸轉(zhuǎn)化為的片斷的長(zhǎng)度、錯(cuò)配程度和變性劑的存在影響。原則上，任何核酸—雙鏈DNA、單鏈DNA、寡核苷酸、mRNA和RNA—可以作為探針。選用哪個(gè)作為探針取決于試驗(yàn)的目的。通常，寡核苷酸探針被用于與靶序列形成完美配對(duì)的雙鏈體。寡核苷酸雜交試驗(yàn)基于以下通用方案探針或靶序列被標(biāo)記(如用放射性同位素、熒光染料或反應(yīng)化合物)，核酸置于雜交條件下進(jìn)行雜交，去除未雜交的被標(biāo)記的物質(zhì)然后定量剩余的標(biāo)記。
提高區(qū)分精確雙鏈體和具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基對(duì)的雙鏈體的方法在特異性核酸序列確定方面是十分有用的工具，且在臨床診斷、遺傳研究和法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分析方面都具有明顯的價(jià)值。例如，Wallace及其同事證明如單個(gè)堿基變化的微小序列差異足以實(shí)現(xiàn)短(如14-基體)寡聚物的區(qū)分，并且證明了在β-球蛋白基因中的點(diǎn)突變的分子分析中的應(yīng)用性(Wallace et al.，1981；Conner et al.，1983)。
盡管寡核苷酸雜交具有能夠正確識(shí)別互補(bǔ)鏈的能力，但是寡核苷酸雜交仍面對(duì)限制。含有寡核苷酸的雜交體與長(zhǎng)核酸的雜交體比更不穩(wěn)定。這點(diǎn)在更低的解鏈溫度被反映。雜交體的不穩(wěn)定性是設(shè)計(jì)寡核苷酸雜交時(shí)被考慮的最重要的因素之一。完美配對(duì)的互補(bǔ)和僅一個(gè)堿基錯(cuò)配的互補(bǔ)之間的穩(wěn)定性差異可以是非常小的，相當(dāng)于它們的Tm(雙鏈解鏈溫度)(duplex melting temperature)0.5℃的小的差異(Tibanyendaet al.，1984；Werntges et al.，1986)。目的寡聚物越短(允許在更復(fù)雜的混合物中進(jìn)行互補(bǔ)鏈的識(shí)別)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配對(duì)整個(gè)雙鏈體穩(wěn)定性的影響就越強(qiáng)。然而，使用如此短的寡聚核苷酸的缺點(diǎn)是即使對(duì)于完美互補(bǔ)的序列，它們雜交也較弱，因此必須在降低嚴(yán)格性的條件下被使用。因此，仍需要一種即使在高嚴(yán)格條件下寡核苷酸也更穩(wěn)定的修飾短寡核苷酸的方法，從而在如此高嚴(yán)格條件下短核苷酸雜交的特異性被提高到足以實(shí)現(xiàn)單核苷酸錯(cuò)配的識(shí)別。
一直有提高寡核苷酸雜交的特異性方面的許多努力。用于高靈敏度雜交的化學(xué)修飾DNA堿基方法(Azhikina et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9011460-11462(1993))和雜交后在低溫下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行清洗以提高識(shí)別錯(cuò)配的能力的方法(Drmanac et al.，DNA and Cell Biology，9527-534(1990))已經(jīng)被提出。最近，用于通過人工錯(cuò)配方法提高DNA雜交中單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的識(shí)別的另一種方法已經(jīng)被介紹(Guo etal.，Nature Biotechnology，15331-5(1997))。此外，包括美國(guó)專利號(hào)為6,077,668，6,329,144，6,140,054，6,350,580，6,309,824，6,342,355和6,268,128的許多美國(guó)專利都公開了用于雜交的探針及該探針的應(yīng)用。盡管各方法的改進(jìn)方法不斷地被介紹，所有這些涉及寡核苷酸雜交的方法和技術(shù)都不能完全地免于寡核苷酸雜交的非特異性所引起的限制和問題。
此外，仍然存在如寡核苷酸點(diǎn)樣和在基質(zhì)上的固定及優(yōu)化雜交條件的建立的失敗的人為因素將會(huì)影響雜交陰性結(jié)果的可能性；尤其錯(cuò)誤結(jié)果的效果更易于影響高通量篩選方法產(chǎn)生的結(jié)果。這種點(diǎn)樣和雜交的固有的人為因素是基于寡核苷酸的DNA微陣列中主要的實(shí)際缺陷。因而能夠使用本身具有檢驗(yàn)雜交結(jié)果的功能的寡核苷酸在基于寡核苷酸的DNA微陣列方面應(yīng)該是有益的。
貫穿本申請(qǐng)，各種專利和文獻(xiàn)被參考并且引用被在括號(hào)中提供。這些專利和文獻(xiàn)在實(shí)體方面的公開內(nèi)容通過參考由此被包括在本發(fā)明中以更充分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所涉及技術(shù)領(lǐng)域的闡述。

發(fā)明內(nèi)容
在致力于解決此常規(guī)探針和雜交方法中存在的問題過程中，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)展出能夠允許具有更高特異性的雜交和其在有關(guān)雜交技術(shù)的所有領(lǐng)域中的不受限制應(yīng)用的新寡核苷酸。
據(jù)此，本發(fā)明的目的是提供用于通過雜交分析樣品核酸中靶核苷酸序列的寡核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于通過雜交檢測(cè)樣品核酸中的靶核苷酸序列的存在的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種用于鑒定樣品核酸的靶核苷酸序列中的核苷酸變異的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用于進(jìn)行雜交的試劑盒。
本發(fā)明的再一進(jìn)一步目的是提供用于鑒定樣品核酸的靶核苷酸中的核苷酸變異的試劑盒。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)通過結(jié)合附加權(quán)利要求和附圖的詳細(xì)描述將變得明顯。


圖1為評(píng)估該寡核苷酸的雜交特異性的放射自顯影照片。在所有板中，野生型等位基因特異性寡核苷酸(泳道1)和突變型等位基因特異性寡核苷酸(泳道2)被固定到尼龍膜上。板A顯示試驗(yàn)所用的寡核苷酸被等量地點(diǎn)樣于各膜上。B板中，顯示突變型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。板C顯示用于證實(shí)第一雜交結(jié)果的第二雜交的結(jié)果。
圖2為顯示使用本寡核苷酸的野生型基因組DNA片斷的雜交反應(yīng)的結(jié)果。野生型等位基因特異性寡核苷酸(泳道1)、突變型等位基因特異性寡核苷酸(泳道2)和陰性對(duì)照寡核苷酸(泳道3)被固定到尼龍膜上。在板B中，顯示野生型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。板C表示用于證實(shí)第一雜交的結(jié)果的第二雜交的結(jié)果。
圖3為表示使用本寡核苷酸的突變型基因組DNA片斷的雜交反應(yīng)的結(jié)果的放射性自顯影照片。泳道和板的說明與圖2相同。
圖4為顯示使用本寡核苷酸進(jìn)行雜合型基因組DNA片斷的雜交反應(yīng)的結(jié)果的放射自顯影照片。泳道和板的說明與圖2相同。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明總體地涉及具有產(chǎn)生特異性雜交和定量地核實(shí)雜交結(jié)果的雙重功能的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸被命名為雜交部分控制寡核苷酸(下文稱為“HPC寡核苷酸”)，該寡核苷酸能夠確保與靶核苷酸序列的非常特異性的雜交反應(yīng)，因此使用雜交的各種分析能夠以更高的可信度被進(jìn)行。
HPC寡核苷酸的原理是基于它的新結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有(i)具有與靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的核苷酸序列的第一雜交部分，(ii)具有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的第二雜交部分，(iii)含有位于第一雜交部分和第二雜交部分之間的至少兩個(gè)通用堿基和非識(shí)別堿基類似物的調(diào)控子部分。
本HPC寡核苷酸允許第一和第二雜交部分分別參與到作為第一雜交和第二雜交的兩個(gè)獨(dú)立的雜交中。HPC寡核苷酸中通用堿基或非識(shí)別堿基殘基基團(tuán)的出現(xiàn)使在第一雜交中僅第一雜交部分被與靶核苷酸序列雜交。此外，第二雜交部分用作定量檢驗(yàn)第一雜交反應(yīng)結(jié)果的第二雜交的通用雜交位點(diǎn)。因而，只是使用該雙重功能的HPC寡核苷酸，與靶核苷酸序列的特異性雜交和第一雜交結(jié)果的定量檢驗(yàn)就能被完成。
因?yàn)檫@些原因，本發(fā)明的HPL寡核苷酸就在一定嚴(yán)格條件下提高寡核苷酸雜交的特異性和定量檢驗(yàn)雜交結(jié)果的方式而言，基本上不同于常規(guī)寡核苷酸。
