專利名稱：制造維生素e中間體的方法
維生素E的主要商業(yè)化形式是其乙酸酯衍生物，例如借助乙酐，經(jīng)(全外消旋(all-rac))-α-生育酚乙?；铣伞?br> (全外消旋)-α-生育酚的工業(yè)合成基于三甲基氫醌(TMHQ)與異植醇、植醇或其衍生物如植基鹵化物的縮合。然而，TMHQ通常由昂貴的2，3，6-三甲基苯酚制得，且TMHQ與異植醇、植醇或其衍生物如植基鹵化物縮合必須使用酸性催化劑。
另外，通過使三甲基氫醌-1-單乙酸酯(TMHQ-1-MA)與異植醇或其等價物縮合可以合成(全外消旋)-α-生育酚乙酸酯。用于這一替換合成的TMHQ-1-MA可由便宜得多的α-異佛爾酮經(jīng)酮基異佛爾酮和三甲基氫醌二乙酸酯(TMHQ-DA)而得到，后者必須要經(jīng)歷完全區(qū)域選擇性單-脫乙酰作用，然而該完全區(qū)域選擇性單-脫乙酰作用用文獻(xiàn)中已知的方法(例如，用含水堿處理)很難完成。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用脂酶使TMHQ-DA發(fā)生酶催單皂化作用可將TMHQ-DA完全區(qū)域選擇性地轉(zhuǎn)化成TMHQ-1-MA。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將脂酶固定在固態(tài)載體材料上。所述載體材料可以是疏水性載體，例如象由Membrana GmbH，Obernburg(德國)提供的ACCUREL MP1001這樣的聚丙烯載體。然而，不同性質(zhì)的載體，即常于酶的固定化作用的堿性催化劑載體CELITE[化學(xué)組成87％SiO2，0.9％CaO，6.1％Al2O3，1.6％Fe2O3，1.6％Na2O+K2O；pH(10％懸浮液，25℃)＝8.5]，不能使固定化的酶發(fā)揮出令人滿意的性能。
適合于本發(fā)明的脂酶包括屬于EC3.1.1.3類酶的那些。
在可由市場購到的各種脂酶中，尤其已證明下列脂酶對本發(fā)明是有效的Thermomyces lanuginosus脂酶(TLL)；米黑毛霉(Mucor mihei)脂酶(MML)；產(chǎn)堿桿菌屬數(shù)種(Alcaligenes spec.)脂酶(ASL)；皺落假絲酵母(Candida rugosa)脂酶(CRL)；Candida antartica(級分B)脂酶(CAL(B))和假單胞菌屬數(shù)種(Pseudomonas spec.)脂酶(PSL)，例如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂酶(PFL)。優(yōu)選的脂酶是PSL，PFL和TLL；特別優(yōu)選TLL。
有利的是本發(fā)明的酶催單皂化作用在疏水性溶劑中進(jìn)行，例如在1-甲基-2-吡咯烷酮中，或尤其是在醚類溶劑如叔丁基甲基醚、丁基醚、甲基2-甲基-2-丁基醚等中，特別優(yōu)選叔丁基甲基醚。
該醚類溶劑中可方便地加入約0.01-99.5vol％，優(yōu)選約0.03-20vol％，最優(yōu)選約0.09-5vol％的水或緩沖液如磷酸鹽緩沖液。乙醇至多可以以1％的濃度存在。
《四面體》(Tetrahedron)56(2000)317-321中尤其描述了在水存在下借助叔丁基甲基醚中的游離酶PSL將2-甲基-1，4-二乙酰氧基萘選擇性單皂化成相應(yīng)1-乙酰氧基-4-羥基化合物。然而，在高達(dá)185小時的時間內(nèi)重復(fù)此試驗時，并未發(fā)現(xiàn)獲得一致的結(jié)果。此外，在相同反應(yīng)條件下，在高達(dá)約300小時的時間內(nèi)用游離酶PSL處理TMHQ-DA時，初始反應(yīng)速率僅約為1/3。相反的是在小于100小時的時間內(nèi)借助固定化的PSL，TMHQ-DA的單皂化作用導(dǎo)致幾乎定量的轉(zhuǎn)化，并且用固定化的PFL和固定化的TLL得到了相似的結(jié)果。
