專利名稱：口服免疫刺激哺乳動物、鳥類和爬行動物的(1－4)連接的β－D－甘露糖醛酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哺乳動物、鳥類以及爬行動物的口服免疫刺激材料，所述材料包括免疫刺激量的(1-4)連接的β-D-甘露糖醛酸含量至少為40％的藻酸鹽和如果需要或期望的可接受的載體。本發(fā)明還涉及刺激哺乳動物、鳥類或爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括給激哺乳動物、鳥類或爬行動物口服施用本發(fā)明的材料。
背景技術(shù)：
藻酸鹽分離自海洋褐色藻類。藻酸鹽還產(chǎn)在某些土壤細(xì)菌中，如棕色固氮桿菌(Azotobacter vinelandii)和褐色球形固氮桿菌(Azotobactercrococcum)以及若干不同的假單胞菌種。然而，褐色海藻一般是市售藻酸鹽的來源。
藻酸鹽是藻酸的鹽，為線性雜多糖，由在此命名為M的(1-4)連接的β-D-甘露糖醛酸和在此命名為G的α-L-古洛糖醛酸組成。這兩個糖醛酸具有下列結(jié)構(gòu) β-D-吡喃型甘露糖醛酸(M) α-L-吡喃型古洛糖醛酸(G)4C1構(gòu)象1C4構(gòu)象
聚合物存在的形式有稱為M-嵌段的甘露糖醛酸的均聚物序列，稱為G-嵌段的古洛糖醛酸的均聚物序列以及命名為MG-嵌段或GM-嵌段的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸單元的混合序列。下圖代表藻酸鹽結(jié)構(gòu)的例子MMMMMMMGGGGGGGGMGMGMGMGMGGGGGGGGMM-嵌段 G-嵌段 MG-嵌段 G-嵌段藻酸鹽通常含有全部三種嵌段，并且嵌段主要由3-30個單體單元組成。嵌段的分布取決于從中分離藻酸鹽的海藻的種類，以及取決于此海藻的年齡和部分，例如來自莖部的藻酸鹽與分離自葉部的藻酸鹽可能具有不同的序列和嵌段組成。海藻收集時的年份也影響嵌段組成和序列。根據(jù)常識，最高的G含量可在老L.hyperborea的莖部發(fā)現(xiàn)。同樣物種的葉部具有稍低的G含量和略短的G嵌段，但其含量仍高于其他大多數(shù)物種。市售的藻酸鹽通常具有的G含量為25％-70％。
藻酸鹽已知用于食品和醫(yī)藥、牙科用、化妝品及其他工業(yè)產(chǎn)品。最常見的工業(yè)用途是基于它們的水狀膠體和聚合電解質(zhì)性質(zhì)，這是膠形成、增稠、穩(wěn)定、膨脹以及粘度提供性質(zhì)的基礎(chǔ)。
富含M的藻酸鹽也顯示具有免疫刺激活性，可用作疫苗佐劑和傷口愈合組合物，如在美國專利5,169,840中所描述。哺乳動物和家禽增強免疫反應(yīng)的海草補劑公開在美國專利6,312,709中。然而，本發(fā)明中明確定義的口服免疫刺激材料包括免疫刺激量的甘露糖醛酸含量至少為40％的藻酸鹽，尤其適用于本發(fā)明的方法，是現(xiàn)有技術(shù)難以預(yù)料的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種哺乳動物、鳥類以及爬行動物的口服免疫刺激材料，所述材料包括免疫刺激量的M含量至少為40％的藻酸鹽和如果需要或期望的可接受的載體。
本發(fā)明還涉及刺激哺乳動物、鳥類以及爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括給所述哺乳動物、鳥類和爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激可攝取的材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽和如果需要或期望的可接受的載體。
附圖簡述下列縮寫用于附圖中；Durvillea水提取物＝DWE，Durvillea標(biāo)準(zhǔn)提取物＝Std.DA，而Lessonia標(biāo)準(zhǔn)提取物＝Std.LN。


圖1示出豬在喂食含有本發(fā)明的藻酸鹽的飼料12周后體重增加。
圖2示出在用本發(fā)明的藻酸鹽測試的豬中與對照豬相比總白血球的血清水平。
圖3示出在用本發(fā)明的藻酸鹽測試的豬中與對照豬相比單核細(xì)胞的血清水平。
圖4示出在用本發(fā)明的藻酸鹽測試的豬中與對照豬相比淋巴細(xì)胞的血清水平。
