專(zhuān)利名稱(chēng)：益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性、定量測(cè)定方法
益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性、定量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有益生菌的乳制品技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種在益生菌 乳制品中干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的快速定性、定量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
益生乳制品因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的益生功效成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前市 場(chǎng)上益生菌及含有益生菌的乳制品種類(lèi)繁多，并且每年以高速度增長(zhǎng)。對(duì)其質(zhì)量的監(jiān)管和 認(rèn)證，尤其在定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法。傳統(tǒng)方法中對(duì)益生菌的定 性、定量檢測(cè)，仍采用生理生化反應(yīng)和選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)的方法。傳統(tǒng)方法易受 培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測(cè)效率有限，而且受外界環(huán)境因素和培養(yǎng)基性能的影響 大，檢測(cè)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時(shí)耗力。PCR技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于分子生 物學(xué)和微生物學(xué)等領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)的出現(xiàn)更是實(shí)現(xiàn)了 PCR技術(shù) 從定性到定量的飛躍，避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污染的問(wèn)題。具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性 好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，成為了分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域定量檢測(cè)的重要方法。采用乳桿 菌種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的益生菌乳制品中干酪 乳桿菌的定性、定量測(cè)定方法，可以簡(jiǎn)化益生菌的檢測(cè)程序、提高檢測(cè)效率，能提高我國(guó)益 生菌的檢測(cè)能力，完善保健食品的質(zhì)量監(jiān)管，并為益生菌產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展提供技術(shù)保障。
本發(fā)明針對(duì)益生菌乳制品中含有的干酪乳桿菌，依據(jù)參考文獻(xiàn)自行設(shè)計(jì)干酪乳桿 菌的16S rRNA基因序列的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物進(jìn)行種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定 量PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析，建立益生菌乳制 品中干酪乳桿菌的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定性和定量測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問(wèn)題] 本發(fā)明的目的是提供一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量方法。
[技術(shù)方案] 本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。 本發(fā)明涉及一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性測(cè)定方法。該方法的步驟 如下 A、模板DNA的制備 (1)取益生菌干酪乳樣品于2.0mL離心管中，加入500iiLTE緩沖液，混合均勻， 再置于液氮中進(jìn)行凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65t:水浴中進(jìn)行融化4-6min，如此反復(fù)進(jìn)行凍融 3-5次； (2)凍融結(jié)束后，往其中加入60.0iiL10X (質(zhì)量體積比)的SDS和10.0iiL10mg/ mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37t:下以200r/min進(jìn)行搖動(dòng)4h ;
(3)加入100. 0 ii L 5M NaCl和100 ii L CTAB麵C1溶液(將4. IgNaCI溶于80ml 水中，再緩慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。 (4)然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它 們的體積比分別是25 : 24 : l，混勻，再以10000g/min離心10min，該溶液分成上層水相、 中間固相與下層有機(jī)相； (5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯氯仿和異戊醇混合物抽提一 次，分離上清液； (6)往所述的上清液中加入0. 1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的冰異丙醇， 混合均勻靜置30min，以10000g離心5min得到總DNA沉淀； (7)所述沉淀用70體積比％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50. Oii L無(wú)菌超純水回溶，在溫度-2(TC下保存?zhèn)溆谩?