本發(fā)明中單皂化的反應(yīng)速率通常隨著反應(yīng)溫度的增加而增加。當(dāng)然最高反應(yīng)溫度由溶劑的沸點所限制(在叔丁基甲基醚的情況下為55℃)。但是在加壓下進(jìn)行酶催單皂化作用時，還可達(dá)到更高的反應(yīng)溫度。就一些脂酶而言，尤其是TLL，溫度可升高到約60-80℃。
因此，在溫度約為4-80℃的范圍內(nèi)，本發(fā)明的酶催單皂化作用能夠容易地完成，優(yōu)選的溫度范圍是約20-75℃。
游離和固定化的酶與底物(TMHQ-DA)的比例可在較寬的范圍內(nèi)變動，方便的是約0.001-10g/g，優(yōu)選約0.01-0.2g/g。
底物(TMHQ-DA)與溶劑的比例同樣可在較寬的范圍內(nèi)變動，方便的是約0.001-100g/g，優(yōu)選約0.01-0.8g/g。
當(dāng)將酶固定到合適的載體上時，本發(fā)明的單皂化作用可有利地在例如固定床反應(yīng)器或連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器中連續(xù)而不是分批地進(jìn)行。
如前所述，例如通過與異植醇的反應(yīng)可以將由本發(fā)明的酶催單皂化得到的TMHQ-1-MA轉(zhuǎn)化成(全外消旋)-α-生育酚乙酸酯。如果粗產(chǎn)物中有(全外消旋)-α-生育酚，該(全外消旋)-α-生育酚可根據(jù)需要通過乙酰化，例如借助乙酐，轉(zhuǎn)化成其乙酸酯。
下面實施例更具體地說明本發(fā)明但決不意欲限制其范圍。實施例1在玻璃容器中用游離脂酶進(jìn)行分批試驗將5ml叔丁基甲基醚、50μl水、1.67mg游離酶[脂酶來源于FlukaChemie AG(Buchs，瑞士)]和80mg TMHQ-DA[粗產(chǎn)物，即由酮基異佛爾酮的重排-芳構(gòu)化產(chǎn)生且由約90％TMHQ-DA和約9％三甲基兒茶酚二乙酸酯(TMC-DA)組成的物質(zhì)]加入到容器中。容器中液面上空間用氮沖洗，將該容器放到50℃的恒溫箱中，以700rpm攪拌使其充分混勻。為了取樣，打開容器，取出500μl，液面上空間用氮沖洗，然后再次封閉容器。將樣品稀釋至底物或產(chǎn)物的濃度為0.5-1.0wt％，并且用GC分析。
表16、12、24或48小時后各種脂酶和TLL各自的轉(zhuǎn)化率(E/S＝1/48，CTMHQ-DA＝0.019g/g)
實施例2用固定化酶進(jìn)行的分批試驗(a)由Membrana GmbH，Obernburg提供的名為ACCURELMP1001的載體的尺寸為400-1000μm。固定化之前過篩選擇尺寸為1000μm的載體粒子。
為了固定化，將1.7ml乙醇中的500mg ACCUREL MP1001與溶解于2.5ml磷酸鉀緩沖液(KH2PO4，pH7，20mM)中的100mg脂酶粉混合，室溫下在搖動器上搖動過夜。過濾收集固定化脂酶，用相同的緩沖液洗滌三次，并在室溫下干燥幾小時。該固定化酶用前儲存在4℃。
用修改的Lowry方法來測定固定化蛋白的量。
(b)將10ml叔丁基甲基醚、100μl水、20mg固定化酶(13％酶/87％ACCUREL載體)[脂酶是Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，德國)提供的篩選試劑盒的一部分，稱為“手性酶(Chirazyme)”]和160mg TMHQ-DA加入到容器中。容器液面上空間用氮沖洗。將該容器放到33℃的恒溫箱中，以700rpm攪拌使其充分混勻。為了取樣，打開容器，取出500μl，用氮沖洗液面上空間，再次封閉容器。接著將樣品稀釋至底物或產(chǎn)物的濃度為0.5-1.0wt％，并用GC分析。
表2用手性酶(chirazyme)在96小時后純TMHQ-DA的轉(zhuǎn)化率(EI/S＝1/8，CTMHQ-DA＝0.019g/g)
與用純TMHQ-DA比較，使用粗制TMHQ-DA(見實施例1)導(dǎo)致相對轉(zhuǎn)化率范圍為95-100％。表3固定化PSL和TLL間的比較(EI/S＝1/2，CTMHQ-DA＝0.014g/g，溫度50℃，其它條件見上，對兩種酶的選擇性＞99.5％)