圖5顯示利用喂食Durvillea水提取物的豬的血與對照豬相比所測量的吞噬作用的水平。
圖6顯示利用喂食Durvillea水提取物的豬的血與對照豬相比所測量的氧化爆發(fā)反應(yīng)。
圖7顯示喂食Durvillea標(biāo)準(zhǔn)提取物、Durvillea水提取物和Lessonia標(biāo)準(zhǔn)提取物的豬與對照豬相比對注射人血清白蛋白試驗疫苗的免疫應(yīng)答。
發(fā)明詳述M含量至少為40％的藻酸鹽在本發(fā)明中用作哺乳動物、鳥類和爬行動物的口服免疫刺激劑。更具體而言，可使用M含量為50％-70％的藻酸鹽(諸如來自Lessonia，Durvillea和Laminaria)、70％-80％的藻酸鹽(諸如來自Durvillea)和80％-99.9％的藻酸鹽(諸如來自細(xì)菌和例如根據(jù)下列實施例所制備的類似Durvillea的藻酸鹽的水提取物)。這些藻酸鹽刺激哺乳動物、鳥類和爬行動物針對通過外源體和細(xì)胞的物理損傷由細(xì)胞攻擊所導(dǎo)致的疾病或創(chuàng)傷的免疫應(yīng)答。其中，外源體包括微生物，顆粒物質(zhì)，化學(xué)試劑等。物理損傷包括諸如擦傷、裂傷、挫傷、創(chuàng)傷等。
本發(fā)明的口服免疫刺激材料和方法利用免疫刺激量的M含量至少為40％的藻酸鹽。免疫刺激量可依據(jù)攝取免疫刺激材料的對象和所需要的免疫刺激的水平而變化。
含有M含量至少為40％的藻酸鹽的口服免疫刺激材料可以為藥用、獸用或類藥物應(yīng)用品(nutraceutical)的固體劑量形式，諸如片劑、囊片、膠囊等，或諸如粉劑或液體制劑。其可以是任何類型的用于哺乳動物、鳥類或爬行類動物消費的固體或液體食物，諸如寵物食品。其也可以是固體、半固體或液體營養(yǎng)補劑，諸如塊狀食品、飲料等。
可接受的載體可以是藥用、獸用和類藥物營養(yǎng)品的液體或固體劑量形式，液體、固體和半固體食品，以及液體和固體營養(yǎng)補劑中所用的任何常規(guī)載體。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，正如下列實施例所證明的，本發(fā)明的藻酸鹽的免疫刺激活性刺激攝取藻酸鹽的哺乳動物(如下所示的豬(參見圖1))與對照相比體重增加。當(dāng)這種藻酸鹽口服施用于年幼哺乳動物時，這一點是特別有用和期望的。同樣，本發(fā)明還涉及通過免疫刺激在哺乳動物、鳥類和爬行動物中刺激體重增加的方法，所述方法包括給哺乳動物、鳥類或爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽和如果需要或期望的可接受的載體。更具體而言，該方法還包括施用M含量為50％-70％、70％-80％或80％-99.9％的藻酸鹽。免疫刺激材料可以是任何上述的那些材料。
本發(fā)明的口服免疫刺激材料可含有M含量至少為40％的藻酸鹽，所述藻酸鹽是合成衍生的，或分離自產(chǎn)藻酸鹽的細(xì)菌種類或海草來源。
M含量至少為40％的藻酸鹽可通過本領(lǐng)域已知的許多方法獲自海草。具有所需M含量的藻酸鹽的原料為海藻或海草，特別是褐色海藻，為了固定苯酚和保存海藻，其一般用甲醛處理。此外，海藻可以用酸清洗以除去高度粘性的laminaran和fucoglycans。優(yōu)選地，它們可以用堿處理以減少熱原含量?？梢岳斫獾氖?，海藻可以用任何已知的方式進(jìn)行預(yù)處理?？梢允褂檬惺鄣脑逅猁}，最優(yōu)選的是Durvillea種的干燥和粉碎的海藻，但是新鮮的完整或未粉碎的來自Durvillea，Laminaria，Lessonia，Ecklonia，Macrocystis或Ascophyllum的海藻也適合作為原料。
生產(chǎn)這種藻酸鹽的方法闡述在例如Green的美國專利2,036,934和Le Gloahec的美國專利2,128,551中，這些方法在此引作參考。用于本發(fā)明的其他獲取藻酸鹽的方法在下列實施例中提供。例如，本發(fā)明的藻酸鹽的制備還可以利用水抽提方法，在pH保持約2.3以上的膨脹步驟中，通過使高M(jìn)含量的藻酸鹽來源和水以1∶3-1∶20的比例在溫度20℃以上混合至少30分鐘，然后經(jīng)過濾從固體材料中分離溶解的藻酸鹽組分。所需M含量的藻酸鹽可通過用酸、鹽或醇沉淀從溶液中回收。