本發(fā)明的HPC寡核苷酸是顯著有效的并可在基于核酸雜交的應(yīng)用方面廣泛應(yīng)用。此外，常規(guī)寡核苷酸中與雜交特異性相關(guān)的各種問題可以通過本發(fā)明的HPC寡核苷酸被基本地解決。本HPC寡核苷酸的特征和優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下(a)由于本寡核苷酸的調(diào)控子部分由至少兩個(gè)由于其在堿基配對(duì)中的弱氫鍵結(jié)合相互作用而具有比本寡核苷酸的其它部分較低的Tm的通用堿基或非識(shí)別堿基類似物組成，所以該調(diào)控子部分并不參與在HPC寡核苷酸的第一雜交部分與靶核酸雜交的條件下的與靶核酸的雜交。因此，在第一和第二雜交部分之間通用堿基殘基基團(tuán)的出現(xiàn)在這些部分之間形成了分界，從而在第一雜交部分與靶核苷酸序列雜交的這種條件下，將寡核苷酸的雜交部分限制在第一雜交部分，因而第二雜交部分可以被完全地排除于第一雜交部分與其靶核苷酸序列之間的雜交反應(yīng)之外。也就是，當(dāng)?shù)谝浑s交部分與靶核苷酸序列雜交時(shí)，該調(diào)控子部分能夠打斷第二雜交部分的雜交，因此第一雜交部分的雜交特異性能夠被提高。因而，該寡核苷酸的雜交序列能夠被精確地控制，這樣使設(shè)計(jì)能夠具有期望數(shù)目的雜交序列的寡核苷酸成為可能。當(dāng)寡核苷酸的雜交部分不得不受限制時(shí)(如單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因定型，差異表達(dá)基因的DNA微陣列篩選和檢測(cè))這種寡核苷酸是十分有用的。
(b)當(dāng)本發(fā)明的HPC寡核苷酸與基質(zhì)如尼龍膜和玻璃結(jié)合時(shí)，與靶核苷酸序列不互補(bǔ)的第二雜交部分使第一雜交部分自由地與其靶核苷酸序列雜交，從而提高了第一雜交部分的雜交強(qiáng)度(效率)；(c)第一雜交部分的提高的雜交強(qiáng)度(效率)使雜交反應(yīng)能夠在包括更高雜交和清洗溫度的更嚴(yán)格條件下被進(jìn)行，因而該第一雜交部分的雜交特異性被提高；
(d)本HPC寡核苷酸的上述特征導(dǎo)致雜交特異性的顯著提高，因而整個(gè)雜交雙鏈體即使有一個(gè)錯(cuò)配也可以與完全配對(duì)區(qū)別開；因此，本HPC寡核苷酸對(duì)于鑒定靶核酸中的核苷酸變異是尤其有用的，包括，例如單核苷酸多態(tài)性和點(diǎn)突變；并且提供了對(duì)用于探針設(shè)計(jì)的“輸入?yún)?shù)”如寡核苷酸長(zhǎng)度、雜交溫度和GC含量具有高耐受性的寡核苷酸；及(e)第二雜交部分也允許檢驗(yàn)第一雜交結(jié)果，這樣能夠使第一雜交數(shù)據(jù)免于由于人為影響如在基質(zhì)上固定寡核苷酸和建立優(yōu)化雜交條件的失敗所導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果。
本發(fā)明的HPC寡核苷酸的原理關(guān)于本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了通過雜交分析樣品核酸中的靶核苷酸序列的HPC寡核苷酸。該HPC寡核苷酸具有以下通式結(jié)構(gòu)5’-Xp-Yq-Zr-3’或5’-Zr-Yq-Xp-3’其中Xp表示具有與與其雜交的樣品核酸中的靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的第一雜交部分；Yq表示含有至少兩個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物的調(diào)控子部分；Zr表示具有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的第二雜交部分；p、q和r表示核苷酸的數(shù)目；X、Y和Z為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
本HPC寡核苷酸的原理基于其具有通過含有至少兩個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基的調(diào)控子部分而分隔的第一雜交和第二雜交部分的新結(jié)構(gòu)和該調(diào)控子部分對(duì)于第一雜交和第二雜交部分的影響。在第一和第二雜交部分之間含有至少兩個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基的調(diào)控子部分的引入是雜交特異性提高的主要作用因素。
與核酸結(jié)合的術(shù)語“樣品”指任何含有或假定含有目的核酸(靶核苷酸序列)或本身為含有或假定含有目的靶核苷酸序列的核酸的任何物質(zhì)。術(shù)語“樣品”因而包括核酸(基因組DNA、cDNA、RNA)、細(xì)胞、器官、組織、體液的樣品，或包括但不限于，如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、眼淚、糞便、皮膚、和呼吸、腸和泌尿生殖器道的外分泌物、唾液、血細(xì)胞、腫瘤、器官、組織、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品、天然分離物(如飲用水、海水、固體物質(zhì))和微生物樣品的物質(zhì)。除非另有說明，術(shù)語“核酸”為以單鏈或雙鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括天然核苷酸的已知類似物。因此，本發(fā)明的寡核苷酸可以在使用雙鏈或優(yōu)選地，使用單鏈gDNA、cDNA或mRNA作為樣品核酸的雜交中被使用。在術(shù)語“核酸”和“核苷酸”之間沒有特意的區(qū)分，這些術(shù)語可以可以交換地被使用。
在此使用的術(shù)語“寡核苷酸”指包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等天然或修飾單體或連鎖體的線形寡聚物，該寡核苷酸能夠與天然形成的或合成制備的靶核苷酸序列特異地雜交。該寡核苷酸優(yōu)選為單鏈以獲得雜交中的最大效率。優(yōu)選地，該寡核苷酸為寡聚脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明的HPC寡核苷酸可以包括天然形成的dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP、dTMP)、核苷酸類似物或核苷酸衍生物。該寡核苷酸也可以包括核糖核苷酸。如，本發(fā)明的HPC寡核苷酸可以包括具有主鏈修飾的核苷酸如肽核酸(PNA)(M.Egholm et al.，Nature，365566-568(1993))，硫代磷酸酯DNA，二硫代磷酸酯DNA，氨基磷酸酯DNA，酰胺-連接的DNA，MMI-連接的DNA，2′-O-甲基RNA，α-DNA和磷酸甲酯DNA，具有糖修飾的核苷酸如2′-O-甲基RNA，2′-氟RNA，2′-氨基RNA，2′-O-烷基DNA，2′-O-烯丙基DNA，2′-O-炔基DNA，己糖DNA，吡喃糖RNA，和無水己糖醇DNA，和具有堿基修飾的核苷酸如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟-，溴-，氯-，碘-，甲基-，乙基-，乙烯基-，甲酸基-，乙炔基-，丙炔基-，炔基-，噻唑基-，咪唑基-，吡啶基-)，具有C-7取代基的7-脫氮嘌呤(取代基包括氟-，溴-，氯-，碘-，甲基-，乙基-，乙烯基-，甲酸基-，炔基-，烯烴基-，噻唑基-，咪唑基-，吡啶基-)，肌苷和二氨嘌呤。
此處結(jié)合本發(fā)明的HPC寡核苷酸使用的術(shù)語“部分”指由調(diào)控子部分分離的核苷酸序列。關(guān)于本HPC寡核苷酸的術(shù)語“第一雜交部分”指具有與與其雜交的樣品核酸中的靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的部分。該第一雜交部分可以位于HPC寡核苷酸的3’-或5’-末端部分。關(guān)于本HPC寡核苷酸使用的術(shù)語“第二雜交部分”指具有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的部分。此外，該第二雜交部分位于本HPC寡核苷酸的3’-或5’-末端部分。術(shù)語“任意的”核苷酸序列在此處被使用其含意為在不知道被雜交的靶核苷酸的序列的情況下而被選擇的核苷酸序列。
關(guān)于該HPC寡核苷酸的術(shù)語“雜交”指通過堿基配對(duì)在核酸序列和HPC寡核苷酸的部分之間形成雙鏈核酸。如此處使用，“探針”指含有與靶核苷酸基本互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)部分的單鏈核酸分子。
本寡核苷酸的第一雜交部分具有與樣品核酸中的靶核苷酸基本互補(bǔ)的核苷酸序列。關(guān)于寡核苷酸的術(shù)語“基本互補(bǔ)”在此處被使用，其含意為該寡核苷酸在指定雜交條件下充分互補(bǔ)以與靶核酸序列選擇性雜交。因而，該術(shù)語與“完美互補(bǔ)”或其相關(guān)術(shù)語具有不同的含意。應(yīng)該理解的是HPC寡核苷酸的第一雜交部分可以在可以實(shí)現(xiàn)期望的雜交特異性的程度下具有與靶核苷酸的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。關(guān)于雜交的術(shù)語“特異性”指在完全或完美互補(bǔ)的堿基之間所進(jìn)行的雜交的精確性。最優(yōu)選地，本寡核苷酸的第一雜交部分具有與樣品核酸中的靶核苷酸序列完美互補(bǔ)的核苷酸序列，即，沒有錯(cuò)配。