B、PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer、 1. 0 ii L 25mmol/L Mg2+、 2ii L2. 5mmol/L dNTPs、2. 5 ii L5mmol/L上下游引物、1. 0 ii L 50ng/ii LDNA模板，0. 25uL 5U/ ii LTaq酶，二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 ii L ;PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min ;95。C變性40S，62。C退火30S，72。C延伸lmin，循 環(huán)40次；72t:延伸8min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在溫度f(wàn)C下保存；
取3. 0 ii LPCR產(chǎn)物使用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)；
C、結(jié)果及判斷 檢測(cè)時(shí)設(shè)以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA作為模板為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌水作為模
板為陰性對(duì)照；根據(jù)在784bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該益生菌乳制品中含有干酪乳桿
菌，相反地則不含有干酪乳桿菌。 在本發(fā)明中，所述的上下游引物分別是 上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr為5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的檢測(cè)是在5V/cm的電壓下進(jìn)行電泳
20-30min，再用EB染色，然后進(jìn)行紫外照相。 本發(fā)明還涉及一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量測(cè)定方法。該方法的步 驟如下 A、樣品總RNA的制備 采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA，發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮的研缽中研磨 后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA。然后用DNaseI處理 兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，使用微量紫外分光光度儀測(cè) 定濃度，采用1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，然后將樣本保存于-8(TC ;
B、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 反應(yīng)體系10. 0 ii L :2. 0 ii L 5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix 1、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、總RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20補(bǔ)足至10. 0 ii L ; 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件37t:反應(yīng)15min ;85。C變性5S，在溫度-2(TC下保存；
C、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系25. Oil L :12. 5ii L 2 X SYBR Premix Ex Taq ，各0. 5 ii L10 ii mol/L上、 下游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii LH20 ; 熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95。C變性25S ;95。C變性IOS，60。C退火22S，40個(gè)循環(huán)；
在溫度4t:保存；每個(gè)樣品重復(fù)3次； D、外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備提取含有以干酪乳桿菌(L. casei)模式菌株ATCC393 (購(gòu)自中國(guó) 普通微生物菌種保藏中心)目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出 拷貝數(shù)，進(jìn)行IO倍系列稀釋?zhuān)荻认♂屩?09-102拷貝數(shù)/i！ L的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn) 行熒光定量PCR反應(yīng)； 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中 到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，作為待測(cè)樣品定 量測(cè)定的參照標(biāo)準(zhǔn)；
E、結(jié)果及判斷 以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用干酪乳桿菌的種特異性引物，以相同 的體系同時(shí)進(jìn)行干酪乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和 待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量檢測(cè)。
在本發(fā)明中，所述干酪乳桿菌種屬特異性引物序列如下
上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr為5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。
下面將詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。 本發(fā)明涉及一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性測(cè)定方法。 采用液氮凍融-CTAB法抽提樣品中益生菌總DNA和純培養(yǎng)乳酸菌(包括L. casei
模式菌ATCC393，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)的總DNA。所述的液氮凍融-CTAB法
是一種本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法，主要是利用CTAB緩沖液提取生物DNA的方法。 該方法的步驟如下 A、模板DNA的制備 (1)取益生菌干酪乳樣品于2.0mL離心管中，加入500iiLTE緩沖液，混合均勻， 再置于液氮中進(jìn)行凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65t:水浴中進(jìn)行融化4-6min，如此反復(fù)進(jìn)行凍融 3-5次。 所述的TE提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制 DNase活性； (2)凍融結(jié)束后，往其中加入60. OiiL質(zhì)量體積比為10X的SDS和10. OiiL 10mg/ mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37t:下以200r/min進(jìn)行搖動(dòng)4h ; 所述的SDS是十二烷基硫酸鈉，它是日本關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社以商品名SDS銷(xiāo)售的
A 口 廣PR o 所述的蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香 族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解。這種酶經(jīng)純化去除了 RNA酶和DNA 酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛。本發(fā)明使用的蛋白酶K是AMRESCO公司以商品名Proteinase K銷(xiāo)售的產(chǎn)品。
所述的搖床是上海智城分析儀器制造有限公司以商品名Z冊(cè)Y-200D恒溫培養(yǎng)振 蕩器銷(xiāo)售的產(chǎn)品。 (3)加入100. 0 ii L 5M NaCl禾P 100 ii L 10% CTAB溶液(將4. IgNaCI溶于80ml
水中，再緩慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。 所述的NaCl提供一個(gè)鹽環(huán)境，使DNA充分溶解而存在于液相中。 所述的CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度
的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液
里，在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，
只是不能沉淀核酸。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。 (4)然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它
們的體積比分別是25 : 24 : l，混勻，再以10000g/min離心10min，該溶液分成上層水相、
中間固相與下層有機(jī)相。 (5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯酚、氯仿和異戊醇混合物抽提 一次，分離上清液。 (6)往所述的上清液中加入0. 1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的冰異丙醇， 混合均勻，再靜置30min，以10000g離心5min，得到總DNA沉淀； (7)所述沉淀用70體積％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50ii L無(wú)菌超純水回溶，在溫度-2(TC下保存?zhèn)溆谩?
