專利名稱：干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種蛋白編碼序列，特別是一種干酪乳桿 菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列。
背景技術(shù)：
益生菌是指活的微生物，通過攝入充足的數(shù)量，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且經(jīng) 過論證的功能性健康益處，如可通過調(diào)整人體胃腸道內(nèi)多種微生物群落，拮抗致病微生物， 從而改善腸道環(huán)境，可防治消化道疾病，并克服了抗生素應(yīng)用帶來的醫(yī)源性菌群失調(diào)癥等。 經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，益生菌的涵義日趨完善，益生菌數(shù)量及保健功效方面也都得到進(jìn)一步 充實(shí)，具有益生功效的新菌株不斷地被篩選和鑒定。干酪乳桿菌就是常見的用于微生物制 劑的益生性乳酸菌菌種之一。干酪乳桿菌分布非常廣泛，多見于牛乳、奶酪、酸奶等乳制品 中。干酪乳桿菌Zhang (Lactobacillus casei Zhang)是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與 工程"教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙地區(qū)、蒙古國和新疆地區(qū)牧民家庭以傳統(tǒng)方法制作的自然 發(fā)酵酸馬奶中分離鑒定的眾多乳桿菌中篩選得到。該菌株具有益生菌的特性及益生功效， 是益生菌開發(fā)的潛在優(yōu)良菌種。 細(xì)菌中的脂酶能夠催化三脂酰甘油酯鍵的水解反應(yīng)釋放出短鏈脂肪酸，從而改酵 食品，特別是半硬質(zhì)干酪的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。該酶在干酪成熟的過程中可以維持較高的活力，催 化的水解反應(yīng)能夠水解乳脂肪，生成丁酸、己酸及辛酸等多種短鏈脂肪酸。許多嗜熱和嗜溫 型乳桿菌在發(fā)酵的過程中都檢測到具有脂酶活性。干酪乳桿菌Zhang基因組中編碼的脂酶 Est C(Esterase C)蛋白的氨基酸序列在N_端缺乏信號肽序列，屬于胞內(nèi)酶；編碼基因位 于一個(gè)由轉(zhuǎn)錄激活子和IIA、 IIB、 IIC、 IID四個(gè)糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成的負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)乙?；?糖類的PTS操縱子上游，這個(gè)操縱子與枯草芽孢桿菌的lev操縱子基因組成結(jié)構(gòu)類似。研 究也證明位于脂酶Est C這個(gè)基因下游的PTS操縱子與代謝、攝取酯化糖類有關(guān)聯(lián)。在干 酪乳桿菌Zhang的耐酸研究中，發(fā)現(xiàn)脂酶Est C是可以被較低的pH值環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)，與正 常發(fā)酵條件下脂酶Est C的表達(dá)量相比有上升趨勢，這也許暗示脂酶Est C可以水解特定 底物的糖類，幫助細(xì)胞適應(yīng)高酸性環(huán)境。 本發(fā)明參考其它菌株Est C基因序列，克隆測序獲得干酪乳桿菌 Zhang (Lactobacillus casei Zhang) Est C基因序歹lJ，并對不同物種Est C基因的編碼序列 進(jìn)行相似性比較，為今后開展Est C與應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究工作提供基礎(chǔ)資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白Est C編碼序列，該序列是干 酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序 列FM177140的核酸序列有99%的相似性。 具體地，本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中的熱休克蛋白Est C的編碼序列， 該序列的核苷酸序列為SEQ ID NO:l，
4
本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的Est C蛋白，該蛋白的氨基 酸序列為SEQ ID NO :2。 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或 其活性片段，或其活性衍生物。 本發(fā)明還提供了一種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C基因的克隆和測序方法。該 方法包括步驟(l)PCR引物設(shè)計(jì)與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提?。?3)目的片斷的PCR 擴(kuò)增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆 與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物為SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID N0:4(反向)， 其序列信息如下 SEQ ID NO :3 :5' -TAATGACGGTTATTCGTGC-3，
SEQ ID NO :4 :5， -TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3，
具體地，各個(gè)步驟的詳細(xì)內(nèi)容如下
(l)PCR引物設(shè)計(jì)與合成 PCR引物對的正向引物和反向引物信息如下
SEQ ID NO :3(正向):5， TAATGACGGTTATTCGTGC-3，;
SEQ ID NO :4(反向):5， -TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3，;
(2)干酪乳桿菌DNA的提取 總DNA的提取參照QIAGEN的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作步驟 如下 細(xì)菌培養(yǎng)液5ml， 10， OOOrpm離心1分鐘，棄上清。加入適量溶菌酶溶液，使其最終 濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘。加入20 蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混 勻。加220iU緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220 無水乙醇，充分振 蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12， OOOrpm離心30秒。加500 y 1去蛋白液GD， 12， OOOrpm 離心30秒，棄廢液。加700 ii 1漂洗液GW， 12， OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500 y 1漂洗 液GW， 12， OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12， OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫 數(shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200 ill洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘， 12， OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12， OOOrpm離 心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。
(3)目的片斷的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系0. 2 ii 1 Taq聚合酶(5U/ ii 1， Takara Tokyo, J即an) ， 2. 5 ii 1
10 X PCR緩沖液(without Mg2+) ， 2 ii 1 dNTP (2. 5mM each) ， 2 ii 1 MgCl2 (25mM) ， 0. 2 ii 1正向
引物(50pM) ，0. 2ii 1反向引物(50pM) ， 1 ii 1基因組DNA和17. 4ii 1 ddH20.PCR擴(kuò)增條件97。C變性5min ;95。C 30s，55。C 30s，72。C 30s，如此進(jìn)行35次循環(huán);
72。C延伸10min，4。C保存。 (4)瓊脂糖凝膠電泳檢測 取PCR產(chǎn)物5iU，同1 iU上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一 孔中加入5iU DL2000 Marker, 120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng) GDS-8000 System (UVP Biomaging Systems)上留取照片。