下述的實施例包括本發(fā)明方面的代表性例子。實施例并不意味著限制本發(fā)明的范圍，而是用作說明目的。除非另有說明，所有的部分和百分比等以重量計。
實施例1在來自不同Durvillea種D.potatorum(粉碎的)樣品1和D.antarctica(未粉碎的)樣品2的出發(fā)原料中以下表所示的量加入水，并在55℃下手工不時攪拌3.5小時。室溫保存過夜后，海藻在55℃下第二次抽提1小時，然后加入2.5ml甲醛，繼續(xù)抽提1小時。
預(yù)抽提步驟
懸浮液經(jīng)60目過濾器篩分，并且用過量的水洗滌兩次。然后，溶液用助濾劑經(jīng)真空漏斗過濾，又經(jīng)玻璃濾器的前濾器過濾。接著，讓溶液冷卻至10℃，并加入NaCl至0.5％濃度。其后，通過磁力攪拌滴加5.5M稀鹽酸至pH 1.8。形成白色沉淀。懸浮液在10℃保持30分鐘后，經(jīng)120目過濾布篩分，并通過手工擠壓，產(chǎn)生黃色漿狀質(zhì)量，擠壓后變成細(xì)纖維。在磁力攪拌下用固體堿灰中和至pH 7前，所有酸材料轉(zhuǎn)移到250ml容器中，并加入水至200ml。溶液再次經(jīng)0.8μm硝酸纖維素的濾膜過濾。濾液冷卻至10℃，并以比例1∶1用異丙醇沉淀。形成的纖維用70體積％的異丙醇洗滌一次，然后用100體積％的異丙醇第二次洗滌。纖維用鐵鉗取出，然后冷凍干燥。結(jié)果示出于下表中。
表
產(chǎn)物分析
產(chǎn)物經(jīng)NMR 400Hz測量的嵌段分布
下表示出根據(jù)本實施例的方法從其他海草樣品中制備的M的產(chǎn)量
實施例2將于1996年8月獲自Durvillea antarctica的樣品粉碎至大于70目的顆粒用作原料。在容器中稱重30g的干海藻。加入100ml 0.2MHCl，用水將此材料稀釋至500ml。攪拌數(shù)分鐘后，pH升高至2.3以上，加入酸，以使pH維持2.3以下(pH 1.8)。2分鐘后，加入2.5ml 0.2M HCl。當(dāng)pH在2.3以下恒定維持在1.8時，與用純水膨脹相比，此材料膨脹很小。膨脹1小時后，此材料經(jīng)60目濾布篩分，通過手工擠壓，并且轉(zhuǎn)移至容器中。其后，所得材料加入500ml水和50ml堿灰/氫氧化鈉溶液，并在55℃抽提1小時。此材料很快膨脹，并變成類似漿糊或紙漿狀粘稠。室溫下保存直至第二天。接著，此材料進(jìn)一步在55℃下抽提1小時，然后經(jīng)混合器粉碎?？傎|(zhì)量稱重至549g。將150g材料用700g水?dāng)嚢柘孪♂尅Ｔ诩尤胫鸀V劑后通過水吸真空裝置經(jīng)濾紙過濾溶液。濾液量測量為564g，冷卻至10℃。加入NaCl至0.5％，并滴加稀鹽酸(1∶1)調(diào)節(jié)pH至1.6。形成輕質(zhì)沉淀。然后，此材料經(jīng)120目濾布篩分，并小心通過手工擠壓。接著，將此材料用水懸浮，并在20℃下稀釋至體積約200ml。通過磁力攪拌器用固體堿灰粉末使溶液的pH中和至7。通過玻璃棒攪拌，將溶液用等部分的異丙醇溶液沉淀。沉淀的纖維用70體積％的異丙醇溶液洗滌一次。再用純100體積％的異丙醇洗滌。經(jīng)120目濾布篩分和擠壓后，用鐵鉗取出纖維，然后用真空冷凍干燥過夜。藻酸鹽產(chǎn)物稱重至1.04g，對應(yīng)于3.6重量％的Durvillea Antarctica原料。M含量為70％，以及經(jīng)NMR測量的藻酸鹽的嵌段分布如下。
實施例3通過在預(yù)抽提步驟中加入鹽，有可能進(jìn)一步增加甘露糖醛酸的含量。在20g于1996年8月從智利獲得的Durvillea antarctica(粉碎的粗顆粒＞70目)海藻中加入500m1水和一定量的NaCl，并在攪拌下經(jīng)Jar測試機以攪拌速度140rpm在20℃溫度下抽提2小時。在該溶液中加入鹽至如下表所示的濃度。
表
然后，此材料經(jīng)400目濾布篩分并通過手工擠壓。篩分溶液稱重，測量的pH如下表所示。
表
然后，篩分溶液用濾紙經(jīng)漏斗在真空(水吸泵)下過濾。過濾溶液的粘度用玻璃管測定，結(jié)果示于下表中。
表