本HPC寡核苷酸的第一雜交部分具有取決于其應(yīng)用和靶核苷酸序列的多樣核苷酸序列。例如，當(dāng)本HPC寡核苷酸被應(yīng)用于鑒定樣品核酸中的靶核苷酸序列的核苷酸變異的方法時(shí)，其第一雜交部分具有包括與核苷酸變異所對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸的核苷酸序列。此外，當(dāng)本HPC寡核苷酸在差異顯示中被使用時(shí)，與來自mRNA的cDNA中的位點(diǎn)基本互補(bǔ)的任意序列由本HPC寡核苷酸的第一雜交部分組成；在保守同源片斷的鑒定中，本HPC寡核苷酸的第一雜交部分具有與基因家族中發(fā)現(xiàn)的共有序列或選自多個(gè)編碼預(yù)定氨基酸序列的核苷酸組合物中的簡(jiǎn)并序列基本互補(bǔ)的核苷酸序列。
含有至少兩個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物的調(diào)控子部分負(fù)責(zé)本HPC寡核苷酸的更高雜交特異性。此處使用的術(shù)語“通用堿基或非識(shí)別堿基類似物”指能夠以微弱差別在它們之間與各天然DNA/RNA堿基形成堿基對(duì)的物質(zhì)。
眾所周知因?yàn)檫@些通用堿基能夠非特異性地與所有四種常規(guī)堿基形成堿基配對(duì)，所以在簡(jiǎn)并寡核苷酸的某些模糊位置的核苷酸已經(jīng)被通用堿基或非識(shí)別堿基類似物取代，如脫氧肌苷(Ohtsuka，E.et al.，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Sakanari，J.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.864863-4867(1989))，1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯(Nichols，R.et al.，Nature 369492-493(1994))和5-硝基吲哚(Loakes，D.and Brown，D.M.Nucleic Acids Res.224039-4043(1994))以用于解決與簡(jiǎn)并寡核苷酸相關(guān)的設(shè)計(jì)問題。然而，一直沒有關(guān)于該通用堿基或非識(shí)別堿基類似物如脫氧肌苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯和5-硝基吲哚被用作能夠控制寡核苷酸的雜交部分的調(diào)控子部分的任何報(bào)道。作為HPC寡核苷酸的獨(dú)特部分，調(diào)控子部分功能上或結(jié)構(gòu)上分隔兩部分。
HPC寡核苷酸中通用堿基如脫氧肌苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯和5-硝基吲哚的出現(xiàn)由于在堿基配對(duì)中其較弱的氫鍵相互作用而產(chǎn)生較低的解鏈溫度。作為該理論的延伸，本發(fā)明人推導(dǎo)出在HPC寡核苷酸的第一和第二雜交部分之間引入通用堿基能夠產(chǎn)生具有較低解鏈溫度的區(qū)域，形成HPC寡核苷酸的各第一和第二雜交部分的界限，并且影響各部分的雜交。該理論提供了本發(fā)明的HPC寡核苷酸的基礎(chǔ)。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本寡核苷酸在第一雜交和第二雜交部分序列之間含有至少3個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物，更優(yōu)選地，含有至少4個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物。有益地，在第一和第二雜交部分序列之間的通用堿基殘基在長(zhǎng)度上可以達(dá)到15個(gè)殘基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本HPC寡核苷酸含有2～15個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物。最優(yōu)選地，在第一和第二雜交部分序列之間的通用堿基約為5個(gè)殘基長(zhǎng)度。
關(guān)于通用堿基的優(yōu)選數(shù)目，即5個(gè)殘基，在本HPC的第一和第二雜交部分之間的通用堿基殘基的最小數(shù)目被優(yōu)選以打斷在一定雜交條件下的第二雜交部分與靶核苷酸序列的雜交。非常可能序列中通用堿基的長(zhǎng)度(8～10個(gè)堿基)在本HPC寡核苷酸中對(duì)其本身功能并沒有顯著差異。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，HPC寡核苷酸的調(diào)控子部分中的通用堿基或非識(shí)別堿基類似物包括脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2’-脫氧肌苷，2-氮雜-2’-脫氧肌苷，2′-OMe肌苷，2′-F肌苷，脫氧3-硝基吡咯，3-硝基吡咯，2′-OMe 3-硝基吡咯，2′-F 3-硝基吡咯，1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯，脫氧5-硝基吲哚，5-硝基吲哚，2′-OMe 5-硝基吲哚，2′-F 5-硝基吲哚，脫氧4-硝基苯并咪唑，4-硝基苯并咪唑，脫氧4-氨基苯并咪唑，4-氨基苯并咪唑，脫氧水粉蕈素，2′-F水粉蕈素，2′-F 4-硝基苯并咪唑，PNA-5-硝基吲哚，PNA-水粉蕈素，PNA-肌苷，PNA-4-硝基苯并咪唑，PNA-3-硝基吡咯，嗎啉-5-硝基吲哚，嗎啉-水粉蕈素，嗎啉-肌苷，嗎啉-4-硝基苯并咪唑，嗎啉-3-硝基吡咯，氨基磷酸酯-5-硝基吲哚，氨基磷酸酯-水粉蕈素，氨基磷酸酯-肌苷，氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑，氨基磷酸酯-3-；硝基吡咯，2′-O-甲氧乙基肌苷，2′-O-甲氧乙基水粉蕈素，2′-O-甲氧乙基5-硝基吲哚，2′-O-甲氧乙基4-硝基苯并咪唑，2′-O-甲氧乙基3-硝基吡咯及其組合物，但并不限于此。更優(yōu)選地，該通用堿基或非識(shí)別堿基類似物為脫氧肌苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚，最優(yōu)選地，為脫氧肌苷。
優(yōu)選地，HPC寡核苷酸的總長(zhǎng)度取決于期望的雜交特異性和需要與靶核酸雜交的核苷酸的數(shù)目。
本HPC寡核苷酸的各部分的長(zhǎng)度可以變化，且部分依賴與使用本HPC寡核苷酸的各應(yīng)用的目的。在優(yōu)選實(shí)施例中，本HPC寡核苷酸的第一雜交部分長(zhǎng)度至少為6個(gè)核苷酸，該長(zhǎng)度是考慮到寡核苷酸雜交的長(zhǎng)度最低要求。更優(yōu)選地，第一雜交部分序列為10～50個(gè)核苷酸并且長(zhǎng)度能夠達(dá)100個(gè)核苷酸。
如上所討論，由于HPC寡核苷酸的第二雜交部分完全排隊(duì)在第一雜交部分與其靶核苷酸序列之間的雜交之外，所以其核苷酸序列的選擇并不受限制。也就是，即使當(dāng)?shù)诙s交部分的核苷酸序列或多或少地與樣品核酸的位點(diǎn)(如與第一雜交部分的靶核苷酸序列毗鄰的位點(diǎn))互補(bǔ)時(shí)，第一雜交部分與其靶核苷酸序列的雜交特異性實(shí)際上并不被降低。這是HPC寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)之一。優(yōu)選地，HPC寡核苷酸的第二雜交部分含有與樣品核酸上任何位點(diǎn)基本不互補(bǔ)的預(yù)先選定的任意核苷酸序列。
當(dāng)HPC寡核苷酸與基質(zhì)如尼龍膜和玻璃結(jié)合時(shí)，第二雜交部分讓第一雜交部分自由地與其靶核苷酸序列雜交，從而提高了第一雜交部分的雜交強(qiáng)度(效率)，這與Saiki和其同事提出的間隔子效應(yīng)一致(Randall K.Saiki，et al.，PNAS USA，866230-6234(1989))。他們證明被用于寡核苷酸的同聚物尾通過增加尼龍膜和加尾的寡核苷酸探針之間的距離而提高雜交效率。因而，第一雜交部分的被提高的雜交強(qiáng)度(效率)使雜交反應(yīng)在包括更高的雜交和清洗溫度的更嚴(yán)格條件下被進(jìn)行，從而第一雜交部分的雜交特異性被大大地提高。此外，第二雜交部分允許對(duì)第一雜交部分和其靶核苷酸序列之間的雜交結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。這種檢驗(yàn)可以僅從第一雜交部分和其靶核苷酸序列之間的雜交獲得可靠的結(jié)果。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本HPC寡核苷酸的第二雜交部分長(zhǎng)度上含有至少15個(gè)核苷酸，該長(zhǎng)度是考慮到雜交長(zhǎng)度的最低要求。優(yōu)選地，第二雜交部分序列長(zhǎng)度可達(dá)100個(gè)核苷酸。更優(yōu)選地，第二雜交部分序列長(zhǎng)度為20～30個(gè)核苷酸。優(yōu)選第二雜交部分比第一雜交部分更長(zhǎng)。