(5)目的基因片斷回收與鑒定
片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行。具體操作步驟如下
在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1. 5ml的離心管中。 膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化 后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13， 000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將 吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700 ill漂洗液PW， 13， OOOrpm，離心30秒，倒 掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。在吸附柱中加入500iU漂洗液PW， 13， OOOrpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13， OOOrpm離心 2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個(gè) 干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室 溫放置2分鐘。13， OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。
(6)目的基因片斷的克隆與鑒定
(6. 1)感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種
到100ml LB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)2-3小時(shí)(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D6。。達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)
將菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘。4， 000rpm，4t:離心10分鐘，回
收細(xì)菌沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0. 1M CaC^懸浮細(xì)菌沉淀。冰浴10-15
分鐘后于4，000rpm，4。C離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入4ml 0. 1M CaC^懸浮細(xì)菌沉淀。
該細(xì)胞可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。加甘油至終濃度為15% _20%，混勻，每份分裝成100 iU于
1.5ml EP管中，凍存于-7(TC冰箱中。 (6. 2)回收片段同T載體的連接 連接用TaKaRa pMD 18-T Vector試劑盒。 具體操作過程如下 首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液 pMD 18-T Vector (50ng/ii 1) 0. 5 ii 1 DNA 20-40ng Solution l(試劑盒自帶溶液) 5 iU 力口 dH20至 10 ii 1 Total 10 ii 1 然后將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
(6.3)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細(xì)胞加入 10 ii 1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入 400 ii 1液體LB培養(yǎng)基，37。C復(fù)活50分鐘后取100 yl鋪于LB平板上，平板含0. 1 (V/V)的 氨節(jié)青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100ii g/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)10-15小 時(shí)。白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒。
(6. 4)轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng) 用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入 在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物同Marker — 起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑
6取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40ml含0. 1% (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體 培養(yǎng)基中，37 °C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥蘸蜏y序。
(7)測序 經(jīng)過測序得到SEQ ID NO :1所示的編碼脂酶Est C的核苷酸序列。 本發(fā)明提供的新的干酪乳桿菌Zhang中的脂酶Est C編碼基因在乳桿菌處于應(yīng)激
環(huán)境中有著非常重要的作用。對這個(gè)基因進(jìn)行克隆和測序，有益于乳酸菌益生菌株的篩選、
遺傳改造和應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例用于對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1 干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C編碼基因的克隆和測序。 本發(fā)明測序得到的片斷經(jīng)過相似性比較為脂酶Est C編碼基因的全序列。 1、實(shí)驗(yàn)方法 1. IPCR引物設(shè)計(jì)與合成PCR引物根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列(Accession No :FM177140)采用Primer
5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID
N0:3(正向)和SEQ ID NO :4(反向)，序列信息如下 SEQ ID NO :3(正向):5， -TAATGACGGTTATTCGTGC—3，; SEQ ID NO :4(反向):5， -TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3，; 1. 2干酪乳桿菌DNA的提取。 總DNA的提取參照QIAGEN的細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作步驟 如下 細(xì)菌培養(yǎng)液5ml， 10， OOOrpm離心1分鐘，棄上清，加入適量溶菌酶溶液，使其最終 濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理50分鐘，加入20 蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混勻。 加220 ii 1緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220 y 1無水乙醇，充分振蕩 15秒。將溶液加入吸附柱中，12， OOOrpm離心30秒。加500 y 1去蛋白液GD， 12， OOOrpm離 心30秒，棄廢液。加700 ii 1漂洗液GW， 12， OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500 y 1漂洗液 GW， 12， OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12， OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分 鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加200 1洗脫緩沖液TE，室溫置4分鐘，12， OOOrpm離 心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12， OOOrpm離心2分鐘，即 得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。
