專利名稱：用體內系統(tǒng)驗證或識別靶的多元方法
背景技術：
目前在大量體外檢測中所使用的高處理量篩選方法的局限之處在于其只能得到基因功能和藥物靶命中(hit)的初步結果。這些結果都是間接的，常常無法發(fā)現與特定疾病獨有的組織和細胞相互作用有關的靶。例如，利用疾病組織，或是新近發(fā)展的利用疾病發(fā)展不同階段的組織相對于正?；蚪】到M織的基因功能分析，可以揭示出與疾病形成和疾病發(fā)展有關的基因功能，即識別出引發(fā)疾病的基因。這樣的信息與診斷和預防性藥物最為相關，但是在對治療有用的功能上卻顯得信息量不足，因為這些功能常常與導致疾病的那些功能不同。
體內研究的特性將這樣的用途局限于確定靶命中的“真值”。不幸地是，即使是為了這一有限的目的，可靠數據的獲得仍然是非常有限的。盡管如此，從體內研究得到的數據還是最精確或者說是真實地驗證了藥物靶。一旦靶真正被驗證了，那么傳統(tǒng)的藥物發(fā)現技術就成為更有效的藥物生產的一種備選方法。因此迫切需要有效地利用體內系統(tǒng)來達到靶發(fā)現驗證的目的，從而克服體外技術的缺點。
發(fā)明概述本發(fā)明將基因或藥物，或基因和藥物的組合直接遞送到體內系統(tǒng)中，或者以其它方式控制體內系統(tǒng)以得到至少兩種與治療所期望(desired by a treatment)的不同的體內狀態(tài)，而不需要進行體外篩選。對這些不同體內狀態(tài)的途徑分析(pathway analysis)用于識別與系統(tǒng)提供的生物條件或過程相關的基因和蛋白質。最后，這些被識別的基因和蛋白快速地被驗證以控制生物條件和過程，方法是將基因或多核苷酸抑制劑遞送到體內系統(tǒng)中以表達基因或蛋白并觀察其控制效果。這種可定量(scalable)方法可用于獲得驗證過的藥物靶命中。一個靶命中就可以支持多種治療性干預模式，例如傳統(tǒng)的小分子藥物發(fā)現、傳統(tǒng)的生物技術蛋白藥物開發(fā)、抗體藥物開發(fā)、以及基因表達治療。
本發(fā)明提供了生物途徑發(fā)展(evolution)過程中涉及到的候選靶的發(fā)現方法，包括下述步驟將具有已知的或推測的功能的一種或幾種靶引入體內系統(tǒng)；使體內系統(tǒng)起作用，以使生物途徑至少有部分發(fā)展；對得自該體內系統(tǒng)的生物樣品進行選自下組的兩項或更多項分析病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學分析，其中這些分析可以揭示生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一個或多個候選靶。該方法也可以包括將一個或多個揭示的候選靶引入體內系統(tǒng)；使體內系統(tǒng)起作用；對得自該系統(tǒng)的生物樣品進行前述分析步驟，以識別生物途徑發(fā)展過程中涉及到的更多的靶。
本發(fā)明還提供了生物途徑發(fā)展過程中涉及到的候選靶的驗證方法，包括下述步驟將源自候選靶序列的多核苷酸引入第一體內系統(tǒng)；使第一體內系統(tǒng)起作用，以使該生物途徑至少有部分發(fā)展；對生物樣品進行選自下組的兩項或更多項分析病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學分析，通過這些分析可以獲得有用的數據；將這些有用的數據與得自對照的體內模型的數據相比較，通過比較可以揭示該生物途徑發(fā)展中是否涉及到該多核苷酸和候選靶。
除此之外，本發(fā)明還提供了用這些方法或者本文所描述的其它方法識別的靶。
更特別地，本發(fā)明提供了生物途徑發(fā)展過程中涉及到的候選靶的發(fā)現方法，包括(a)將具有已知的或推測的功能的一種或幾種靶引入體內系統(tǒng)；(b)使該體內系統(tǒng)起作用，以使該生物途徑至少有部分發(fā)展；(c)對得自該體內系統(tǒng)的生物樣品進行選自下組的兩項或更多項分析病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學分析，其中這些分析可以揭示該生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一個或多個候選靶。該方法還可以進一步包括(d)將一個或多個揭示的候選靶引入體內系統(tǒng)；(e)重復步驟(b)和(c)以識別該生物途徑發(fā)展過程中涉及的更多的靶。步驟(e)可任選地進一步包括將具有已知的或推測的功能的一種或幾種靶引入體內系統(tǒng)。步驟(e)也可以揭示該生物途徑的進一步發(fā)展中涉及到的更多的候選靶。步驟(e)還可以包括對樣品進行選自下組的三項、四項或五項或更多項分析病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學分析，其中這些分析可以揭示該生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一個或多個候選靶。
所述方法可任選地進一步包括(f)將更多的候選靶引入體內系統(tǒng)；(g)重復步驟(b)和(c)以識別該生物途徑的更進一步的發(fā)展過程中涉及的更多的靶。
在一個實施方案中，已知靶和候選靶可以是基因。在另一個實施方案中，已知靶可以通過載體系統(tǒng)引入體內系統(tǒng)。所述體內系統(tǒng)可以是哺乳動物系統(tǒng)。
在另一個實施方案中，步驟(a)可以進一步包括將選自藥物和細菌毒素的藥劑引入體內系統(tǒng)。