第二雜交部分的預(yù)先選定的任意核苷酸序列可以是任何確定的或預(yù)先選定的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或含有天然或修飾核苷酸的特定序列的混合脫氧核糖核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，本HPC寡核苷酸中的一些修飾可以被進(jìn)行，除非該修飾破壞了HPC寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)，即雜交特異性的提高。這些修飾，即標(biāo)記可以提供用于指示雜交的可檢測(cè)信號(hào)，并且這些修飾可以與HPC寡核苷酸相連接。適合的標(biāo)記包括，但不限于此，熒光團(tuán)，發(fā)色團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑，磁性顆粒，放射性同位素，質(zhì)量標(biāo)記，電子密度顆粒，酶，輔助因子，酶的底物和具有特異性結(jié)合配體的半抗原，如抗體，鏈霉抗生物素蛋白，生物素，地谷新配基和鰲合基團(tuán)。標(biāo)記可以提供通過熒光、放射性、比色法、重量測(cè)定、X-射線折射或吸收、磁性、酶活性、質(zhì)譜、結(jié)合親和性、雜交射頻、 納米晶體等可檢測(cè)的信號(hào)。本發(fā)明的HPC寡核苷酸在5’-末端，3′-末端或在內(nèi)部被標(biāo)記。標(biāo)記可以是直接的，即染料，或間接的，即生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，本HPC寡核苷酸可以被固定到不溶性載體上。不溶性載體的例子包括硝基纖維素或尼龍過濾器，玻璃板，硅樹脂和碳氟化合物支持物。HPC寡核苷酸可以通過許多本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法被固定，例如使用試劑如核苷亞磷酰胺或核苷氫膦酸通過磷酸基團(tuán)的激光活化光去保護(hù)附著(laser-activatedphotodeprotection attachment)。
固定的HPC寡核苷酸可以排列為用于一定應(yīng)用的一個(gè)或多個(gè)陣列。疏水分隔物可以用于分隔HPC寡核苷酸或HPC寡核苷酸的陣列。陣列可以被用于設(shè)計(jì)各種應(yīng)用(如基因定位、部分測(cè)序、用于診斷目的的靶區(qū)域的測(cè)序、mRNA測(cè)序和大規(guī)模測(cè)序)。特定的微陣列可以通過選擇具有區(qū)別序列的各種HPC寡核苷酸在不溶性載體如玻璃板上的組合和排列而被設(shè)計(jì)以用于特定應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，HPC寡核苷酸被應(yīng)用于通過雜交檢測(cè)靶核苷酸序列的存在的方法，即，被用作靶核苷酸序列的特異性探針。更優(yōu)選地，本發(fā)明的寡核苷酸提供了在需要非常高雜交特異性的用于檢測(cè)靶核苷酸序列的存在(即使一個(gè)核苷酸)的方法中的一個(gè)非常有效的工具。
使用HPC寡核苷酸的雜交反應(yīng)可以分別在兩個(gè)獨(dú)立的雜交中被進(jìn)行，即，第一和第二雜交。HPC寡核苷酸的第一雜交部分參與與靶核酸的第一雜交，第二雜交部分參與用于證實(shí)第一雜交部分的雜交結(jié)果的證明的第二雜交。
關(guān)于本發(fā)明的另一方面，提供了用于進(jìn)行雜交的試劑盒，該試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的HPC寡核苷酸或HPC寡核苷酸組。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，該試劑盒進(jìn)一步包括具有與該寡核苷酸的第二雜交部分互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸。此外，本試劑盒進(jìn)一步包括沒有調(diào)控子部分但含有與本寡核苷酸相同的核苷酸序列的寡核苷酸。本試劑盒可以任意地包括雜交所需的試劑如緩沖液。在給定反應(yīng)中所用試劑的優(yōu)選量可以由具有當(dāng)前公開內(nèi)容的教益的熟練技術(shù)人員實(shí)際決定。該試劑盒典型地適用于在單獨(dú)包裝或隔室中容納上述組分。
本HPC寡核苷酸可以被用于各種基于雜交的技術(shù)。證明本寡核苷酸的效果的代表例子是(i)靶核苷酸序列的檢測(cè)；(ii)靶核苷酸序列中核苷酸變異的鑒定；(iii)通過雜交的測(cè)序(Genomics，131378(1992))；(iv)兩個(gè)或多個(gè)核酸樣品之間的核酸水平差異的鑒定(參見U.S.Pat.No.5,143,854)；(v)原位雜交(Young，W.S.，In Situ HybridizationAPractical Approach.New YorkOxford University Press；33-44(1992))；(vi)傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷；及(vii)龐大基因組DNA的基因定位。
一般雜交的應(yīng)用關(guān)于本發(fā)明的再一方面，提供了用于通過雜交檢測(cè)樣品核酸中靶核苷酸序列的存在的方法，其中該方法包括以下步驟(a)在第一寡核苷酸的第一雜交部分與靶核苷酸序列雜交的條件下，使用在其第一雜交部分具有與與其雜交的靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的上述第一HPC寡核苷酸進(jìn)行第一雜交；和(b)通過靶核苷酸序列和第一雜交部分之間的雜交的信號(hào)指示檢測(cè)樣品核酸中與第一寡核苷酸的第一雜交部分基本互補(bǔ)的靶核苷酸序列的存在與否。
由于本方法使用了HPC寡核苷酸，所用這些方法之間的共有說明被省略以避免過度重復(fù)導(dǎo)致該說明書的復(fù)雜性。
根據(jù)本發(fā)明，步驟(a)和(b)組成與靶核苷酸序列雜交的過程，此處被稱為“第一雜交”。因而，樣品核酸中靶核苷酸序列的存在與否可以通過靶核苷酸序列和第一寡核苷酸的特異部分之間的雜交的信號(hào)指示被判定。此處使用的術(shù)語“第一寡核苷酸”指第一雜交中使用的寡核苷酸，該第一寡核苷酸具有與前述HPC寡核苷酸相同的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選第一寡核苷酸而非靶核苷酸序列被固定到上述不溶性載體(基質(zhì))上。優(yōu)選地，步驟(a)中的雜交在比常規(guī)所用條件更嚴(yán)格的條件下被進(jìn)行，這樣導(dǎo)致雜交特異性的提高。
所用第一寡核苷酸的調(diào)控子部分能夠?qū)⒌谝还押塑账崤c靶核苷酸序列的雜交部分限制到第一雜交部分。因而，第一寡核苷酸的調(diào)控子部分在提高第一寡核苷酸的第一雜交部分的雜交特異性方面起關(guān)鍵作用。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，該方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)在第二寡核苷酸與第一寡核苷酸的第二雜交部分序列雜交的條件下，使用具有與與其雜交的步驟(a)所用第一寡核苷酸的第二雜交部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列的第二寡核苷酸進(jìn)行第二雜交；和(d)檢測(cè)第一寡核苷酸的第二雜交部分與第二寡核苷酸之間雜交的信號(hào)指示，因而步驟(b)的信號(hào)的存在或不存在被確認(rèn)僅歸因于靶核苷酸序列和第一寡核苷酸的第一雜交部分之間的雜交。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，步驟(c)和(d)組成證明第一雜交結(jié)果的過程，此處稱為“第二雜交”。此處使用的術(shù)語“第二寡核苷酸”指第二雜交所用的寡核苷酸，該第二寡核苷酸具有與第一寡核苷酸的第二雜交部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列。
在本方法中，適當(dāng)?shù)碾s交條件可以通過優(yōu)化程序被常規(guī)地確定。這種程序通過本領(lǐng)域熟練人員常規(guī)地進(jìn)行以建立實(shí)驗(yàn)室所用的流程。例如，如溫度、組分的濃度、雜交和清洗時(shí)間、緩沖液組分、及它們的pH和離子強(qiáng)度的條件可以隨各種因素如寡核苷酸和靶核苷酸序列的長(zhǎng)度和GC含量而變化。例如，當(dāng)相對(duì)較短的寡核苷酸被使用時(shí)，優(yōu)選采納低嚴(yán)格的條件。雜交的詳細(xì)條件可以在Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；和M.L.M.Anderson，Nucleic AcidHybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)中被發(fā)現(xiàn)。
核苷酸變異的鑒定的應(yīng)用關(guān)于本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于鑒定樣品核酸的靶核苷酸序列中核苷酸變異的方法，其中該方法包括以下步驟(a)在第一寡核苷酸的第一雜交部分與樣品核酸的靶核苷酸序列雜交的條件下，使用在其第一雜交部分具有與與其雜交的樣品核酸的靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的上述第一HPC寡核苷酸進(jìn)行第一雜交，其中各第一寡核苷酸和靶核苷酸序列含有對(duì)應(yīng)核苷酸變異的置疑位置，從而當(dāng)置疑位置被與靶核苷酸序列中其對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)的第一寡核苷酸的核苷酸占據(jù)時(shí)，包括核苷酸變異的第一寡核苷酸被與靶核苷酸序列雜交；(b)通過檢測(cè)靶核苷酸序列和第一寡核苷酸的第一雜交部分之間的雜交的信號(hào)指示而鑒定樣品核酸的靶核苷酸序列中的核苷酸變異。