濾液冷卻至15℃以下，并在磁力攪拌下向各個樣品中滴加5.5M鹽酸，直到pH達(dá)到1.8-2.0。形成纖維狀沉淀。然后，經(jīng)400目濾布篩分沉淀，并通過手工擠壓。接著，藻酸用水稀釋，并在攪拌下用固體堿灰中和至pH 6-7，直至完全溶解。冷卻該溶液，并用等部分的異丙醇沉淀。其后，用70體積％的異丙醇洗滌，再反復(fù)用純100體積％的異丙醇洗滌。利用鐵鉗拉出沉淀的纖維，并轉(zhuǎn)移至容器中，真空下冷凍干燥過夜。結(jié)果示于下表中，其中產(chǎn)量的計算是假定藻酸鹽沒有損失，并且所有的藻酸鹽都溶解在加入的水中。
表
實施例4
甘露糖醛酸在分離組分中的含量通過加入CaCl2而進(jìn)一步增加。原料為來自智利的D.antarctica，其被粉碎至大于70目的粗顆粒。預(yù)抽提步驟的量和條件示于下表中。在約140rpm攪拌下經(jīng)Jar測試儀進(jìn)行預(yù)抽提。
表
然后，將材料經(jīng)400目濾器篩分，并通過手工擠壓。把溶液加熱至約30℃，并用濾紙經(jīng)真空吸瓶過濾。
表
使溶液冷卻至10℃，加入氯化鈉至0.5％。然后，滴加5.5M HCl，小心磁力攪拌直至pH 1.8。形成白色沉淀。接著，將材料懸浮液保存30分鐘，并經(jīng)400目濾布篩分后，通過手工小心擠壓。材料為漿狀黃色質(zhì)量，擠壓后其變成細(xì)亮纖維。其后，把該酸材料轉(zhuǎn)移至250m1容器中，加入水至200ml，并在磁力攪拌下用固體堿灰中和至pH 7。接著，濾液冷卻至10℃，以比例1∶1加入100體積％的異丙醇，經(jīng)攪拌后沉淀。沉淀出大纖維。纖維用70體積％的異丙醇洗滌兩次，最后用100體積％的異丙醇洗滌。然后，用鐵鉗拉出纖維，并在真空下冷凍干燥過夜。結(jié)果示于表9和10中，其表明在預(yù)抽提步驟中不加鹽的情況下，甘露糖醛酸在藻酸鹽中的產(chǎn)量和含量增加，M為80％以上到最大91％，而在加鹽的情況下，其最大為95％。
表
表
實施例5將總共48頭平均初始體重為13.07kg(STD 1.98)、來自6窩的35-38天大的斷乳雜種[(Norwegian Landrac×Yorkshire)×Norwegian Landrace]仔豬分成4組用于試驗喂養(yǎng)研究，并且置于環(huán)境受控的養(yǎng)殖場中。開始時，在每個2.5m×2.5m欄中圈養(yǎng)4頭豬。飼養(yǎng)6周后，將豬轉(zhuǎn)移到15平米、帶有單獨飼養(yǎng)畜舍的欄中，每個欄有6頭豬。讓豬隨意取用食物和水。每周，將豬單獨稱重。使豬有4天的預(yù)備期，以適應(yīng)圍欄和標(biāo)準(zhǔn)的市售斷奶豬飼料。市售飼料(13％含水量)以對生長必需的維生素和礦物質(zhì)加強，并具有約18-19％的天然蛋白含量，14-15％的可消化蛋白含量，40-50％的淀粉含量以及約2.6％的天然脂肪含量。
在初始適應(yīng)市售飼料后，4個組每組12頭豬喂給不同的食物10周。研究的最后2周，豬全部喂食市售飼料。對照組中的豬喂食標(biāo)準(zhǔn)市售飼料，同時其他3組中的豬喂食已摻混了1.25％(w/w)藻酸鹽的同樣市售飼料。測試的3種藻酸鹽為1.Durvillea antarctica水提取物(89％M)，2.Durvillea antarctica標(biāo)準(zhǔn)提取物(63％M)，和3.Lessonianigrescen標(biāo)準(zhǔn)提取物(55％M)。這些藻酸鹽粉末的特征本征粘度和1HNMR光譜測定進(jìn)一步描述如下。
Durvillea antarctica標(biāo)準(zhǔn)提取物的本征粘度為7.0g/dl，這對應(yīng)于利用Mark Houwink方程式評估的重均分子量210,000道爾頓。Durvilla藻酸鹽樣品對甘露糖醛酸(M)單元的摩爾組分含量為0.63，而對于古洛糖醛酸(G)單元的摩爾組分含量為0.37。M與M連接F(MM)的組分含量為0.44。G與G連接F(GG)的組分含量為0.18。M與G連接F(MG)的組分含量等于G與M連接F(GM)的組分含量，為0.19。
Durvillea antarctica水提取物或Durvillea水提取物通過選擇性沉淀出M含量增加的藻酸鹽組分而獲得，具有本征粘度4.7g/dl，這對應(yīng)于利用Mark Houwink方程式評估的重均分子量85,000道爾頓。Durvilla水提取物藻酸鹽樣品對甘露糖醛酸(M)單元的摩爾組分含量為0.88，而對于古洛糖醛酸(G)單元的摩爾組分含量為0.12。M與M連接F(MM)的組分含量為0.80。G與G連接F(GG)的組分含量為0.04。M與G連接F(MG)的組分含量等于G與M連接F(GM)的組分含量，為0.08。