在另一個實施方案中，提供了生物途徑發(fā)展過程中涉及到的候選靶的驗證方法，包括(a)將一個DNA序列引入第一體內系統(tǒng)；(b)使第一體內系統(tǒng)起作用，以使該生物途徑至少有部分發(fā)展；(c)對生物樣品進行選自下組的兩項或更多項分析病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學分析，通過這些分析可以獲得有用的數據；(d)將這些有用的數據與得自對照的體內模型的數據相比較，通過比較可以揭示該生物途徑發(fā)展中是否涉及到該DNA序列。
本發(fā)明還提供了由上述方法識別的靶。
附圖簡述

圖1是使用本發(fā)明的方法驗證靶的示意圖。
圖2是使用本發(fā)明的方法發(fā)現一個或多個靶的示意圖。
圖3顯示了用表達質粒DNA處理的腫瘤的生長曲線。該檢測可以根據其單獨促進腫瘤生長或抑制腫瘤生長或不顯著影響腫瘤生長的能力鑒別候選藥物靶。所有的表達構建體都包括一個CMV啟動子和相應的轉化基因。通過測序和細胞培養(yǎng)對構建體進行驗證。每個基因靶都直接注射到3只小鼠的6個腫瘤中去。
圖4顯示了用表達質粒DNA處理的腫瘤的生長曲線。
圖5概括描述了實施例4中進行的微陣列分析。
圖6列出了用本發(fā)明的方法識別的已知靶。
圖7概括描述了用本發(fā)明的方法識別的新靶。
圖8概括描述了用本發(fā)明的方法識別的靶的類型。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的驗證或識別任何給定生物過程或途徑中涉及到的靶的多元(multi-disciplinary)方法。所述方法包括控制體內系統(tǒng)，以得到至少兩種治療所期望的不同過程或不同條件的體內狀態(tài)，然后對得自體內系統(tǒng)的病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息學數據進行組合分析。對體內系統(tǒng)的控制可以通過幾種方法實現，包括1)向體內系統(tǒng)引入一種已知靶的基因以表達該靶蛋白，2)向體內系統(tǒng)引入一種已知蛋白靶，3)向體內系統(tǒng)引入一種藥物，4)改變體內系統(tǒng)的環(huán)境條件，5)上述的組合，這樣可以獲得它們對體內系統(tǒng)的藥理學效果。這種分析可以提供與該藥理學效果相關的基因和蛋白。所述分析還可以提供信息，以進一步選擇一個分子或靶引入體內系統(tǒng)，再進行下一輪病理、藥理、生物檢測、微陣列和生物信息學數據的分析。這種重復進行的方法為特定靶的有效性和可用性提供了一種嚴格的評估方法。本發(fā)明可以用于許多方面。
在需要驗證待測靶(例如藥物干涉的靶)的時候，本發(fā)明可將未知功能或具有推測功能的靶引入體內系統(tǒng)，然后進行上述的多元分析，這可以揭示該系統(tǒng)中的基因表達模式。結合此表達分析與“對照”系統(tǒng)，可將靶的未知功能或推測功能與特定的功能、疾病或生理途徑聯系起來；也就是，該靶得到了“驗證”。
在需要發(fā)現特定生物過程或途徑所涉及的新靶或候選靶時，優(yōu)選將具有已知功能的基因引入體內系統(tǒng)——然后使得該生物過程或途徑在該體內系統(tǒng)中至少有部分發(fā)展——進行多元分析。所述分析可以揭示能表征那些靶，例如基因和蛋白的基因表達和蛋白模式，其中那些靶是所述生物過程或途徑的進一步發(fā)展中所涉及到的。然后可以將這些新識別的靶引入體內系統(tǒng)，進一步研究它們對該過程或途徑的發(fā)展的效果，也可以識別后續(xù)發(fā)展中涉及到的其它靶。
用此方法研究疾病途徑的一個例子就是用基因遞送方法(i)表達疾病相關途徑中的已知成員，或者(ii)抑制所述途徑的已知成員的表達，從而干擾疾病途徑。對該途徑中的其它成員也應用這種分析，可以對此途徑有深入的了解。
選擇一組疾病狀態(tài)首先控制體內系統(tǒng)以得到治療所期望的至少兩種不同的體內狀態(tài)。例如癌癥通常以過度的生長速度來表征，因此可以通過獲得生長速度不受干擾的腫瘤組織，和其它生長速度受到促進或抑制的腫瘤組織，來提供治療所期望的不同狀態(tài)的組織。另一個例子是關節(jié)炎，該疾病由關節(jié)炎癥來表征，因此關節(jié)炎癥不受干擾是一種狀態(tài)，而另一種狀態(tài)是關節(jié)炎癥減輕，再一種狀態(tài)是關節(jié)炎癥加重。
在一個實施方案中，選擇一個或多個靶引入體內系統(tǒng)。靶的功能或特征可以是已知的、推測的或是未知的，這取決于使用靶的方式。這里所說的靶是指一種由DNA分子編碼的多肽或蛋白，DNA分子本身，或者由此衍生的一種RNA分子。在另一個實施方案中，選擇一種或多種藥物引入體內系統(tǒng)。
靶的驗證一方面，本發(fā)明提供了一種靶的驗證方法，其中靶的功能或作用方式是推測的或是部分或全部未知的。任何推測的，未知的以及其它可能的靶都可以用于本發(fā)明。例如，所述靶可以是一個全長基因，例如基因組DNA序列，或是一個cDNA序列。優(yōu)選該靶被推測參與一個特定的生物途徑或過程，或者一類疾病或失調。但是，具有推測功能并不是在本發(fā)明中使用所必需的先決條件。
根據本發(fā)明，一種靶的驗證方法包括將所述靶引入體內系統(tǒng)(任選地與其它藥劑組合引入)，從得到的干擾系統(tǒng)中獲取生物分析數據。這些生物分析數據進一步與從已知對照中得到的數據進行比較。對照優(yōu)選是最易得的陽性對照。例如，如果一個靶被推測參與某種特定的疾病，那么對照優(yōu)選是一種相關的體內疾病模型，該體內疾病模型已經引入了一種已知是參與該疾病途徑的的基因。可選擇地，體內系統(tǒng)也可以不引入靶，而是使用含有突變的體內系統(tǒng)，例如基因敲除的鼠。