因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的HPC寡核苷酸的該應(yīng)用根據(jù)用于檢測(cè)靶核苷酸序列存在的本發(fā)明的方法被進(jìn)行，所用它們之間的共有說明被省略以避免過度重復(fù)導(dǎo)致該說明書的復(fù)雜性。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，該方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)在第二寡核苷酸與第一寡核苷酸的第二雜交部分序列雜交的條件下，使用具有與與其雜交的步驟(a)所用第一寡核苷酸的第二雜交部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列的第二寡核苷酸進(jìn)行第二雜交；和(d)檢測(cè)第一寡核苷酸的第二雜交部分與第二寡核苷酸之間的雜交的信號(hào)指示，從而步驟(b)的信號(hào)的存在或不存在被確認(rèn)僅歸因于靶核苷酸序列和第一寡核苷酸的第一雜交部分之間的雜交。
所用樣品核酸可以是通過擴(kuò)增短核苷酸片斷的對(duì)應(yīng)核苷酸序列而制備的包括核苷酸變異的短核苷酸片斷。此外，樣品核酸可以多于一個(gè)靶短核苷酸片斷，通過擴(kuò)增多于一個(gè)短核苷酸片斷的各對(duì)應(yīng)核苷酸序列而制備的各短靶核苷酸片斷包括核苷酸變異。
在優(yōu)選實(shí)施例中，可檢測(cè)的核苷酸變異是單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變。核苷酸變異可以被包含在人核酸或引起傳染性疾病的生物體的核酸中。
步驟(a)所用第一寡核苷酸為等位基因特異性的HPC寡核苷酸，該等位基因特異性HPC寡核苷酸在其第一雜交部分中含有由靶核酸中核苷酸變異所對(duì)應(yīng)的核苷酸的互補(bǔ)核苷酸占據(jù)的置疑位置。優(yōu)選地，該第一寡核苷酸的置疑位置位于其第一雜交部分的中間。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，等位基因特異性HPC寡核苷酸的置疑位置位于3’-末端核苷酸的約10個(gè)堿基內(nèi)。更有利地，等位基因特異性HPC寡核苷酸的置疑位置位于該等位基因特異性HPC寡核苷酸的3’-末端核苷酸的約6個(gè)堿基內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，等位基因特異性HPC寡核苷酸的置疑位置位于從3’-末端核苷酸起位置4和6內(nèi)。最優(yōu)選地，等位基因特異性HPC寡核苷酸的置疑位置位于從3’-末端核苷酸起位置5處。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，步驟(a)所用第一寡核苷酸在其第一雜交部分具有至少一個(gè)與第一寡核苷酸的置疑位置充分鄰近的人為錯(cuò)配核苷酸，其中該錯(cuò)配核苷酸包含通用堿基或非識(shí)別甲基類似物。
優(yōu)選步驟(a)所用HPC寡核苷酸的第一雜交部分長(zhǎng)度上含有至少6個(gè)核苷酸，這是雜交所需的最低長(zhǎng)度要求。更優(yōu)選地，第一雜交部分長(zhǎng)度約為8～30個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，第一雜交部分長(zhǎng)度約為10～15個(gè)核苷酸。
此處所用術(shù)語“置疑位置”指靶核酸內(nèi)感興趣的特定核苷酸堿基的位置。例如，在SNPs的分析中，靶核酸的“置疑位置”指在與野生型不同的位置。置疑位置也包括與靶核酸的置疑位置互補(bǔ)的寡核苷酸的核苷酸序列的位置。當(dāng)寡核苷酸與靶核酸雜交時(shí)，靶核酸的置疑位置與寡核苷酸的置疑位置相對(duì)。
關(guān)于本發(fā)明的再進(jìn)一步的方面，提供了用于鑒定靶核酸的核苷酸變異的試劑盒，該試劑盒包括上述寡核苷酸或寡核苷酸組(包括第一和第二寡核苷酸)。本試劑盒可以任意地包括雜交反應(yīng)所需的試劑如緩沖液。在給定反應(yīng)中所用試劑的優(yōu)選量可以由具有當(dāng)前公開內(nèi)容的教益的熟練技術(shù)人員決定。該試劑盒典型地適合在獨(dú)立包裝或隔室容納前述組分。
以下具體實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不應(yīng)該理解為限制附加權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例以下試驗(yàn)公開內(nèi)容中，以下縮寫被使用M(摩爾濃度)，mM(毫摩爾濃度)，μM(微摩爾濃度)，g(克)，μg(微克)，ng(納克)，1(升)，ml(毫升)，μl(微升)，℃(攝氏度)，Promega(Promega Co.，Madison，美國(guó))，Roche(Roche Diagnostics，Mannheim，德國(guó))，QIAGEN(QIAGEN GmbH，Hilden，德國(guó))，Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories，Hercules，美國(guó))，AppliedBiosystems(Foster City，CA，美國(guó))，Amersham(Amersham PhamaciaBiotech，Piscataway，美國(guó))，和Stratagene(Stratagene，La Jolla，美國(guó))。
實(shí)施例中所用寡核苷酸序列如表1所示。
實(shí)施例1HPC寡核苷酸中的通用堿基對(duì)雜交特異性的影響HPC寡核苷酸的3’-和5’-末端部分之間的通用堿基殘基如脫氧肌苷的影響使用三種不同類型的各具有等位基因特異性10-mer的寡核苷酸通過SNP基因型分析被評(píng)定，其中三種不同類型的寡核苷酸包括常規(guī)短和長(zhǎng)寡核苷酸和HPC寡核苷酸。
A.寡核苷酸的合成實(shí)施例1所用具有如表1所示序列的寡核苷酸通過DNA合成儀(Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System，Applied Biosystems(ABI))方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程被合成。在HPC寡核苷酸中，脫氧肌苷使用脫氧肌苷CE磷酸亞酰胺(ABI)被引入。寡核苷酸通過OPC濾筒(cartridge)(ABI)的方法被純化，并且它們的濃度在260nm處通過UV分光光度儀被測(cè)定。在以下所述HPC寡核苷酸中，“I”表示脫氧肌苷。
用于檢測(cè)TP53基因的外顯子4中的SNP的等位基因特異性常規(guī)短寡核苷酸如下P53NA 5’-TCCCCGCGTG-3’(序列編號(hào)1)和P53NB 5’-TCCCCCCGTG-3’(序列編號(hào)2)。
用于檢測(cè)TP53基因的外顯子4中的SNP的等位基因特異性常規(guī)長(zhǎng)寡核苷酸如下P53NA-JYC7 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCTCCCCGCGTG-3’(序列編號(hào)3)和P53NB-JYC7 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCTCCCCCCGTG-3’(序列編號(hào)4)。
用于檢測(cè)TP53基因的外顯子4中的SNP的等位基因特異性HPC寡核苷酸如下P53NA-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCIIIIITCCCCGCGTG-3’(序列編號(hào)5)和
P53NB-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCIIIIITCCCCCCGTG-3’(序列編號(hào)6)。
多態(tài)性堿基被加下劃線，并且多態(tài)性堿基的位置被認(rèn)為是置疑位置。置疑位置位于等位基因特異性核苷酸序列的中心位置。
等位基因特異性常規(guī)長(zhǎng)和HPC寡核苷酸的5’-末端部分為含有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的第二雜交部分，且用作第二雜交的通用探測(cè)位點(diǎn)。第二雜交部分序列為JYC7 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGC-3’(序列編號(hào)7)。與等位基因特異性常規(guī)長(zhǎng)和HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列為JYC7R 5’-GCAAAGCGAATGCCTGGTAGAC-3’(序列編號(hào)8)。
B.寡核苷酸的固定各常規(guī)短和長(zhǎng)寡核苷酸和HPC寡核苷酸根據(jù)以下方法被固定到尼龍膜上。寡核苷酸(6μl 100μM)通過使用斑點(diǎn)雜交設(shè)備(Bio-Rad)或移液管被點(diǎn)到Hybond-N+膜上(Amersham Pharmacia Biotech)。所得膜被干燥然后通過使用優(yōu)化的UV交聯(lián)程序被固定。