B、PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增是一種體外高效復(fù)制DNA的技術(shù)，該技術(shù)幾乎貫穿于現(xiàn)在分子生物學(xué)的 各個(gè)領(lǐng)域。PCR體系由模板、特異性引物、高溫聚合酶、脫氧核糖核酸幾部分組成。PCR擴(kuò)增 過(guò)程可以分模板高溫變性、引物與模板低溫退火、引物在高溫聚合酶的作用下延伸。
該反應(yīng)體系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer、 1. 0 ii L 25mmol/L Mg2+、 2ii L2. 5mmol/L dNTPs、2.5iiL 5mmol/L上下游引物、1. 0 ii L 50ng/ii L DNA模板，0.25uL 5U/ ii L Taq酶，二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 ii L。
在本發(fā)明中，所述的上下游引物分別是
上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr為5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min ;95。C變性40S，62。C退火30S，72。C延伸lmin，循
環(huán)40次；72t:延伸8min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在溫度f(wàn)C下保存； 取3. Oii LPCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析是使 用UVP公司以商品名CDS-8000凝膠成像儀銷(xiāo)售的儀器進(jìn)行的。
C、結(jié)果及判斷 檢測(cè)時(shí)設(shè)以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照模板，以滅菌水作為陰性 對(duì)照模板；根據(jù)在784bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該益生菌乳制品中含有干酪乳桿菌，相 反地則不含有干酪乳桿菌。具體可參見(jiàn)附圖l。 本發(fā)明還涉及一種益生菌乳制品中干 乳桿菌的快速定量測(cè)定方法。該方法的步 驟如下
A、樣品總RNA的制備 采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA，發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮的研缽中研磨 后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA。然后用DNasel處理 兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，測(cè)定濃度，在溫度-S(TC下保 存； 所述的Trizol試劑是由Invitrogen公司專(zhuān)供提取RNA的產(chǎn)品；DNase I是TaKaRa 公司產(chǎn)品；此過(guò)程中使用的氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等試劑是天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)的產(chǎn) RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此，用DEPC_dH20溶解的RNA樣品可以 直接使用例如NanoDrop-1000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定在260nm波長(zhǎng)處的RNA濃度和純 度，DEPC-H20為空白對(duì)照，RNA濃度可以直接讀數(shù)，RNA純度通過(guò)0D26。/28。來(lái)檢測(cè)。若比值在 1. 9-2. 1間，認(rèn)為純度較好，比值小于1. 8說(shuō)明有雜蛋白質(zhì)較多；比值大于2. 2，則表明RNA
已經(jīng)降解。 RNA完整性通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
B、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 反應(yīng)體系10. 0ii L :2. 0ii L5XPrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、總RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20補(bǔ)足至10. 0 ii L ; 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件37t:反應(yīng)15min ;85"C變性5S，在溫度-2(TC下保存；
C、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系25. Oil L :12. 5ii L2XSYBR⑧Premix Ex TaqTM，各0. 5 ii L10 ii mol/L上、 下游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii L dH20 ; 熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95。C變性25S ;95。C變性10S， 6(TC退火22S， 40個(gè)循環(huán)；
在溫度4t:保存；每個(gè)樣品重復(fù)3次； D、外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備提取含有以干酪乳桿菌模式菌株ATCC393目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒 DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出拷貝數(shù)，進(jìn)行IO倍系列稀釋?zhuān)荻认♂屩?09_102 拷貝數(shù)/uL的濃度。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制將外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)蛊涑蔀榫咭欢ㄌ荻瓤截悢?shù)含 量的模板，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為 橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到干酪乳桿菌的標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)(參見(jiàn)附圖2和3)，作為待測(cè)樣品定量測(cè)定提供參照標(biāo)準(zhǔn)；