例如，如果可能的靶被猜測參與了風濕性關節(jié)炎的發(fā)展或退化，那么將此可能的靶引入具有關節(jié)炎特征的體內系統(tǒng)，過一段時間后對此體內系統(tǒng)進行分析，例如多元基因表達分析?；虮磉_分析的方法是本領域公知的，包括，例如核酸微陣列分析。合適的微陣列都是商業(yè)可獲得的。
然后將得到的數據與得自具有關節(jié)炎特征的對照體內系統(tǒng)進行比較，該對照已經引入了一個或多個在關節(jié)炎途徑中具有確定作用的基因。風濕性關節(jié)炎的模型是本領域公知的。參見，例如Henderson，風濕性關節(jié)炎的機理和模型(Academic Press，1995)。可能的靶和對照之間的數據比較提供了這樣的信息，如靶對所研究的疾病的發(fā)展或退化過程中涉及到的基因的上調或下調的能力。
在另一個例子中，可以將推測的腫瘤靶引入腫瘤模型，例如腫瘤耐受的裸鼠，可以觀察它對于腫瘤的影響，例如通過測量腫瘤大小的變化。其對于該模型的作用的其它檢測方法是本領域熟知的，例如通過檢測基質金屬蛋白酶活性測量轉移的可能性。
靶的發(fā)現另一方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)現任何給定生物過程或途徑，例如免疫反應，或疾病的發(fā)展或退化中的一個或多個新靶的方法。通常，這種方法包括向體內系統(tǒng)引入一種或多種已知的(即具有特定特征的)基因(任選地與其它藥劑組合引入)。然后使此系統(tǒng)起作用以使所感興趣的生物過程或途徑至少有部分發(fā)展，然后可以對至少一部分體內系統(tǒng)進行多元分析。該分析可以利用基因表達的測量方法。該生物途徑或過程可以與腫瘤發(fā)展或退化，風濕性關節(jié)炎途徑，任何退行性疾病，或免疫反應等相關。
體內系統(tǒng)的途徑分析可以發(fā)現一個或多個基因以生物學顯著的水平，例如升高的表達水平表達，也可以發(fā)現一種或多種蛋白以生物學顯著的水平磷酸化。該分析可以進一步揭示當發(fā)生生物學顯著水平的表達的時候，生物過程或途徑所處的特定階段。通過由此分析識別可能的重要基因和/或蛋白，技術人員就可以選擇一個或多個基因并將這些基因作為新發(fā)現的靶引入體內系統(tǒng)，或者單獨引入或者以任意組合引入——任選地與一種或多種藥劑，例如藥物或生物毒素一起。
體內系統(tǒng)在引入新發(fā)現的靶以后，可以進行類似的多元表達分析，等待一段時間以后使所研究的生物過程或途徑有進一步發(fā)展。這種發(fā)現新靶的方法是基于體內系統(tǒng)的表達分析，可以根據需要重復進行，以表征特定途徑或過程的發(fā)展，并識別能夠對抗或促進該途徑或過程的發(fā)展的藥劑。
正如所指出的那樣，本發(fā)明可以用于發(fā)現任何生物途徑或過程中的靶。例如，可以通過攝生法推斷風濕性關節(jié)炎發(fā)展過程中的靶。此途徑中定義的基因，如IL-10和IL-11，可以單獨或組合給予體內系統(tǒng)。體內系統(tǒng)可以是，例如一種風濕性關節(jié)炎誘導膠原的DBA/1LacJ鼠。過一段時間以后(該時間可以是預先設定的，也可以是任意的)，將得自體內系統(tǒng)的組織樣品應用于多元表達分析。如果，該表達分析發(fā)現了關節(jié)炎退化過程中特定基因的表達水平發(fā)生了生物學顯著的變化，那么就重復進行前面的步驟對被識別的基因進行進一步分析。這種過程可以用于研究不同類型癌癥的發(fā)展或退化，也可以研究體內系統(tǒng)對抗原的免疫反應，例如疫苗研制中的免疫反應。
一方面，本發(fā)明的方法可以使用至少兩個已知可以以不同或相反的方式干擾體內模型系統(tǒng)的靶。例如，在小鼠腫瘤模型中，不同的小鼠用已知的腫瘤促進藥劑和已知的腫瘤抑制藥劑處理，例如通過編碼腫瘤促進藥劑和腫瘤抑制藥劑的核酸的基因遞送。在體內系統(tǒng)有一定發(fā)展以后，研究用腫瘤促進藥劑和腫瘤抑制藥劑處理的腫瘤的基因表達。將結果與未處理腫瘤(其中體內系統(tǒng)的發(fā)展未受干擾)比較，識別出表達有所改變的基因。這樣的基因就是可能的靶，可將這些基因引入相同的或不同的體內系統(tǒng)進行進一步研究。在一種干擾的影響下表達增加，而在不同或相反的干擾的影響下表達減少的基因是特別感興趣的。例如，在腫瘤模型中，與對照相比在腫瘤促進藥劑的干擾下表達增加，而在腫瘤抑制藥劑的干擾下表達減少的基因是特別引起興趣的，雖然并非是唯一引起興趣的。類似地，與對照相比在腫瘤促進藥劑的干擾下表達減少，而在腫瘤抑制藥劑的干擾下表達增加的基因也是特別引起興趣的，雖然也并非是唯一引起興趣的。
選擇體內系統(tǒng)本發(fā)明可以使用多種類型的體內系統(tǒng)。優(yōu)選地，該體內系統(tǒng)要滿足下述條件(i)能良好地攝取或整合被引入該系統(tǒng)的靶；(ii)良好地表達或呈遞該系統(tǒng)中的靶；(iii)優(yōu)選該系統(tǒng)對于靶的表達或呈遞具有生物學或生理學反應，可以指示出人對于該靶的表達或呈遞的反應，也就是說，該體內系統(tǒng)的反應是人反應的一個精確的模型系統(tǒng)。