1. 3目的片斷的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系0.2iU Taq聚合酶(5U/ii 1 ， Takara Tokyo, J即an)， 2. 5ii IIOXPCR緩沖液(without Mg2+) ， 2 ii 1 d證(2.5mM each) ， 2 ii 1 MgCl2 (25mM) ， 0. 2 ii 1 正向引物(SEQ ID NO :3) (50pM)，0. 2ii 1反向引物(SEQ ID NO :4) (50pM) ， 1 y l基因組DNA 禾口 17. 4ii 1 ddH20. PCR擴(kuò)增條件97。C變性5min ;95。C 30s，55。C 30s，72。C 30s，如此進(jìn)行35次循環(huán); 72。C延伸10min，4。C保存。
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1. 4瓊脂糖凝膠電泳檢測 取PCR產(chǎn)物5iU，同1 上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一 孔中加入5iU DL2000Marker， 120V/em電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng) GDS-8000System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。
1. 5目的基因片斷回收與鑒定 片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行。
在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1. 5ml的離心管中。 膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化后 的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將吸附柱放 入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700 iil漂洗液PW， 13， OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。在吸附柱中加入500 iil漂洗液PW， 13， OOOrpm 離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13， OOOrpm離心2分鐘，盡 量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個(gè)干凈的離 心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分 鐘。13， OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。
1. 6目的基因片斷的克隆與鑒定
1. 6. 1感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種 到100ml LB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)3小時(shí)(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D6。。達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)將 菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴15分鐘。4， 000rpm，4t:離心10分鐘，回收細(xì)菌 沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0. 1M CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀。冰浴15分鐘后于 4，000rpm，4。C離心IO分鐘，回收細(xì)菌沉淀。加入4ml 0. 1M CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀。該細(xì)胞可 直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。加甘油至終濃度為15% _20%，混勻，每份分裝成100 iU于1. 5ml EP 管中，凍存于-7(TC冰箱中。
1. 6. 2回收片段同T載體的連接 連接用TaKaRa pMD 18-T Vector試劑盒。操作過程如下 首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液 pMD 18-T Vector (50ng/ii 1) 0. 5 ii 1 DNA 20-40ng Solution l(試劑盒自帶溶液) 5 iU 力Q dH20至 10 ii 1 Total 10 ii 1 將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。 1.6. 3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細(xì)胞加入 10 ii 1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入 400 ii 1液體LB培養(yǎng)基，37。C復(fù)活50分鐘后取100 yl鋪于LB平板上，平板含0. 1 (V/V)的 氨芐青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100ii g/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)15小時(shí)。 白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒。
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1. 6. 4轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng) 用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入 在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物同Marker — 起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑 取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40ml含0. 1% (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體 培養(yǎng)基中，37 °C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥蘸蜏y序。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過測序得到SEQ ID NO : 1所示編碼Est C基因的核苷酸序列。
3、結(jié)論 克隆測序得到的Est C基因的全長核苷酸序列。 實(shí)施例2 :干酪乳桿菌Zhang中Est C基因的序列信息與生物信息學(xué)分析。
本發(fā)明新的干酪乳桿菌Est C全長CDS的長度為780bp，詳細(xì)序列見SEQ IDNO :1。 根據(jù)全長CDS推導(dǎo)出干酪乳桿菌Zhang中Est C的氨基酸序列，共173個(gè)氨基酸殘基，詳見 SEQ ID N0:2，在線預(yù)測(http:〃麗w. expasy. ch/tools/pi_tool. html)結(jié)果顯示，其分子 量為29107道爾頓，等電點(diǎn)(pi)為5. 98。 將干酪乳桿菌Est C相關(guān)的全長CDS序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在 GenBank的非冗余數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與已公布序列的 干酪乳桿菌Est C在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有99X的相似性。與其它乳酸菌如 酒酒球菌(Oenococcus oeni PSU-1)等編碼的Est C基因有78X的相似性。由此可見，Est C基因在干酪乳桿菌菌種間具有較高的保守性，在不同物種間可能具有特異性。
3、結(jié)論 通過上述操作，表明本發(fā)明得到了編碼干酪乳桿菌Zhang中的Est C蛋白的基因 序列及其氨基酸序列。
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權(quán)利要求
一種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C編碼序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140的核酸序列具有99％的相似性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的序列，其中干酪乳桿菌Zhang中的脂酶Est C的核苷酸序列為SEQ ID NO : 1。
3. —種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的脂酶Est C蛋白，該蛋白為SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
4. 權(quán)利要求3所述的蛋白，該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