E、結(jié)果及判斷 以待測(cè)樣品的cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用干酪乳桿菌的種特異性引物，以相
同的體系同時(shí)進(jìn)行干酪乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量檢測(cè)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析是使用Bio-Red公司以商品名iQ 5銷(xiāo)售的儀器進(jìn)行的。 在本發(fā)明中，所述干酪乳桿菌種屬特異性引物序列如下
上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'， 下游引物Cr為5， -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。 本發(fā)明益生菌乳制品中干酪乳桿菌快速定量測(cè)定方法的誤差分析如下 與傳統(tǒng)的PCR相比，定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的
交叉污染。由于定量PCR具有特異性強(qiáng)、敏感性高、精確性好的優(yōu)點(diǎn)，所以其操作每一過(guò)程
都可能造成定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性差。如樣本采集和存儲(chǔ)、提取RNA、定量PCR檢測(cè)過(guò)
程的加樣等，所以應(yīng)用定量PCR技術(shù)時(shí)，務(wù)必做到實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、合理化、細(xì)致化和有效化，
使定量PCR技術(shù)更好地為我們服務(wù)。 標(biāo)準(zhǔn)品的制備是建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常用的標(biāo)準(zhǔn)品有三種構(gòu)建方
法一是按照擴(kuò)增片段序列人工合成一段寡核苷酸；二是回收純化含有熒光定量PCR擴(kuò)增
片段的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；三是將含有熒光定量PCR擴(kuò)增片段克隆到質(zhì)粒中回收質(zhì)粒。本
發(fā)明選擇第三種方法，構(gòu)建了含有目的條帶的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以此為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)
準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品的絕對(duì)量(拷貝數(shù))進(jìn)行測(cè)定。[有益效果] 本發(fā)明的有益效果是 可以在不進(jìn)行益生菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)益生菌 乳制品中的干酪乳桿菌，整個(gè)過(guò)程對(duì)益生菌乳制品中干酪乳桿菌的檢測(cè)程序簡(jiǎn)單、檢測(cè)效 率高、準(zhǔn)確性好。


圖1、干酪乳桿菌的引物特異性驗(yàn)證及樣品的定性檢測(cè) M :DL2000Marker ;1. pCT作為陽(yáng)性對(duì)照；2. H20作陰性對(duì)照；3. L. casei ATCC393 ; 4.酸奶樣12#(L. casei Zhang禾口 Bifidobacterium animalisSubsp. Lactis V9混合發(fā) 酵)；5.酸奶樣36#(從西藏采的傳統(tǒng)發(fā)酵乳)；6. L. plantarum 1. 2437 ;7. L. rhamnosus 1. 2134 ;8.L.acidophilus ATCC 4356。 圖2、干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(xiàn)，從左到右曲線(xiàn)包含的拷貝數(shù)為109到102。
圖3、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和待檢樣本的定量檢測(cè)
圖4、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)干酪乳桿菌的融溶解曲線(xiàn)單峰圖
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1 益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性檢測(cè) 該實(shí)施例使用含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒pCT作為陽(yáng)性對(duì)照；dH20作陰性對(duì)照；另 外使用L. casei ATCC393、L plantarum 1. 2437、L. rhamnosusl. 2134、L. acidophilus ATCC 4356、酸奶樣12#(L. casei Zhang禾P Bifidobacterium animalis Subsp. Lactis V9混合發(fā) 酵)、酸奶樣36#(從西藏采的傳統(tǒng)發(fā)酵乳)、作為樣品進(jìn)行。 所述的L. rhamnosus 1. 2134、 L. plantarum 1. 2437購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保 藏中心；L. acidophilus ATCC 4356、 L. casei ATCC393購(gòu)自美國(guó)American Type CultureCollection ;L casei Zhang禾口 Bifidobacterium animalisSubsp丄actis V9為內(nèi)蒙古農(nóng)
業(yè)大學(xué)"乳品生物技術(shù)與工程"教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。
a.模板DNA的制備采用液氮凍融-CTAB法抽提樣品DNA，具體步驟如下 (1)取0.5g益生菌發(fā)酵乳樣品或MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸菌(包括模式菌 L. caseiATCC393)于2. 0mL離心管中，加入500 y L TE緩沖液，混合均勻，再置于液氮中進(jìn)行 凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65t:水浴中進(jìn)行融化5min，如此反復(fù)進(jìn)行凍融4次；