在一個實施方案中，該系統(tǒng)是一個哺乳系統(tǒng)，例如嚙齒動物、豬、貓、犬、綿羊或牛。本領域技術人員應當認識到也可以使用其它哺乳動物系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，該體內系統(tǒng)是小鼠。小鼠可以是，DBA/1LacJ小鼠，SCID小鼠，裸鼠，或Balb/c小鼠。本領域技術人員應當認識到大量的小鼠品系(strain)都是商業(yè)可獲得的，都適用于本發(fā)明。合適的小鼠品系可以得自，例如，Jackson實驗室(BarHarbor，Maine)，該實驗室還可以提供有關這些小鼠的大量的遺傳和表型信息。
將靶引入體內系統(tǒng)靶可以通過載體，例如質?；虿《疽塍w內系統(tǒng)。載體可以是病毒、非病毒、或是雜交類型的，例如病毒核酸和合成藥劑的組合，或是多核苷酸和物理遞送方式如壓力或電場的組合，任選地包括能增強遞送的物理方法。根據本發(fā)明，將感興趣的靶克隆入載體，然后用傳統(tǒng)的技術將其送入體內系統(tǒng)。合適的載體是本領域公知的。本發(fā)明可使用任何傳統(tǒng)的載體系統(tǒng)，包括非病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)，例如腺病毒，腺相關病毒，反轉錄病毒，慢病毒，HSV，alfa病毒，SV40，和EBV系統(tǒng)(參見Hitt等，1997用于將基因轉移到哺乳動物細胞中的人腺病毒載體，Gene Therapy，Advances in Pharmacology.Academic Press；Giorgio P.等，1997免疫治療中的細胞因子基因傳導，Gene Therapy，Advances in Pharmacology.Academic Press；Christopher，B等，1999用于癌癥基因治療的逆轉錄病毒載體設計，Gene Therapy of Cancer.Academic Press；Huang，L.等，1999基因治療的非病毒載體，Academic Press；Lowrie，D和R.Whalen，2000DNAVaccinesmethods and protocols.Humana Press)。
非病毒載體可以包括編碼產生蛋白因子的核酸序列。該核酸序列可以是環(huán)狀的或線狀的，可以來自病毒基因組。非病毒載體還可以包括合成藥劑，例如脂類或脂質體(例如陽離子脂類如DOTAP，DOTMA，DDAB或陽離子脂類和輔助脂類如DOPE或膽固醇的混合物)，聚合物(例如陽離子聚合物如聚賴氨酸，枝鏈聚乙烯亞胺(PEI)，直鏈PEI，樹狀聚物(dendrimers))，多肽(例如聚賴氨酸，聚精氨酸，聚鳥氨酸，聚組氨酸，賴氨酸和組氨酸，精氨酸和組氨酸，鳥氨酸和組氨酸的共聚多肽)，肽(例如組蛋白H2A和TAT蛋白)，以及聚合物結合物(例如陽離子聚合物，親水聚合物和靶定配體的結合物)。
所述載體任選地通過選自下組的物理方法送入體內系統(tǒng)電場，包被微球轟擊，靜水壓和其它物理方法。在聚合物的結合物中，陽離子聚合物包括聚賴氨酸，支鏈PEI，直鏈PEI，賴氨酸和組氨酸的共聚物；親水共聚物包括聚乙二醇，polyoxazalone，fleximer；配體包括肽配體，糖配體，抗體以及單鏈抗體。
在哺乳動物系統(tǒng)中，許多基于病毒的表達系統(tǒng)都可以使用。當使用腺病毒作為表達系統(tǒng)的時候，所感興趣的編碼序列，即靶，可以插入到腺病毒的轉錄/翻譯控制復合物中，例如主晚啟動子和三重前導序列。將然將此嵌合基因插入到腺病毒基因組中。向病毒基因組的非必需區(qū)域(例如E1和E3區(qū)域)的插入將會得到重組病毒，它能在被感染的宿主中表達靶蛋白(參見Logan等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。在一個實施方案中，編碼靶全長開放閱讀框架的cDNA序列可以插入pCMVB中，替換β-半乳糖苷酶基因，該cDNA的表達由CMV啟動子啟動(Alam，1990，Anal.Biochem.188245-254；MacGregor等，1989，Nucl.Acids Res.172365；Norton等，1985，Mol.Cell.Biol.5281)。
根據所涉及的基因靶和組織或細胞類型，應選擇特定類型的表達載體以實現有效的基因遞送，并使其適合于疾病模型。組織特異的遞送(例如肌肉，神經或骨)可以使用特定類型的載體；例如，裸露的DNA質粒適用于遞送到肌肉組織中，而AAV可有效進行腦細胞中的神經元轉導。腺病毒載體對于肝和肺組織尤其合適。基因遞送的特異性與特定的基因的發(fā)現和驗證也有關系。通過組織特異性啟動子或其它誘導藥劑的轉錄調控控制的靶的表達可以為靶的發(fā)現和驗證提供獨一無二的表達環(huán)境。
克隆入載體以后，有效量的靶被引入體內系統(tǒng)。這里所述的有效量是指靶在體內系統(tǒng)產生可檢測到的效果所需的最小量。
所研究的途徑或過程的引入和發(fā)展路線本發(fā)明可使用任何傳統(tǒng)的將基因表達載體引入體內系統(tǒng)的路線、例如，這種引入可以是侵入性的或非侵入性的，局部的(例如腹膜內的，關節(jié)局部注射，腫瘤內注射)或全身性的。例如載體的靜脈內注射是一種典型的侵入性和全身遞送方法?？谇?氣管遞送是一種局部的非侵入性的引入方式。非侵入性的遞送包括所有通過身體的開放通道或皮膚的直接引入。侵入性的遞送包括注射，電穿孔和直視手術等。本發(fā)明中用于靶的發(fā)現和驗證的基因遞送路線包括現在已經被使用的或者有可能被發(fā)展的所有類型的遞送方法。