5. —種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C基因的克隆和測序方法，該方法包括步驟(1)PCR引物設(shè)計(jì)與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提取；(3)目的片斷的PCR擴(kuò)增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物的正向引物為SEQID N0:3和反向引物為SEQ ID N0:4，其序列信息如下SEQ ID NO :3 :5' -TAATGACGGTTATTCGTGC-3，SEQ ID NO :4 :5， -TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3，。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中干酪乳桿菌DNA的提取步驟如下細(xì)菌培養(yǎng)液5ml， 10， OOOrpm離心1分鐘，棄上清；加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘；加入20 蛋白酶K溶液，其濃度為20mg/ml，混勻；加220 ii 1緩沖溶液GB，振蕩15秒；7(TC放置30分鐘；加入220 y 1無水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12， OOOrpm離心30秒；加500 去蛋白液GD， 12， OOOrpm離心30秒，棄廢液；加700 ii 1漂洗液GW， 12， OOOrpm離心30秒，棄廢液；加500 y 1漂洗液GW，12， OOOrpm離心30秒，棄掉廢液；再次12， OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200 ill洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12， OOOrpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12， OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA ;
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中目的片斷的PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為0.2iU Taq聚合酶，2.5iU 10XPCR緩沖液，2ii 1 dNTP，2ii1 25mM的MgCl2 0. 2 ii 150pM的正向引物，0. 2iU 50pM的反向引物，liil基因組DNA和17. 4iU (1朋20，擴(kuò)增條件為97。C變性5min ;95°C 30s，55。C 30s，72。C 30s，如此進(jìn)行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中瓊脂糖凝膠電泳檢測的步驟為取PCR產(chǎn)物5iU，同1 iU上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker， 120V/cm電壓下電泳30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System上留取照片。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中目的基因片斷回收與鑒定的操作步驟如下在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中；膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13， OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的液體；將吸附柱放入同一個(gè)收集管中，在吸附柱中加入700 iil漂洗液PW， 13， OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；在吸附柱中加入500iil漂洗液PW，13，000rpm離心30秒，倒掉廢液；將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13， 000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液；將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干；將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘；13， OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中目的基因片斷的克隆與鑒定的步驟如下感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線；過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37"搖菌160轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)2-3小時(shí)，至0D6。。達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)將菌液移至滅菌預(yù)冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘；4， 000rpm，4t:離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預(yù)冷的0. 1M CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀；冰浴10_15分鐘后于4， 000rpm，4。C離心10分鐘，回收細(xì)菌沉淀；加入4ml 0. 1M CaCl2懸浮細(xì)菌沉淀；該細(xì)胞可直接 用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；加甘油至終濃度為15% _20%，混勻，每份分裝成100 iU于1. 5ml EP管中，凍存于-7(TC冰箱中；回收片段同T載體的連接首先在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector 0. 5 ii 1DNA 20-40ngSolution 15 li 1加dH20至 10 illTotal 10 ill然后將上述反應(yīng)液在16t:反應(yīng)30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶；將100 ill感受態(tài)細(xì)胞加入lOiU連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘；加入400 y 1液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘后取100 yl鋪于LB平板上，平板含0. 1 (V/V)的氨芐青霉Amp， X-gal和IPTG ;最后于37。C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)；白色菌斑應(yīng)含重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落；將牙簽頭放入在加有不含模板的PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應(yīng)的單菌落，放入40ml含0. 1% (V/V)的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中，37。C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收和測序。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列，提供了一種新的干酪乳桿菌脂酶Est C的編碼核苷酸序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應(yīng)激密切相關(guān)的基因，該序列的核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140的核酸序列有99％的相似性。本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌Zhang中的Est C基因的核酸序列，該核酸序列為SEQ ID NO1，本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang脂酶Est C的氨基酸序列，該序列的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
文檔編號C12N9/16GK101792771SQ20101012242
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者烏日娜, 孟和, 張和平 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)