(2)凍融結(jié)束后，往其中加入60. 0 ii L10% (質(zhì)量體積比)的SDS和10. 0 y L10mg/mL 蛋白酶K，在搖床中在溫度37t:下以200r/min進(jìn)行搖動(dòng)4h ; (3)加入100. 0 ii L 5M NaCl和100 ii LCTAB/NaCl (將4. IgNaCI溶于80ml水中，再 緩慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。 (4)然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它 們的體積比分別是25 : 24 : l，混勻，再以10000g/min離心10min，該溶液分成上層水相、 中間固相與下層有機(jī)相； (5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯氯仿和異戊醇混合物抽提一 次，分離上清液； (6)往所述的上清液中加入0. 1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的冰異丙醇， 混合均勻靜置30min，以10000g離心5min得到總DNA沉淀； (7)所述沉淀用70體積％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干燥，得到模板 DNA ;然后加入50. Oii L無(wú)菌超純水回溶，在溫度-2(TC下保存?zhèn)洹?
b. PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系25. Oii L :2. 5ii L 10XPCR Buffer (含Mg2+) ， 2 ii L 2. 5mmol/Ld證s，共 2. 5 ii L 5mmol/L上下游引物(Cf和Cr) ， 1. 0 ii L 50ng/ ii L DNA模板，0. 25 ii L 5U/ ii L Taq 酶(TakaRa)，用二次蒸餾水補(bǔ)足至25. 0 y L。將PCR產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電 壓，電泳20-30min， EB染色，紫外拍照。 c.將L. casei ATCC393的PCR產(chǎn)物與pMD18連接轉(zhuǎn)化DH5 a ，獲得陽(yáng)性克隆子pCT。
d.結(jié)果及判斷 經(jīng)干酪乳桿菌的種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖l，泳 道1以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒PCT作為陽(yáng)性對(duì)照，泳道2以滅菌水作為陰性對(duì)照。 一般 認(rèn)為陽(yáng)性特征在784bp處出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，說(shuō)明此樣本中含有干酪乳桿菌；陰性對(duì)照無(wú) 特征條帶。泳道3為干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌，泳道4中樣本12#是本實(shí)驗(yàn)室利用2株益生菌 (L.casei Zhang禾P Bifidobacterium animalis Subsp. Lactis V9)混合發(fā)酵制得的酸奶， 其中含有干酪乳桿菌，這些結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，具有陽(yáng)性特征；泳道5為從西藏采的自然 發(fā)酵乳36#樣本，結(jié)果為陰性，說(shuō)明此樣本不含L. casei。泳道6、7、8為L(zhǎng). casei外的其他 種乳酸菌，結(jié)果為陰性，說(shuō)明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。
實(shí)施例2. 益生菌乳制品中干酪乳桿菌的定量測(cè)定 對(duì)實(shí)施例1中提到的不同樣品進(jìn)行了干酪乳桿菌的定量測(cè)定。其測(cè)定步驟如下
a.樣品總RNA的制備
采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品500mg在盛有液氮的研缽中研磨后，迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，然后用DNasel處理兩次，確保完全消 除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，按照本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)說(shuō)明的方法進(jìn)行濃度測(cè)定， RNA完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
b.反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 反應(yīng)體系10. Oil L :2. Oil L5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0. 5uL Random 6mers (100 u M)、總RNA ( < 500ng) ， RNase Free dH20補(bǔ)足至10. 0 ii L ; 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件37t:反應(yīng)15min ;85。C變性5S，在溫度-2(TC下保存；
c.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量PCR按照SYBI^PrimeScriptTM RT-PCR Kit (大連寶生物工程有限公司， TaKaRa DRR063A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系25. 0 ii L :12. 5 ii LSYBR Premix Ex TaqTM(2X)、 各0. 5 ii L 10 ii mol/L上、下游引物(Cf和Cr) 、2. 0 y L cDNA模板、9. 5 y L 二次蒸餾水。熒 光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95。C變性25S ;95。C變性5S，6(TC退火22S，40個(gè)循環(huán)；在溫度4。C保 存。 d.外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 提取以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒pCT總DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出 拷貝數(shù)，做10倍系列稀釋?zhuān)荻认♂屩?09-102拷貝數(shù)/uL的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 熒光定量PCR反應(yīng)，見(jiàn)附圖2。以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程 中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)附圖3。