數據的多元分析多元方法被用于分析已經引入一個或多個靶的體內系統(tǒng)的基因表達模式、蛋白模式、蛋白磷酸化模式和其他特征。在這一點上，本發(fā)明使用的是組合分析，包括藥理的和病理的數據分析；生物檢測；微陣列分析；蛋白質組學分析，和生物信息學。優(yōu)選地，本發(fā)明的分析包括上述每一項分析，本發(fā)明也可以使用這些技術的附屬技術。無論如何，整合數據的分析可以發(fā)現生物途徑或過程中涉及到的候選基因或其它因素。下述標準用于識別候選基因，雖然本領域技術人員應當知道其它現有的和將有的標準都可以用于本發(fā)明中。
病理數據病理分析包括評估特定靶對于疾病或其它生物途徑的病理學效果。如果體內系統(tǒng)是用于監(jiān)測腫瘤的發(fā)展，例如，那么引入的靶對于腫瘤和該系統(tǒng)的病理學效果總體上是相關的。這種效果包括任何動物行為上的變化，例如疲勞或昏睡；白血球數量的變化；腫瘤表型的變化。確定和評估病理學信息的方法是本領域公知的。
藥理學數據藥理學分析直接表示靶和/或其它引入的藥劑對于參與所研究的途徑或過程的基因的基因表達水平的效果。舉個例子，可以在將靶或其它藥劑引入體內系統(tǒng)之前，之中和之后評估特定一組基因，如TNF和TNF-R的基因表達水平?；虮磉_水平有助于了解特定靶是否參與特定基因的上調或下調。因此，優(yōu)選在特定途徑的不同階段都進行藥理學分析，以推斷靶是否調節(jié)基因的“開”或“關”。
藥理學分析特別地可以分為不同水平上的分子的，細胞的，組織的和病理的。本發(fā)明可以進行任何一種水平的分析。分子水平的藥理學分析可以推斷出，例如生物途徑或過程發(fā)展中細胞因子表達的水平。在關節(jié)炎途經中，例如，治療所不希望的炎癥的發(fā)生會刺激炎性細胞因子的產生。炎癥可能也會導致嗜中性粒細胞的增加，這是一種細胞水平的藥理學效果。在關節(jié)炎途徑的組織水平上，慢性炎癥會導致組織增殖。在病理學水平上，炎癥，也就是關節(jié)炎途徑的發(fā)展，會導致細胞生命力的降低，從而會破壞特定的組織。在任何水平上對靶的藥理學效果的評估都有助于驗證或發(fā)現任何給定的生物過程或途徑中的靶。
微陣列，基因表達和蛋白質組學分析微陣列分析可以對靶的DNA、RNA或多肽分子的形式進行分析。通過與陣列上的探針分子雜交或相互作用，靶可以分類為特定的基因家族，優(yōu)選該基因家族的功能是已知的。本發(fā)明可以單獨或組合使用任何前述的微陣列方法分析本發(fā)明的靶。核酸和肽，多肽和蛋白的微陣列分析方法是本領域公知的。
如果要分析靶的DNA組分，可以用商業(yè)可獲得的微陣列芯片對靶進行初步檢測。所分析的DNA可從體內系統(tǒng)直接獲得；也可以將分離的RNA用傳統(tǒng)方法反轉錄獲得cDNA。用于這種分析的合適的芯片可以從Affymetrix(Santa Clara，CA)和Incyte(Palo Alto，CA)得到。初步檢測可以發(fā)現該靶參與的特定“類(genus)”途徑，例如腫瘤生長或者關節(jié)炎途徑。從初步檢測得到的數據可以用于設定二次或特異性微陣列檢測。最后，為特定途徑如腫瘤發(fā)展或關節(jié)炎設計特異的微陣列。與初步檢測相比特異檢測步驟可以發(fā)現特定靶的更特異的數據。成品的微陣列是商業(yè)可獲得的，而特異微陣列可以用本領域公知的方法定制。參見Schena(Ed.)“Microarray Biochip Technology”(Eaton Publishing Co.，2000)和Schena(Ed.)DNA MicroarraysAPractical Approach Series(Oxford University Press，1999)。
RNA微陣列分析可以對直接得自體內系統(tǒng)的RNA進行，也可以對非直接得自體內系統(tǒng)的RNA進行，例如先獲得體內系統(tǒng)的DNA，然后在體外將DNA轉錄成RNA。商業(yè)供貨商如Clontech(Palo Alto，CA)出售的RNA陣列都可以用于此類分析。
蛋白質陣列或組織陣列可用于識別多肽形式的靶。本發(fā)明可分析直接得自體內系統(tǒng)的多肽；也就是說該多肽在體內翻譯。除此之外，多肽還可以利用得自體內系統(tǒng)的DNA或RNA進行體外翻譯，然后進行蛋白質陣列分析。
蛋白質組學分析可用于識別多肽形式和特定的翻譯后修飾如磷酸化和糖基化形式的靶。本發(fā)明可分析蛋白質組學分析所得的多肽。在一種實施方案中，磷酸化形式可以發(fā)現靶的激酶和磷酸化酶活性。本發(fā)明可以使用任何蛋白質組學分析方法，包括2維凝膠電泳，質譜，CIPHERGEN樣品制備方法與質譜的組合，以及蛋白質組學分析領域技術人員所公知的其它方法。
生物檢測微陣列分析可以提供定性數據，即一個特定的基因是否開啟或關閉一種生物過程或途徑的一個特定部分，而生物檢測可以提供定量的數據，例如在一種過程或途徑中的特定階段的基因表達水平。適用于本發(fā)明的特定的生物檢測包括，尤其是，Northern、Southern和Western雜交，分別用于分析DNA、RNA或多肽形式的靶。這樣的方法是本領域公知的(Ausubel等(編)，1989，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley and Sons，Inc.)。
生物信息學生物信息學分析可以識別表達的基因是否屬于特定家族基因。優(yōu)選地，技術人員利用這種分析可以將基因基于功能或表達強度進行分類或“簇群分析(cluster)”。這種方法可以發(fā)現按先后順序影響特定生物過程或途徑發(fā)展的多個基因。