C.DNA樣品制備含有人p53(TP53)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的區(qū)域(Matlashewski et al.，1987；Lamb and Crawford，1986)使用常規(guī)引物體系或退火控制引物體系被擴(kuò)增。退火控制引物已由本發(fā)明人研制，并在PCT/KR02/01781中被公開。DNA模板從具有TP53基因的外顯子4中的SNP(Joseph Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))的人血液樣品中被獲得。該多態(tài)性通過由C代替G表現(xiàn)為在氨基酸72位置處Arg→Pro的替代。在TP53基因的核苷酸11991和12339之間的349個(gè)核苷酸的序列以一組以下引物從突變型純合體模板被擴(kuò)增P53N-ACP5’-TATGAATGCTGTGACGCCGAIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’(序列編號(hào)9)和P53C-ACP5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’(序列編號(hào)10)。
擴(kuò)增反應(yīng)混合物的終體積為49.5μl，其中包括含有TP53基因的外顯子4中的SNP的50ng基因組DNA，5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液(Promega)，5μl 25mM MgCl2，5μl dNTP(各2mM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，1μl P53N-ACP引物(10μM)和1μl P53C-ACP引物(10μM)，反應(yīng)混合物在94℃下預(yù)熱，在保持含有反應(yīng)混合物的試管的溫度為94℃的同時(shí)，0.5μl Taq聚合酶(5units/μl，Promega)被加入到反應(yīng)混合物中，然后PCR反應(yīng)進(jìn)行如下94℃40sec，65℃40sec，然后72℃40sec，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；接著72℃最后延伸5min。含有SNP側(cè)翼區(qū)域(flanking region)的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Qiagen(Chatsworth，CA)PCR純化試劑盒被純化。
D.樣品DNA或寡核苷酸的標(biāo)記擴(kuò)增的靶基因組DNA片斷如本領(lǐng)域中所知的(Multipleprime DNAlabeling systems booklet，“Amersham”，1989)使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Random Prime DNA LabelingKit)(Roche)用[α-32P]dCTP(3,000Ci/mmol，AmershamPhamaciaBiotech)標(biāo)記。與常規(guī)長(zhǎng)和HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸，JYC7R，如本領(lǐng)域已知的(Maxam & Gilbert，Methodsin Enzymology，65499-560(1986))用[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol，Amersham Phamacia Biotech)和T4多核苷酸進(jìn)行末端標(biāo)記。
E.雜交反應(yīng)(a)第一雜交第一雜交使用常規(guī)和HPC寡核苷酸被固定于其上的上述膜過濾器和放射性標(biāo)記的基因組DNA片斷在10ml快速雜交溶液中(Quickhybridization solution)(Stratagene)在40℃～50℃進(jìn)行1～4小時(shí)。雜交反應(yīng)完成后，雜合體用2×SSC和0.1％SDS緩沖溶液在室溫下洗3～5次，持續(xù)1～10分鐘，然后在空氣中干燥。膜用Fuji增感屏在-80℃下被曝光于Kodak X-Omat XK-1膠片上。隨后，各斑點(diǎn)的放射劑量通過放射自顯影被測(cè)定以估測(cè)雜交的強(qiáng)度(圖1B)。
(b)第二雜交用于第一雜交的所得膜過濾器無須剝離去除第一雜交所用的第一探針而被再用于第二雜交中。第二雜交使用第一被雜交的過濾器和含有與常規(guī)的和HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的核苷酸序列的放射性標(biāo)記寡核苷酸，JYC7R，于10ml快速雜交溶液中(Quickhybridization solution)(Stratagene)在50℃～65℃下進(jìn)行1～4小時(shí)。雜交完成后，雜合體用2×SSC和0.1％SDS緩沖溶液在50℃～65℃洗3次10分鐘～1小時(shí)，然后在空氣中干燥。膜用Fuji增感屏在-80℃下被曝光于Kodak X-Omat XK-1膠片上。隨后，各斑點(diǎn)的放射劑量通過放射自顯影被測(cè)定以估測(cè)雜交的強(qiáng)度(圖1C)。
圖1A說明常規(guī)的和HPC寡核苷酸在各膜上被等量上樣。泳道1和2分別表示用于野生型[P53NA(序列編號(hào)1)，P53NA-JYC7(序列編號(hào)3)，和P53NA-HPC(序列編號(hào)5)]和突變型[P53NB(序列編號(hào)2)，P53NB-JYC7(序列編號(hào)4)，和P53NB-HPC(序列編號(hào)6)]的等位基因特異性常規(guī)或HPC寡核苷酸。
圖1B顯示從步驟C所得突變型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。在第一雜交條件下，對(duì)于常規(guī)短寡核苷酸沒有信號(hào)被檢測(cè)到。含有突變型基因型的突變型基因組DNA片斷與野生型(泳道1)和突變型(泳道2)等位基因特異性常規(guī)長(zhǎng)寡核苷酸雜交。相反，含有突變型基因型的突變型基因組DNA片斷與突變型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道2)雜交，但不與野生型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道1)雜交。
從這些結(jié)果中，常規(guī)短寡核苷酸在如此高嚴(yán)格的條件下甚至不能形成雜交體，反之，常規(guī)長(zhǎng)和HPC寡核苷酸在此條件下能夠形成雜交體，這意味著附加序列如第二雜交部分序列增加了它們的第一雜交部分的雜交強(qiáng)度(效率)。然而，因?yàn)榈诙s交部分序列可以部分地參與第一雜交，所以常規(guī)長(zhǎng)寡核苷酸的第一雜交部分不能敏感到足以區(qū)分一個(gè)堿基的核苷酸錯(cuò)配。另一方面，更清楚的是，在相對(duì)高嚴(yán)格條件的第一雜交條件下，形成第一和第二雜交部分之間界限的通用堿基殘基基團(tuán)的存在將雜交部分限制到第一雜交部分，因而第二雜交部分可以完全地排除在雜交反應(yīng)外，這樣第一雜交部分與其靶核苷酸序列特異性地雜交。
圖1C顯示使用含有與HPC和常規(guī)長(zhǎng)寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的核苷酸序列的放射性標(biāo)記寡核苷酸，JYC7R，的第二雜交結(jié)果。
該結(jié)果說明各斑點(diǎn)具有幾乎相等的放射性。等量放射性說明任何人為因素，如上樣、固定和優(yōu)化雜交條件的建立的失敗，并沒有影響第一雜交，并且也說明等位基因特異性HPC寡核苷酸作為第一雜交的探針在各試驗(yàn)中良好地工作，因而第二雜交證實(shí)了第一雜交的結(jié)果。
實(shí)施例2使用HPC寡核苷酸的SNP基因型定型為了證明HPC寡核苷酸對(duì)于單核苷酸多態(tài)性基因型定型的應(yīng)用，HPC寡核苷酸基因被用于人p53(TP53)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
用于檢測(cè)TP53基因的外顯子4中的SNP的等位基因特異性HPC寡核苷酸如下P53N1A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCGCGTGG-3’(序列編號(hào)11)，
P53N1B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCCCGTGG-3’(序列編號(hào)12)，P53N2A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCGCGTG-3’(序列編號(hào)13)，P53N2B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCCCGTG-3’(序列編號(hào)14)，P53N3A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCGCGT-3’(序列編號(hào)15)，P53N3B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCCCGT-3’(序列編號(hào)16)，P53N4A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCGCG-3’(序列編號(hào)17)，