e.待測(cè)樣本的檢測(cè) 以待測(cè)樣品的cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，用實(shí)施例1描述的干酪乳桿菌的種特異 性引物，以相同的體系同時(shí)進(jìn)行干酪乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和采用Bio-Red公司的iQ 5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的計(jì)算機(jī)軟件分析進(jìn) 行益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量檢測(cè)，見(jiàn)附圖3 。
f、結(jié)果和分析 由圖2可見(jiàn)，干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(xiàn)光滑。由圖3可見(jiàn)，Ct值和拷貝數(shù)呈較 好的線(xiàn)性關(guān)系，以模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制出的熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y = -3. 151X+39(Y代表Ct值，x代表模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù))，模板初始拷 貝數(shù)與Ct值之間線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0. 994，斜率為-3. 151，所建立的L. casei標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)符合 Real-Time PCR定量的要求。由圖4可見(jiàn)，樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線(xiàn)一致，且都為單一峰型 的曲線(xiàn)，證明熒光染料的定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性良好，引物和PCR反映條件都適合進(jìn)行熒光 定量。 把待測(cè)樣品的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，以確定未知樣品的量。結(jié)果與分析誤差結(jié) 果一并列于下表l中。 表l L.caaei發(fā)酵乳樣品的Real-time測(cè)定結(jié)果
11樣本X+SD拷貝數(shù)/g發(fā)酵乳
L caseiZhang單菌發(fā)酵9. 5±0. 6
L caseiZhang禾口 Bif idobacteriumanimalisSubsp. LactisV9混合發(fā)酵8. 9±0. 7 由表1的結(jié)果清楚地表明，定量PCR能準(zhǔn)確定量發(fā)酵乳中活性干酪乳桿菌。 序列表 〈110〉內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 〈120〉益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性、定量測(cè)定方法 〈130〉 〈160>2 〈210>1 〈211>18 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉對(duì)人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)和使用的上游引物Cf 。 〈400〉 1 CACCGAGATT CAACATGG 18 〈210>2 〈211>18 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉對(duì)人工序列的描述本發(fā)明所設(shè)計(jì)和使用的下游引物Cr。 〈400>2 GAAGGGCGGA AACCCTCC 18
權(quán)利要求
一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下A、模板DNA的制備(1)取益生菌干酪乳樣品于2.0mL離心管中，加入500.0μL TE緩沖液，混合均勻，再置于液氮中進(jìn)行完全凍結(jié)，凍結(jié)后取出放入65℃水浴中進(jìn)行融化4-6min，如此反復(fù)進(jìn)行凍融3-5次；(2)凍融結(jié)束后，往其中加入60.0μL 10％(質(zhì)量體積比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37℃下以200r/min進(jìn)行搖動(dòng)4h；(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；(4)加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，它們的體積比分別是25∶24∶1，混勻，再以10000g/min離心10min，該溶液分成上層水相、中間固相與下層有機(jī)相；(5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯酚、氯仿和異戊醇混合物抽提一次，分離上清液；(6)往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積的冰異丙醇，混合均勻，再靜置30min，以10000g/min離心5min，得到總DNA沉淀；(7)所述沉淀用70％(體積比)乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL無(wú)菌超純水回溶，在溫度-20℃下保存?zhèn)溆?