基于多元分析驗證靶上述各種分析的組合可以相對精確地揭示靶在體內系統(tǒng)的特定生物過程或途徑中所起的作用。在這一點上，可將從所研究的體內系統(tǒng)得到的數據與從對照系統(tǒng)得到的數據相比較。表達數據的比較可以發(fā)現，例如，該靶是否抑制同樣也在對照系統(tǒng)中表達的基因的表達。
參照圖1，一個未知功能或具有推測功能的靶，即“前導基因(geneleads)”，可以引入動物疾病模型如小鼠，一段時間以后分析動物模型，將得到的數據與得自相似動物模型的表達分析數據進行比較，該相似動物模型已經引入了一個或多個“已確定”的基因，即對照。這種數據的對照可以對疾病基因進行驗證。
將新發(fā)現的或被識別的靶引入體內系統(tǒng)除了發(fā)現靶的功能以外，得自體內系統(tǒng)的數據的組合還有助于了解可能參與特定途徑或過程的發(fā)展或退化的其它靶。相應地，數據的整合可能發(fā)現新的靶，這些新的靶可以繼續(xù)引入體內以進行，例如，靶的驗證。
任何已知功能的靶在本發(fā)明中都可以用作發(fā)現新靶的工具。相應地，該靶可以刺激或已知疾病的發(fā)展，如果所使用的靶引起疾病的發(fā)展，那么就可以識別該疾病發(fā)展中所涉及的其它基因，以研制這種基因的拮抗劑。
該靶還可以是能夠引起免疫反應的抗原。可以用這種靶研制具有提高功效的疫苗。為此可以將靶抗原引入體內系統(tǒng)，然后進行多元表達分析，以識別一個或多個活性基因或靶，如細胞因子。然后將靶抗原重新與候選靶一起引入體內系統(tǒng)，然后進行另一個多元表達分析。這種分析可以產生更多更強的免疫反應，從而發(fā)現其它的候選靶，這些候選靶又可以與靶抗原和其它識別基因一起再次被引入體內系統(tǒng)。
實施例下述實施例是舉例說明而并非限制本發(fā)明。
實施例1腺相關病毒載體介導的可溶TNF受體基因向膠原誘導的風濕性關節(jié)炎DBA/1LacJ小鼠的遞送在不同的時間點和不同的劑量水平可觀察到疾病的退化，收集病理學和藥理學信息。收集每個群組的RNA樣品然后進行微陣列分析，識別出上調和下調基因靶。將生物檢測數據，微陣列數據和生物信息學數據組合分析，可識別出基因藥物的可能的靶。這些新的靶再一次用于同樣類型的動物模型，通過上述分析得到確認和驗證。
實施例2腺病毒載體介導的GM-CSF基因向SCID小鼠的遞送腺病毒載體介導的GM-CSF基因向SCID小鼠腫瘤模型的遞送是一個宿主免疫增加的范例。當發(fā)生腫瘤退化時，用不同劑量在不同時間點處理得到的表達數據可能是完全不同的。樣品的收集與實施例1中相同，例如病理學和藥理學數據，微陣列和生物信息學數據為新靶的發(fā)現提供了足夠的信息。
實施例3候選的癌相關靶的驗證和排除概述每一個候選靶的基因表達質粒DNA和對照一起被送入異種移植的(xenografted)6周齡的雌性裸鼠(Taconic，Germantown，NY)的MDA-MB-435腫瘤中，每5天進行一次一系列的注射，持續(xù)15到20天。這個過程中的腫瘤生長速度用雙盲方法測量。
研究簡述一組基因被克隆入pCI表達載體(Promega，Madison，WI)，然后用組氨酸-賴氨酸共聚物的方式向異種移植的裸鼠的人MDA-MB-435腫瘤細胞進行腫瘤內遞送(參見EP1242051A1的實施例，在此引入其全文作為參考)。轉化基因的表達以依賴于單個基因功能的方式擾亂了腫瘤生長。不同處理組的腫瘤生長曲線的對照可以說明該基因關于調節(jié)腫瘤生長能力的功能。
實驗設計1)建立MDA-MB-435/裸鼠腫瘤模型4×105個MDA-MB-435細胞懸于30μl RPM1640無血清培養(yǎng)基中，皮下(s.c)注射到裸鼠中。使腫瘤生長直至其大小達到50到150mm3。
2)pCI表達載體中帶有候選人基因(列于表1)的質粒DNA用組氨酸-賴氨酸(HHHK)共聚物的方式直接送入腫瘤中。每個腫瘤都被引入5μg DNA與5μg共聚物4B聚合物的混合物。每組包括至少3只小鼠(6個腫瘤)。DNA注射每5天進行一次，一共20天(4次注射)。
3)腫瘤二維尺寸的大小用外部測徑器測量，腫瘤體積用體積＝寬度2×長度×0.52計算。每次DNA注射前測量體積，最后一次DNA注射后每5天測量體積，一共25天。嚴密監(jiān)控被處理小鼠的生存狀況。待腫瘤生長至3000mm3時或者在實驗結束時處死小鼠。
4)本研究是雙盲的，證明了該檢測根據其1)促進腫瘤生長，2)抑制腫瘤生長，或3)不影響腫瘤生長的能力(相對于控制基因和載體樣品)正確辨別靶的能力。
材料和藥劑1)細胞MDA-MB-435是人乳腺癌細胞系，由James Mixson博士(Maryland大學，Baltimore)增予。該細胞系用標準條件培養(yǎng)。
2)質粒DNA大量的質粒DNA的制備都是使用Qiagen EndoFree質粒批量試劑盒(Qiagen Cat#12362)并根據制造商的手冊進行的。
3)組氨酸-賴氨酸HHHK 4B聚合物組氨酸-賴氨酸共聚物是由James Mixson博士(Maryland大學)提供的，配制成30μg/μl。
結果將表達質粒中的候選基因與幾種已熟知的腫瘤靶一同研究，如表1和表2所示。該研究用的是盲檢，以證明該檢測可以根據其相對于控制基因和載體樣品的1)促進腫瘤生長，2)抑制腫瘤生長，或3)不影響腫瘤生長的能力正確地區(qū)分幾種已知靶，如圖3所示。