P53N4B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCCCG-3’(序列編號(hào)18)，P53N5A-HPC 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCG-3’(序列編號(hào)19)，和P53N5B-HPC 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCC-3’(序列編號(hào)20)。
在上述HPC寡核苷酸中，“I”表示脫氧肌苷。在各等位基因特異性HPC寡核苷酸的第一雜交(3’-末端)部分的多態(tài)性堿基被加下劃線，并且多態(tài)性堿基的位置被認(rèn)為是置疑位置。置疑位置位于從等位基因特異性HPC寡核苷酸的3’-末端起的幾個(gè)不同位置以判斷檢測(cè)SNP的雜交特異性中最關(guān)鍵的位置。
等位基因特異性HPC寡核苷酸的5’-末端部分為含有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的第二雜交部分，并且用作第二雜交的通用探測(cè)位點(diǎn)。
第二雜交部分序列為JYC4 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’JYC2(序列編號(hào)21)。
與等位基因特異性HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列為JYC4R 5’-ATGAAGCGAATGCCTGGTAGTC-3’(序列編號(hào)22)。
等位基因特異性HPC寡核苷酸如實(shí)施例1所述被固定到尼龍膜上。含有人p53(TP53)基因的外顯子4中的SNP的區(qū)域(Matlashewski et al.，1987；Lamb and Crawford，1986)如實(shí)施例1所述用實(shí)施例1中步驟C所用相同引物被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的靶基因組DNA片斷如實(shí)施例1所述用[α-32P]dCTP(3,000Ci/mmol，Amersham Phamacia Biotech)被標(biāo)記。與等位基因特異性HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的寡核苷酸，JYC4R，如實(shí)施例1所述用[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol，Amersham Phamacia Biotech)和T4多核苷酸被末端標(biāo)記。如實(shí)施例1所述第一和第二雜交被進(jìn)行。各點(diǎn)的放射劑量通過放射性自顯影被測(cè)定以估測(cè)雜交的強(qiáng)度(圖2-4)。
圖2B顯示野生型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。含有野生型基因型的野生型基因組DNA片斷與野生型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道1)雜交，但既不與突變型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道2)也不與陰性對(duì)照HPC寡核苷酸(泳道3)雜交。此外，圖2C顯示使用含有與等位基因特異性HPC寡核苷酸的第二雜交部分序列互補(bǔ)的核苷酸序列的放射性標(biāo)記寡核苷酸，JYC4R，進(jìn)行第二雜交的結(jié)果。該結(jié)果顯示各斑點(diǎn)具有幾乎相等的放射性。等量放射性說明任何人為因素，如點(diǎn)樣、固定和優(yōu)化雜交條件的建立的失敗，沒有影響第一雜交，并且也說明等位基因特異性HPC寡核苷酸作為第一雜交的探針在各試驗(yàn)中良好地工作，因而第二雜交證實(shí)了第一雜交的結(jié)果。因此，這些結(jié)果證明等位基因特異性HPC寡核苷酸是高度敏感的足以檢測(cè)出甚至單堿基的錯(cuò)配。
圖3B顯示突變型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。與圖2相對(duì)照，含有突變型基因型的突變型基因組DNA片斷與突變型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道2)雜交但不與野生型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道1)雜交。
圖4B顯示雜合型基因組DNA片斷的第一雜交的結(jié)果。含有雜合型基因型的雜合型基因組DNA片斷與野生型(泳道1)和突變型等位基因特異性HPC寡核苷酸(泳道2)都雜交。
圖3C和4C分別顯示用于驗(yàn)證突變型和雜合型基因型定型的第一雜交的結(jié)果的第二雜交的結(jié)果。這些結(jié)果與圖2C的結(jié)果相同。
此外，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)任换蛱禺愋訦PC寡核苷酸在第一雜交部分序列的中心具有置疑位置時(shí)，雜交特異性被最成功地實(shí)現(xiàn)。
考慮到這些結(jié)果，本主題發(fā)明的HPC寡核苷酸使我們能夠在具有如單核苷酸的微小差異的靶序列之間區(qū)分，而無須調(diào)整核苷酸探針的長(zhǎng)度、位置和鏈特異性，或者改變用于膜的量，從而使用HPC寡核苷酸的SNP基因型分析以簡(jiǎn)便、節(jié)約和可靠的方式被實(shí)現(xiàn)。此外，也預(yù)料到當(dāng)使用HPC寡核苷酸實(shí)現(xiàn)多SNP基因型定型時(shí)，速度和效率都會(huì)被大幅度地提高。
表1序列編號(hào) 名稱序列信息
1P53NA 5’-TCCCCGCGTG-3’2P53NB 5’-TCCCCCCGTG-3’3P53NA-JYC75’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCTCCCCGCGTG-3’4P53NB-JYC75’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCTCCCCCCGTG-3’5P53NA-HPC 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCIIIIITCCCCGCGTG-3’6P53NB-HPC 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGCIIIIITCCCCCCGTG-3’7JYC7 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTTGC-3’8JYC7R 5’-GCAAAGCGAATGCCTGGTAGAC-3’9P53N-ACP 5’-TATGAATGCTGTGACGCCGAIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3’10 P53C-ACP 5’-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’11 P53N1A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCGCGTGG-3’12 P53N1B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCCCGTGG-3’13 P53N2A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCGCGTG-3’
14P53N2B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCCCGTG-3’15P53N3A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCGCGT-3’16P53N3B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCCCGT-3’17P53N4A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCGCG-3’18P53N4B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCCCG-3’19P53N5A-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCG-3’20P53N5B-HPC5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCC-3’21JYC4 5’-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3’22JYC4R 5’-ATGAAGCGAATGCCTGGTAGTC-3’I為脫氧肌苷參考文獻(xiàn)Azhikina，T.，Veselovskaya，S.，Myasnikov，V，Emolayeva，O.，Sverdlov，E.(1993)Strings of contiguous modified pentanucleotides withincreased DNA-binding affinity can be used for DNA sequencing by primerwalking.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90，11460-11462.