；B、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25.0μL2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg2+、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸餾水補(bǔ)足至25.0μL；PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3min；95℃變性40S，62℃退火30S，72℃延伸1min，循環(huán)40次；72℃延伸8min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在溫度4℃下保存；取3.0μL PCR產(chǎn)物使用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)；C、結(jié)果及判斷檢測(cè)時(shí)設(shè)以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA作為模板為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌水作為模板為陰性對(duì)照；根據(jù)在784bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該益生菌乳制品中含有干酪乳桿菌，相反地則不含有干酪乳桿菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的上下游引物分別是 上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'，下游引物Cr為5' GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA是通過(guò)將 L. casei ATCC 393的PCR產(chǎn)物與pMD18連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a獲得的陽(yáng)性克隆子。
4. 一種益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定量測(cè)定方法，其特征在于該方法的步驟如下A、樣品總RNA的制備采用Trizol法提取發(fā)酵乳制品總RNA :發(fā)酵樣品500mg在盛有液氮的研缽中研磨后， 迅速加入lmL Trizol試劑，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，然后用DNaseI處理兩次，確保完全消除RNA中的DNA污染，得到純化的RNA樣品，使用微量紫外分光光度儀測(cè)定 濃度，采用1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，然后將樣本保存于-8(TC ;B、 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)體系10. 0ii L :2. 0ii L 5XPrimerScript Buf f er (TakaRa DRR063A) 、0. 5 ii L PrimerScript RT Enzyme Mix I、0.5uL Random 6mers (100 u M) 、 TotalRNA ( < 500ng)， RNase Free dH20補(bǔ)足至10. 0 ii L ;反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件37t:反應(yīng)15min ;85。C變性5S，在溫度-2(TC下保存；C、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系25. 0ii L :12. 5ii L2xSYBR PremixEx Taq ，各0. 5 y L 10踐ol/L上、下 游引物Cf和Cr， 2. 0 ii L cDNA模板，9. 5 ii LdH20 ;熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)95。C變性25S ;95。C變性10S，6(TC退火22S，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品重復(fù)3次；在溫度4t:保存；D、 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制外標(biāo)準(zhǔn)品的制備提取含有以干酪乳桿菌模式菌株ATCC393目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒DNA， 紫外分光光度計(jì)測(cè)定A值后，計(jì)算出拷貝數(shù)，進(jìn)行IO倍系列稀釋?zhuān)荻认♂屩?09-102拷貝 數(shù)/uL的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá) 熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)得到干酪乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，作為待測(cè)樣品定量測(cè) 定的參照標(biāo)準(zhǔn)；E、 結(jié)果及判斷以待測(cè)樣品cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用干酪乳桿菌的種特異性引物，以相同的體 系同時(shí)進(jìn)行干酪乳桿菌的16S rRNA的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和待測(cè) 樣品的Ct值求出益生菌乳制品中干酪乳桿菌的起始模板量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述干酪乳桿菌種屬特異性引物序列如下上游引物Cf為5' -CACCGAGATTCAACATGG-3'，下游引物Cr為5' -GAAGGGCGGAAACCCTCC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為784bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性、定量測(cè)定方法。該方法針對(duì)益生菌乳制品中含有的干酪乳桿菌，自行設(shè)計(jì)干酪乳桿菌的16S rRNA基因序列的種屬特異性引物，應(yīng)用此引物進(jìn)行種屬特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析，建立益生菌乳制品中干酪乳桿菌的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定性和定量測(cè)定方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101712989SQ200910177910
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者包秋華, 張和平, 張家超 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)