Lessonia nigrescens標(biāo)準(zhǔn)提取物的本征粘度為13.4g/dl，這對應(yīng)于利用Mark Houwink方程式評估的重均分子量370,000道爾頓。Lessonia藻酸鹽樣品對甘露糖醛酸(M)單元的摩爾組分含量為0.55，而對于古洛糖醛酸(G)單元的摩爾組分含量為0.45。M與M連接F(MM)的組分含量為0.35。G與G連接F(GG)的組分含量為0.25。M與G連接F(MG)的組分含量等于G與M連接F(GM)的組分含量，為0.20。
藻酸鹽本征粘度的測定利用公開在“作為固定化材料的藻酸鹽-一些分子和功能性質(zhì)的研究”(Martinsen，Anita)論文；NTH-Universityof Trondheim，1990中的方法進(jìn)行。根據(jù)本征粘度數(shù)據(jù)和Mark Houwink方程式來評估重均分子量。單體組成和序列排列的分析如下列文獻(xiàn)所述的通過Brucker 400 WM分光計由1H-NMR光譜法進(jìn)行Grasdalen等，“醛酸殘基在藻酸鹽中的組成和序列的NMR研究”，Carbohydrateresearch 1979；6823和H.Grasdalen“藻酸鹽的高場1H NMR光譜法序列結(jié)構(gòu)和鍵構(gòu)象”，Carbohydrate Research，1983；118255。
飼養(yǎng)兩周后，將豬免疫(在7周齡時)并且在4周后(在11周齡時)給予加強注射。所有豬肌內(nèi)免疫接種0.5ml的混合物，所述混合物為0.25ml含有馬皰疹病毒1(EHV)的Pneumabort K(102BY0002，F(xiàn)ortDodge Laboratories)和0.25ml人血清白蛋白(HSA)(200μg/ml)(Sigma)，皮下免疫接種0.5ml含有流感病毒A/Equi 1，A/Equi 2/M，A/Equi2/F(EIV)的Prevacum F(027021E，Hoechst Roussel Vet，Germany)和1.0ml含有白喉毒素(30Lf/ml)和破傷風(fēng)毒素(7.5Lf/ml)的白喉/破傷風(fēng)疫苗(DT9169al，SBL Vaccin AB，Stockholm)。
針對人血清白蛋白(HSA)(Sigma Chemical Industries，USA)和白喉毒素(DIF)(National Institute of Public Health)的特異性抗體通過被動血凝反應(yīng)測試方法進(jìn)行測定(Avrameas等1969)。所測試的最低稀釋度為1∶8。未顯示抑制的血清所給出的滴度為4，用于統(tǒng)計學(xué)計算。抗體滴度值被log2轉(zhuǎn)化以使分布標(biāo)準(zhǔn)化。
以兩周間隔采集血樣，用于血清學(xué)，血液學(xué)，以及吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能表征。分離血清并儲存在-20℃直至處理。在早晨采集穩(wěn)定的(肝素化的和EDTA)血樣并且立即加以分析。在Norwegian Schoolof Veterinary Science，Oslo的臨床中心實驗室(Central ClinicalLaboratory)分析血樣(Technicon H-1)。總的白血細(xì)胞計數(shù)(WBC×109/L)，單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞的數(shù)目(×109/L)通過電子方法測定，并且對淋巴細(xì)胞的數(shù)目和淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞的相對數(shù)(％)進(jìn)行了測定。對總紅血細(xì)胞計數(shù)(RBC×1012/L)，平均細(xì)胞體積(MCV fL)和血紅蛋白(HGB g/L)進(jìn)行測定，并且對血球密度(HCT L/L)進(jìn)行評估。