本研究中的已知靶通過腫瘤生長率數據被正確地識別。在用表達人bFGF的質粒DNA處理的動物組中觀察到了腫瘤生長的增長。人bFGF是一種眾所周知的能增加腫瘤的血管生成和生長的，也是一種已獲批準的癌癥藥物的靶。在用表達人IL-2的質粒DNA處理的動物組中觀察到了腫瘤生長的抑制。人IL-2也是一種眾所周知的具有抗腫瘤(抗血管生成)活性的靶，并且實際上也是一種已獲批準的治療腎細胞癌的藥物(在此檢測中在所觀察到的反應中IL-2的免疫反應活性并不是主要的因素)。一種熒光素酶報道子基因被正確地識別出對腫瘤生長沒有影響。將本研究的結果與已知靶的性質進行比較，比較結果如表1所示。本研究的結果與這三個基因的已知性質完全相符，這清楚地證明了所述方法能夠辨別候選腫瘤靶。
表2.腫瘤干擾檢測的驗證

本研究中的五個候選靶的結果再次成功地給出了證明。這些靶之前在科學文獻中都有過描述，其中一些用細胞培養(yǎng)和不同的動物研究研究了許多年。這五個基因中的兩個，FGF結合蛋白(FGFbp)和多效蛋白(PTN)被認為可以促進腫瘤生長。PTN的研究很好地驗證了這種技術平臺排除無用靶的能力。PTN被識別出與人乳腺癌組織相關，其具有與公認的靶非常類似的蛋白質性質，其在模式生物的血管生成中具有機械活性。然而，盡管這些研究在候選靶上取得了明顯的成功，能夠用所有的標準基因組，蛋白質組學和生物信息學方法實現，它在腫瘤控制靶上的有效性還有待驗證。通過結合使用腫瘤耐受動物模型和上述基因遞送技術，有可能快速地將PTN與已被證實的靶區(qū)分開。
類似地，這五個候選靶中的兩個，人IL-12和人IL-2被認為能抑制腫瘤血管生成，因此能抑制腫瘤生長。然而通常認為IL-12抑制腫瘤血管生成的作用比IL-2弱，已知IL-12的作用與IL-2類似或比IL-2更強。本研究驗證的人IL-12基因只包括其兩個結構域中的一個，以驗證其兩個結構域是否都是抑制腫瘤血管生成所必需的。第三個未知結構的(X)可能的血管生成抑制劑也是一個候選靶。用上述方法得到的數據強烈地暗示這個靶可能不是抗癌藥物研制的好的備選物。
在所有的例子中，盡管進行了大量的科學研究，但是仍然缺乏清楚的和有說服力的證據證明這五個靶具有單獨控制腫瘤生長的能力。所得結果總結于表2。對這些候選靶在其它腫瘤模型中的進一步檢驗可以使用同樣的技術平臺進行，從而進行驗證或是將它們從藥物研制的備選物中排除出去。
表2.候選腫瘤靶的腫瘤干擾方法測定

上述方法需要不到45天，使用質粒表達載體使得該方法成為辨別候選靶的一個非常有效的方法。該方法能快速確定由體外研究識別的被認為與腫瘤細胞增殖強烈相關的基因是否在完全的生物系統(tǒng)中具有控制腫瘤物質生長的能力。很明顯這里所述的方法可以用多種腫瘤模型進行檢測。例如，該方法可以同時用多達四個腫瘤模型進行。
實施例4疾病相關的靶的發(fā)現腫瘤干擾靶驗證實驗顯示出了IL-2明顯地抑制腫瘤生長，bFGF增強腫瘤生長，基于這些數據選擇了IL-2和bFGF。如實施例3那樣用10mgpCI-IL-2或pCL-bFGF質粒和HHHK共聚物給小鼠腫瘤進行注射。每5天注射一次，持續(xù)20天。腫瘤體積的結果如圖4所示。
由這些結果可知，很明顯首次注射后的前5天腫瘤生長沒有受到顯著影響，雖然現在已經知道腫瘤必然會被增強或抑制(基于它們后來的生長速度)。因此在靶發(fā)現方法中選擇使用第一和第二注射點。
其它小鼠注射IL-2，bFGF或對照(熒光素酶)質粒。每組中有一些小鼠在第一次注射后一天處死，其余的小鼠在第二次注射(第5天)后一天處死。從這些小鼠中取出腫瘤，勻漿，用標準方法制備RNA。然后將RNA用標準方法進行DNA微陣列分析(Affymetrix)。然后用標準生物信息學方法分析陣列數據，將IL-2和bFGF處理的腫瘤中的基因表達與對照腫瘤中的基因表達相對比。其過程概述于圖5。在兩個時間點都進行這樣的對照。識別出IL-2或bFGF處理的腫瘤中與對照腫瘤相比表達有改變的基因。特別感興趣的，但不是唯一感興趣的是在bFGF處理的細胞中表現出增強表達(相對于對照腫瘤)的那些基因，以及在IL-2處理的細胞中表現出降低表達(相對于對照腫瘤)的那些基因。同樣感興趣的是那些在IL-2處理的細胞中表現出增強表達(相對于對照腫瘤)的那些基因，以及在bFGF處理的細胞中表現出降低表達(相對于對照腫瘤)的那些基因。這些基因在其對腫瘤生長或抑制途徑中的作用中可能是非常重要的。
這種方法可識別許多從前已知的和已經驗證的(“熱(hot)”)靶，如圖6所示，也可識別很多的新靶，并用實施例3所述的方法進行后續(xù)的驗證。這些新靶概括描述于圖7。圖8總結了用這種方法得到的結果。
實施例5腫瘤生長率干擾，然后進行基因組和蛋白質組途徑分析以發(fā)現癌癥靶使移植入動物的腫瘤生長并對其進行處理以得到具有增高生長率，抑制生長率和無改變生長率的腫瘤，如實施例3和4所述。將人腫瘤移植到免疫暴露的小鼠如裸鼠中?？梢酝ㄟ^施用能增強腫瘤生長的藥劑如VEGF，bFGF，EGF，使這些因子在腫瘤中表達的多核苷酸，或者抑制腫瘤抑制物或凋亡誘導蛋白的多核苷酸使腫瘤生長率增高。可以通過施用抑制腫瘤生長的藥劑包括IL2和其它細胞因子，腫瘤抑制物蛋白，使這些因子在腫瘤中表達的多核苷酸，或者能抑制腫瘤生長因子或基質組織新血管生成的多核苷酸抑制腫瘤生長率。當質粒被送入腫瘤內以促進或抑制腫瘤生長率時，腫瘤內的轉化基因表達的產物對腫瘤生長的影響取決于轉化基因的功能。進行腫瘤生長曲線的對比以識別生長率增高，抑制或不改變的處理組。