實施例3在固定床反應(yīng)器中的連續(xù)酶催皂化在固定床反應(yīng)器中于40℃進(jìn)行TMHQ-DA到TMHQ-1-MA的連續(xù)皂化[900mg固定在ACCUREL MP1001上的TLL；床高73mm；床直徑12.0mm；床密度0.11g/ml；床容積8.1ml；載體直徑0.7mml，底物流量水飽和叔丁基甲基醚中TMHQ-DA的濃度為0.01g/g；叔丁基甲基醚的質(zhì)量流量＝0.080mg/min；TMHQ-DA的質(zhì)量流量＝0.85g/d。
固定化的TLL至少可保持224小時的穩(wěn)定性和活性；在TMHQ-DA到TMHQ-1-MA的皂化作用中TLL的選擇性在100％的轉(zhuǎn)化率下幾乎為100％；并且甚至在長停留時間下或供入低濃度TMHQ-DA溶液時，TMHQ-1-MA到TMHQ的皂化作用幾乎沒有發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種三甲基氫醌二乙酸酯高選擇性地轉(zhuǎn)化為三甲基氫醌-1-單乙酸酯的方法，包括借助脂酶將三甲基氫醌二乙酸酯進(jìn)行酶催單皂化作用。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將脂酶固定在固態(tài)載體材料上。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中脂酶是假單胞菌屬數(shù)種(Pseudomonas spec.)脂酶，特別是熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂酶或Thermomyces lanuginosus脂酶。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中脂酶是Thermomyces lanuginosus脂酶。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中酶催單皂化作用在疏水性溶劑中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中將叔丁基甲基醚用作溶劑。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中酶催單皂化作用連續(xù)進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，還包括將產(chǎn)生的三甲基氫醌-1-單乙酸酯通過與異植醇或其等價物反應(yīng)直接或根據(jù)需要隨后進(jìn)行脫乙酰化而轉(zhuǎn)化成(全外消旋)-α-生育酚或其乙酸酯。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)在加壓下進(jìn)行。
10.一種生產(chǎn)(全外消旋)-α-生育酚或其乙酸酯的方法，該方法包括借助脂酶將三甲基氫醌二乙酸酯轉(zhuǎn)化為三甲基氫醌-1-單乙酸酯，并且使產(chǎn)生的三甲基氫醌-1-單乙酸酯與異植醇或其等價物縮合，任選隨后進(jìn)行脫乙?；饔谩?br> 全文摘要
利用脂酶由選擇性酶催單皂化作用可以從三甲基氫醌二乙酸酯制備三甲基氫醌－1－單乙酸酯。把酶固定在固態(tài)載體材料上可增加酶的活性。當(dāng)將酶固定到合適的載體上時,單皂化作用可連續(xù)而不是分批地進(jìn)行。通過與異植醇或其等價物反應(yīng)可以將三甲基氫醌－1－單乙酸酯直接或根據(jù)需要隨后進(jìn)行乙酰化而轉(zhuǎn)化成(全外消旋)－α－生育酚或其乙酸酯。
文檔編號C12P7/62GK1373225SQ0210508
公開日2002年10月9日 申請日期2002年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者W·邦拉特, D·艾森克雷特澤爾, V·昂約拉斯, R·卡格, T·內(nèi)特舍爾, M·施耐德 申請人:羅切維他命股份公司