粒細(xì)胞在血液中的吞噬活性利用Phagotest(Orpegen Pharma，Heidelberg)，遵照操作手冊進(jìn)行分析。在加入20μl預(yù)冷的穩(wěn)定和調(diào)理的FITC-標(biāo)記的大腸桿菌懸浮液之前，將肝素化(15IU/ml)的全血混合，等分(100μl)在5ml小瓶(Falcon)的底部，并在冰上溫育10分鐘(測試試劑盒)。振蕩所有小瓶，并使測試樣品在37℃的水浴中溫育10分鐘，而對照樣品仍放置在冰上。然后，同時將所有樣品置于冰上，以終止吞噬作用，并向各樣品中加入100μl的冰冷淬滅溶液，在漩渦混合器上混合。接著，樣品中加入3ml洗滌液，混合，并將細(xì)胞離心(250×g，5分鐘，4℃)。在加入200μl的DNA染色液之前，重復(fù)該洗滌程序。把樣品混合，并在冰上溫育10分鐘，然后利用蘭-綠激發(fā)光(488nm)通過流式細(xì)胞儀(FACScanTM，LYSISTM軟件)分析細(xì)胞。將具有預(yù)先形成的吞噬作用的細(xì)胞的百分比進(jìn)行分析。
氧化爆發(fā)活性的評價利用Phagoburst(Orpegen Pharma，Heidelberg)遵照操作手冊通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行。在加入20μl預(yù)冷的穩(wěn)定和調(diào)理的大腸桿菌懸浮液之前，將肝素化(15IU/ml)的全血混合，等分(100μl)在5ml小瓶(Falcon)的底部，并在冰上溫育10分鐘(測試試劑盒)。每條測試動物中包括3個對照瓶，其中一個瓶中加入20μl的洗滌液(陰性對照)，另一個瓶中加入20μl的趨化肽fMLP工作液(“低對照”)以及最后一個瓶中加入20μl的佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)工作液(“高對照”)。將所有小瓶混合，并使測試樣品在37℃的水浴中溫育10分鐘。然后，在所有樣品中加入20μl的底物溶液，充分混合后在37℃的水浴中繼續(xù)溫育10分鐘。接著，同時從水浴中取出全部樣品，裂解全血，并用2ml預(yù)溫?zé)岬牧呀庖汗潭?，混合后室溫下溫?0分鐘。樣品離心(250×g，5分鐘，4℃)后，加入3ml洗滌液洗滌一次(250×g，5分鐘，4℃)。傾倒上清液，加入200μl的DNA染色液，把樣品混合，并在冰上溫育10分鐘(避光)。利用蘭-綠激發(fā)光(488nm)通過流式細(xì)胞儀(FACScanTM，LYSISTM軟件)分析細(xì)胞。分析已經(jīng)產(chǎn)生活性氧代謝物的細(xì)胞的百分比及其平均熒光強度。
圖1以飼養(yǎng)時間為函數(shù)顯示4組豬的平均重量。在Durvillea水提取物組和Lessonia組中的豬與對照組相比時發(fā)現(xiàn)有顯著的重量增加。3周后，重量差異在統(tǒng)計學(xué)上被視為是顯著性的，但是，圖1顯示重量增加的趨勢，這與1周后Durvillea水提取物組和Lessonia組較對照組的體重增加更快相一致。雖然Durvillea水提取物組和對照組之間實際重量差異不如對Durvillea水提取物組和Lessonia組所見的那么顯著，但應(yīng)該注意的是，Durvillea組的平均重量始終高于對照組。對照組中單個豬在重量上與3組喂食含藻酸鹽的飼料的豬個體比較具有較高的變異性，這提示對照組中的一些個體具有的免疫反應(yīng)減少，因為它們處理創(chuàng)傷和/或應(yīng)激的能力較小。為了讓動物處理疾病應(yīng)激，豬中的激素氫化可的松使得營養(yǎng)物遠(yuǎn)離肌肉和脂肪組織。
圖2-4顯示通過分析血液中的總白血球，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而獲得的數(shù)據(jù)。雖然在統(tǒng)計學(xué)上是不顯著的，但圖2顯示Durvillea水提取物組的總白細(xì)胞數(shù)高于對照組。Durvillea水提取物組與對照組比較，Durvillea水提取物組中觀察到的白血球數(shù)增加是由于分別在6周和10周后單核細(xì)胞(圖3)和淋巴細(xì)胞(圖4)的顯著增加。與Durvillea水提取物組比較，Lessonia組中的淋巴細(xì)胞顯示增加延遲(第10周)。