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序列表<110>視基因公司(SEEGENE，INC)<120>雜交部分控制寡核苷酸及其應(yīng)用<150>PCT/KR01/02133<151>2001-12-08<150>PCT/KR02/00816<151>2002-05-01<160>22<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53NA，單鏈，線形<400>1tccccgcgtg 10<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53NB，單鏈，線形<400>2
tccccccgtg 10<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53NA-JYC7，單鏈，線形<400>3gtctaccagg cattcgctttgctccccgcg TG32<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53NB-JYC7，單鏈，線形<400>4gtctaccagg cattcgctttgctccccccg tg 32<210>5<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene
<223>P53NA-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>5gtctaccagg cattcgcttt gciiiiitcc ccgcgtg 37<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53NB-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>6gtctaccaggcattcgctttgciiiiitccccccgtg 37<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>JYC7，單鏈，線形<400>7gtctaccagg cattcgcttt gc22<210>8<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>gene<223>JYC7R，單鏈，線形<400>8gcaaagcgaatgcctggtagac 22<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N-ACP，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>9tatgaatgct gtgacgccga iiiiicctct gactgctctt ttcac 45<210>10<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53C-ACP，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>10tcacagaagt atgccaagcg aiiiiiattg aagtctcatg gaagcc46
<210>11<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>p53N1A-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>11gtctaccagg cattcgcttc atiiiiiccc cgcgtgg37<210>12<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N1B-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>12gtctaccagg cattcgcttc atiiiiiccc cccgtgg37<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N2A-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)
<400>13gtctaccagg cattcgcttc atiiiiitccc cgcgtg36<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N2B-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>14gtctaccagg cattcgcttc atiiiiitccc cccgtg 36<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N3A-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>15gtctaccagg cattcgcttc atiiiiictc cccgcgt 37<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene
<223>P53N3B-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>16gtctaccagg cattcgcttc atiiiiictc cccccgt 37<210>17<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N4A-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>17gtctaccagg cattcgcttc atiiiiigct ccccgcg 37<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N4B-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>18gtctaccagg cattcgcttc atiiiiigct ccccccg 37<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>gene<223>P53N5A-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>19gtctaccagg cattcgcttc atiiiiigct ccccg 35<210>20<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>P53N5B-HPC，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>20gtctaccagg cattcgcttc atiiiiigct ccccc 35<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>JYC4，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>21gtctaccagg cattcgcttc at22<210>22<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<223>JYC4R，單鏈，線形，i＝脫氧肌苷(dI)<400>22atgaagcgaa tgcctggtag tc 2權(quán)利要求
1.用于通過雜交進(jìn)行樣品核酸中的靶核苷酸序列分析的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下通式結(jié)構(gòu)5’-Xp-Yq-Zr-3’或5’-Zr-Yq-Xp-3’其中Xp表示具有與與其雜交的所述樣品核酸中的所述靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的第一雜交部分；Yq表示含有至少兩個(gè)通用堿基或非識(shí)別堿基類似物的調(diào)控子部分；Zr表示具有預(yù)先選定的任意核苷酸序列的第二雜交部分；p、q和r表示核苷酸的數(shù)目；X、Y和Z為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，該寡核苷酸參與作為第一和第二雜交的兩個(gè)獨(dú)立的雜交，其中所述第一雜交部分被用作第一雜交的特異性雜交位點(diǎn)，所述第二雜交部分被用作第二雜交的通用雜交位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述調(diào)控子部分能夠控制所述寡核苷酸的雜交部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述通用堿基或非識(shí)別堿基類似物能夠與各天然DNA/RNA堿基以所述天然DNA/RNA堿基之間的微小差異形成堿基對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的寡核苷酸，其中所述通用堿基或非識(shí)別堿基類似物選自以下物質(zhì)組成的組脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2’-脫氧肌苷，2-氮雜-2’-脫氧肌苷，2′-OMe肌苷，2′-F肌苷，脫氧3-硝基吡咯，3-硝基吡咯，2′-OMe3-硝基吡咯，2′-F3-硝基吡咯，1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯，脫氧5-硝基吲哚，5-硝基吲哚，2′-OMe5-硝基吲哚，2′-F5-硝基吲哚，脫氧4-硝基苯并咪唑，4-硝基苯并咪唑，脫氧4-氨基苯并咪唑，4-氨基苯并咪唑，脫氧水粉蕈素，2′-F水粉蕈素，2′-F4-硝基苯并咪唑，PNA-5-硝基吲哚，PNA-水粉蕈素，PNA-肌苷，PNA-4-硝基苯并咪唑，PNA-3-硝基吡咯，嗎啉-5-硝基吲哚，嗎啉-水粉蕈素，嗎啉-肌苷，嗎啉-4-硝基苯并咪唑，嗎啉-3-硝基吡咯，氨基磷酸酯-5-硝基吲哚，氨基磷酸酯-水粉蕈素，氨基磷酸酯-肌苷，氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑，氨基磷酸酯-3-硝基吡咯，2′-O-甲氧乙基肌苷，2′-O-甲氧乙基水粉蕈素，2′-O-甲氧乙基5-硝基吲哚，2′-O-甲氧乙基4-硝基-苯并咪唑，2′-O-甲氧乙基3-硝基吡咯及其組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的寡核苷酸，其中所述通用堿基或非識(shí)別堿基類似物為脫氧肌苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖苷)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述調(diào)控子部分含有毗鄰的通用堿基或非識(shí)別堿基類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述脫氧核糖核苷酸為天然形成的dNMP、修飾的核苷酸和非天然的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中p表示6～100的整數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中q至少為3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的寡核苷酸，其中q至少為4。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的寡核苷酸，其中q表示2～15的整數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中r表示15～100的整數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中第二雜交部分具有與所述樣品核酸上任何位點(diǎn)基本不互補(bǔ)的預(yù)先選定的任意核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的寡核苷酸，該寡核苷酸被固定到不溶性載體上。
16.用于進(jìn)行雜交的試劑盒，其中所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求1～15任意一項(xiàng)的寡核苷酸。
17.用于通過雜交檢測(cè)樣品核酸中靶核苷酸序列的存在的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使用根據(jù)權(quán)利要求1～15中任意一項(xiàng)的在其第一雜交部分具有與與其雜交的所述靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的第一寡核苷酸，在所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分與所述靶核苷酸序列雜交的條件下進(jìn)行第一雜交；和(b)通過所述靶核苷酸序列和所述第一雜交部分之間的雜交的信號(hào)顯示，檢測(cè)在所述樣品核酸中與所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分基本互補(bǔ)的所述靶核苷酸序列的存在與否。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)使用具有與與其雜交的步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述第二雜交部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列的第二寡核苷酸，在所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸的所述第二雜交部分雜交的條件下進(jìn)行第二雜交；和(d)檢測(cè)所述第一寡核苷酸的第二雜交部分與所述第二寡核苷酸之間的雜交的信號(hào)顯示，從而步驟(b)的所述信號(hào)的存在或不存在被確認(rèn)僅歸因于所述靶核苷酸序列和所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分之間的雜交。
19.用于鑒定樣品核酸的靶核苷酸序列中的核苷酸變異的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使用權(quán)利要求1～15中任意一項(xiàng)的在其第一雜交部分具有與與其雜交的所述樣品核酸中所述靶核苷酸序列基本互補(bǔ)的特異性雜交核苷酸序列的第一寡核苷酸，在所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分與所述樣品核酸的所述靶核苷酸序列雜交的條件下進(jìn)行第一雜交，其中各所述第一寡核苷酸和所述靶核苷酸序列含有對(duì)應(yīng)于所述核苷酸變異的置疑位置，從而當(dāng)所述置疑位置被與所述靶核苷酸序列中的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)的所述第一寡核苷酸的核苷酸占據(jù)時(shí)，所述包括所述核苷酸變異的第一寡核苷酸被與所述靶核苷酸序列雜交；和(b)通過檢測(cè)所述靶核苷酸序列和所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分之間的雜交的信號(hào)顯示而鑒定所述樣品核酸的所述靶核苷酸序列中的所述核苷酸變異。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中該方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)在所述第二寡核苷酸與所述第一寡核苷酸的所述第二雜交部分序列雜交的條件下，使用具有與與其雜交的步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述第二雜交部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列的第二寡核苷酸進(jìn)行第二雜交；和(d)檢測(cè)所述第一寡核苷酸的所述第二雜交部分與所述第二寡核苷酸之間的雜交的信號(hào)顯示，從而步驟(b)的所述信號(hào)的存在或不存在被確認(rèn)僅歸因于所述靶核苷酸序列和所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分之間的雜交。
21.根據(jù)權(quán)利要求17或19的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述調(diào)控子部分能夠?qū)⑺龅谝还押塑账崤c所述靶核苷酸序列雜交的部分限制到所述第一雜交部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求17或19的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述調(diào)控子部分負(fù)責(zé)提高所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分的雜交特異性。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述樣品核酸為通過擴(kuò)增所述短核苷酸片斷的對(duì)應(yīng)核苷酸序列而制備的包括核苷酸變異的短核苷酸片斷。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述樣品核酸為通過擴(kuò)增多于一個(gè)短核苷酸片斷的各對(duì)應(yīng)核苷酸序列而制備的各包括核苷酸變異的多于一個(gè)靶短核苷酸片斷。
25.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述核苷酸變異為單核苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變。
26.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中人核酸包括所述核苷酸變異。
27.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中導(dǎo)致傳染病的生物體的核酸包括所述核苷酸變異。
28.根據(jù)權(quán)利19的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分包括由與對(duì)應(yīng)于核苷酸變異的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸占據(jù)的置疑位置。
29.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述置疑位置位于其第一雜交部分的中心。
30.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分長(zhǎng)度為8～30個(gè)核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述第一雜交部分長(zhǎng)度為10～15個(gè)核苷酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述置疑位置位于所述第一寡核苷酸的3’-末端核苷酸的約10個(gè)堿基內(nèi)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述置疑位置位于所述第一寡核苷酸的3’-末端核苷酸的約6個(gè)堿基內(nèi)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸的所述置疑位置位于所述第一寡核苷酸的3’-末端核苷酸起4和6位內(nèi)。
35.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)所用所述第一寡核苷酸在其第一雜交部分具有至少一個(gè)與所述第一寡核苷酸的所述置疑位置基本毗鄰的人為錯(cuò)配核苷酸，其中所述錯(cuò)配核苷酸包括通用堿基或非識(shí)別堿基類似物。
36.用于鑒定樣品核酸的靶核酸中核苷酸變異的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求19～37中任意一項(xiàng)所指示的寡核苷酸或寡核苷酸組。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過雜交進(jìn)行靶核苷酸序列分析的寡核苷酸及該寡核苷酸的應(yīng)用。該寡核苷酸具有以下通式結(jié)構(gòu)。5′－X
文檔編號(hào)C12N15/11GK1602361SQ02824501
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月8日
發(fā)明者千鐘潤(rùn) 申請(qǐng)人:視基因公司