將生長率改變或未改變，而在尺寸上相對于生長率未改變的腫瘤增大或減小的腫瘤取出，用實施例4的方法處理，確定它們的基因表達蛋白質組信息。除此之外，重復進行移植和處理，得到那些預期尺寸相對于生長率沒有改變尺寸也一樣的腫瘤增大或減小的腫瘤，將這些腫瘤取出并確定它們的基因表達蛋白質組信息。腫瘤用例如速凍的方法處理，得到用于測量的樣品。處理得到a)所選組織結構的用于激光捕獲顯微分離的薄切片，和b)大量組織樣品。從每一個群組收集RNA樣品，然后進行微陣列分析，例如用寡核苷酸陣列進行EST測定，用cDNA陣列進行基因測定。從每一個群組收集蛋白質樣品，然后進行蛋白質組學分析，例如二維凝膠電泳聯合點的質譜分析或CIPHERGEN樣品處理和質譜分析。
該方法識別出上調和下調基因和相對于未改變腫瘤的改變腫瘤中的改變蛋白質。生物信息學分析用標準方法進行，以識別與生長率改變的腫瘤相關的新蛋白，即新靶。新靶通過多核苷酸的引入來驗證，該多核苷酸可以增加或減少腫瘤組織中的靶的水平。那些能控制腫瘤生長率的靶進一步被驗證，例如，如實施例3所述。
權利要求
1.一種發(fā)現生物途徑發(fā)展過程中涉及到的候選靶的方法，包括(a)以某種方式控制體內系統(tǒng)以得到至少兩種治療所期望的不同過程或條件的體內狀態(tài)；(b)使體內系統(tǒng)起作用以使所述生物途徑至少有部分發(fā)展；(c)對得自體內系統(tǒng)的生物樣品進行至少一項選自下組的分析病理、藥理、生物檢測、微陣列、基因表達、蛋白質組學、生物信息學分析，其中所述分析能揭示一種或幾種所述生物途徑發(fā)展所涉及到的候選靶。
2.根據權利要求1的方法，其進一步包括(d)將所述一個或多個揭示的候選靶引入體內系統(tǒng)；(e)重復步驟(b)和(c)，以識別所述生物途徑發(fā)展過程中涉及到的更多的靶。
3.根據權利要求1的方法，其中對體內系統(tǒng)的控制是通過將具有已知的或推測的功能的一種或幾種靶引入體內系統(tǒng)，其中已知靶和候選靶是基因或序列特異的多核苷酸抑制劑。
4.根據權利要求2的方法，其中步驟(e)進一步包括將具有已知的或推測的功能的一種或幾種靶引入體內系統(tǒng)。
5.根據權利要求1的方法，其中體內系統(tǒng)是哺乳動物系統(tǒng)。
6.根據權利要求2的方法，其中步驟(e)揭示所述生物途徑的進一步發(fā)展過程中涉及到的更多的候選靶。
7.根據權利要求2所述的方法，其中步驟(e)包括對樣品進行選自下組的三種或更多種分析病理、藥理、生物檢測、微陣列、生物信息學分析，其中所述分析可以揭示所述生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一種或幾種候選靶。
8.根據權利要求7的方法，其中步驟(e)包括對樣品進行選自下組的四種或更多種分析病理、藥理、生物檢測、微陣列、生物信息學分析，其中所述分析可以揭示所述生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一種或幾種候選靶。
9.根據權利要求6的方法，進一步包括(f)將所述更多的候選靶引入體內系統(tǒng)；(g)重復步驟(b)和(c)，以識別所述生物途徑的更進一步發(fā)展過程中涉及到的更多的靶。
10.根據權利要求1的方法，其中步驟(a)進一步包括向體內系統(tǒng)引入一種藥劑，所述藥劑選自藥物和細菌毒素。
11.根據權利要求1的方法，其中所述已知靶通過載體系統(tǒng)引入所述體內系統(tǒng)。
12.驗證生物途徑發(fā)展過程中涉及到的候選靶的方法，包括(a)將核酸序列引入第一體內系統(tǒng)；(b)使第一體內系統(tǒng)起作用，以使所述生物途徑至少有部分發(fā)展；(c)通過兩種或更多種選自下組的分析從所述生物樣品中獲得數據病理、藥理、生物檢測、微陣列和生物信息學分析；(d)將所述數據與得自對照體內模型的數據進行對比，所述對比揭示所述核酸序列是否與所述生物途徑的發(fā)展有關。
13.根據權利要求12的方法，其中所述DNA序列編碼肽、多肽或蛋白質。
14.一種識別生物途徑發(fā)展過程中涉及到的一個或多個基因的方法，包括(a)將DNA序列引入第一體內系統(tǒng)；(b)使第一體內系統(tǒng)起作用，以使所述生物途徑至少有部分發(fā)展；(c)通過兩種或更多種選自下組的分析從所述生物樣品中獲得數據病理、藥理、生物檢測、微陣列和生物信息學分析；(d)將所述數據與得自對照體內模型的數據進行對比，其中所述對比可以識別所述生物途徑發(fā)展過程中涉及的一個或多個基因。
15.根據權利要求14的方法，其中所述數據通過基因表達分析得到。
16.根據權利要求15的方法，其中所述基因表達分析用核酸微陣列進行。
17.根據權利要求15的方法，其中所述基因表達分析用蛋白質組學分析進行。
全文摘要
本發(fā)明包括驗證或識別給定的生物過程或途徑，例如免疫反應，或疾病的發(fā)展或退化中涉及的靶的多元方法。通過將帶有基因傳遞載體或其它外源物質的靶引入體內系統(tǒng)，并通過整合從體內系統(tǒng)獲得的病理的、藥理的、生物檢測、微陣列和生物信息數據，本發(fā)明人能夠(1)識別所感興趣的生物途徑中涉及的一個或多個靶，例如基因，(2)將這些被識別的靶應用到該生物過程或途徑的進一步分析中去，(3)為發(fā)現和驗證可能存在的大量靶的提供一種體內的可定量方法。該方法可以應用于任何方面，包括生物過程或途徑的激動劑或拮抗劑的識別，這種識別可以發(fā)現藥物和疫苗的。
文檔編號C12N15/85GK1599866SQ02824038
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月3日 優(yōu)先權日2001年10月3日
發(fā)明者P·Y·盧, R·W·馬隆, P·斯卡里亞, M·C·伍德爾 申請人:因特拉迪格姆公司