對采集自Durvillea水提取物組(和對照組)的血中的吞噬活性也進(jìn)行分析，測定結(jié)果顯示，Durvillea水提取物組較對照組在第4周時有顯著增加，如圖5所示。圖6所示的氧化爆發(fā)反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了在第4周和第8周，以Durvillea水提取物喂食的豬較對照具有更高水平的吞噬反應(yīng)。在第4周和第8周時Durvillea水提取物組較對照組的持續(xù)的氧化爆發(fā)反應(yīng)增加是顯著的，因為與呼吸爆發(fā)相關(guān)的主要化學(xué)過程對殺死一些類型的細(xì)菌是必要的，并且顯示吞噬作用的效果提高。
圖7顯示對免疫接種的免疫反應(yīng)。對注射人血清白蛋白試驗疫苗的免疫反應(yīng)(圖7)顯示在第8周時Durvillea水提取物組和Lessonia組較對照組的免疫反應(yīng)有顯著提高。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動物，鳥類和爬行動物的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的甘露糖醛酸(M)含量至少為40％的藻酸鹽和可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的材料，其中所述M含量為50％-70％。
3.權(quán)利要求1的材料，其中所述M含量為70％-80％。
4.權(quán)利要求1的材料，其中所述M含量為80％-99.9％。
5.權(quán)利要求2的材料，其中所述藻酸鹽來自Lessonia海草，Durvillea海草或Laminaria海草。
6.權(quán)利要求3的材料，其中所述藻酸鹽來自Durvillea海草。
7.權(quán)利要求4的材料，其中所述藻酸鹽來自細(xì)菌或Durvillea水提取物。
8.權(quán)利要求1的材料，其中所述材料為(i)藥用，獸用或類藥物營養(yǎng)品固體劑量形式或液體制劑，(ii)固體，半固體或液體食物，或(iii)固體或液體營養(yǎng)補劑。
9.一種刺激哺乳動物，鳥類和爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，其包括給所述哺乳動物，鳥類和爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽和可接受的載體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述M含量為50％-70％。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述M含量為70％-80％。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述M含量為80％-99.9％。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述可攝取材料為(i)藥用，獸用或類藥物營養(yǎng)品固體劑量形式或液體制劑，(ii)固體或液體食物，或(iii)固體或液體營養(yǎng)補劑。
14.一種哺乳動物，鳥類和爬行動物的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少為80％的藻酸鹽和可接受的載體，其中所述藻酸鹽的制備方法為將Durvillea海草混合并膨脹在水中，在20℃以上的溫度維持pH在約2.3以上至少30分鐘，從混合物中分離溶解的組分，以及通過用酸，鹽或醇沉淀從溶解的組分中回收M含量至少為80％的所述藻酸鹽。
15.權(quán)利要求14的材料，其中所述材料為(i)藥用，獸用或類藥物營養(yǎng)品固體劑量形式或液體制劑，(ii)固體或液體食物，或(iii)固體或液體營養(yǎng)補劑。
16.一種刺激哺乳動物，鳥類和爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，其包括給所述哺乳動物，鳥類和爬行動物口服施用免疫刺激量的權(quán)利要求14的免疫刺激材料。
17.一種通過免疫刺激來刺激哺乳動物，鳥類和爬行動物體重增加的方法，其包括給所述哺乳動物和爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽和可接受的載體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述M含量為50％-70％。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述M含量為70％-80％。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述M含量為80％-99.9％。
21.一種哺乳動物，鳥類和爬行動物的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少為40％的藻酸鹽。
22.權(quán)利要求21的材料，其中所述M含量為50％-70％。
23.權(quán)利要求21的材料，其中所述M含量為70％-80％。
24.權(quán)利要求21的材料，其中所述M含量為80％-99.9％。
25.一種刺激哺乳動物，鳥類和爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，其包括給所述哺乳動物，鳥類和爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述M含量為50％-70％。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述M含量為70％-80％。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述M含量為80％-99.9％。
29.一種哺乳動物，鳥類和爬行動物的免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少為40％的藻酸鹽，前提條件是所述藻酸鹽或是合成制備的或是分離自海草或細(xì)菌來源。
30.權(quán)利要求29的材料，其中所述M含量為50％-70％。
31.權(quán)利要求29的材料，其中所述M含量為70％-80％。
32.權(quán)利要求29的材料，其中所述M含量為80％-99.9％。
33.權(quán)利要求29的材料，其進(jìn)一步包括可接受的載體。
34.權(quán)利要求29的材料，其中所述材料為(i)藥用，獸用或類藥物營養(yǎng)品固體劑量形式或液體制劑，(ii)固體，半固體或液體食物，或(iii)固體或液體營養(yǎng)補劑。
35.一種刺激哺乳動物，鳥類和爬行動物的免疫系統(tǒng)的方法，其包括給所述哺乳動物，鳥類和爬行動物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少為40％的藻酸鹽，前提條件是所述藻酸鹽或是合成制備的或是分離自海草或細(xì)菌來源。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述材料進(jìn)一步包括可接受的載體。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述M含量為50％-70％。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述M含量為70％-80％。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述M含量為80％-99.9％。
40.權(quán)利要求35的方法，其進(jìn)一步包括可接受的載體。
41.權(quán)利要求35的方法，其中所述材料為(i)藥用，獸用或類藥物營養(yǎng)品固體劑量形式或液體制劑，(ii)固體，半固體或液體食物，或(iii)固體或液體營養(yǎng)補劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種哺乳動物、鳥類以及爬行動物的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少為40％的藻酸鹽和可接受的載體。
文檔編號A23L1/30GK1599615SQ02823946
公開日2005年3月23日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者奧拉夫·加塞羅德, 阿爾內(nèi)·德森 申請人:Fmc生物高聚物股份有限公司