專利名稱：：一種干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌a"加&a"7/M胞外多糖，特別涉及一種干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高血壓是現(xiàn)代社會(huì)常見的文明病之一，是導(dǎo)致心臟病、腦溢血、梗死等重大疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因子。在西方工業(yè)化國(guó)家，占人口總數(shù)15%以上的人患有高血壓，其中以中、老年人居多，并且有低齡化的趨勢(shì)，尤其是男性，在美國(guó)，每4個(gè)成年男性中就有1人。該統(tǒng)計(jì)不包括血壓偏高、尚未達(dá)到必須就醫(yī)程度的人群。來自政府有關(guān)方面的數(shù)據(jù)表明，中國(guó)的2002年的高血壓患者的人數(shù)超過1.3億，超過總?cè)丝诘?0%。在高血壓人群中，由于各種原因，僅有少數(shù)人采取了藥物治療措施。在降壓藥物之外，通過改變?nèi)粘５娘嬍辰M成和生活方式是用來預(yù)防高血壓形成和調(diào)節(jié)高血壓患者血壓的重要途徑。干酪乳桿菌aa"oZ^"7/wscase/)是一種被公認(rèn)為安全的乳酸菌，有著長(zhǎng)期安全食用的歷史。本申請(qǐng)人公開號(hào)為CN1916028的專利申請(qǐng)公幵了干酪乳桿菌，特別是LC2WCGMCCN0.0828菌株在乳中生長(zhǎng)時(shí)可以合成與分泌大量具有抗高血壓活性的胞外多糖，但尚未能分離出其有效的單組分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即是提供一種干酪乳桿菌胞外多糖的有效單組分——單一多糖LCP1及其制備方法。本發(fā)明人即在上述專利申請(qǐng)公開的技術(shù)方案基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)干酪乳桿菌胞外多糖進(jìn)行分離提純，驚奇地發(fā)現(xiàn)其中的單組分LCP1具有顯著的抗高血壓作用。本發(fā)明對(duì)該單組分進(jìn)行了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析及理化性質(zhì)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其是一種主要由鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)組成的單一多糖。因此，通過1D(—維)和2D(二維)NMR譜圖分析結(jié)果，結(jié)合單糖組成、紅外光譜、甲基化等分析，本發(fā)明所指的一種干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1的結(jié)構(gòu)式如下式I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，n=300~1000。根據(jù)本發(fā)明，通過高效體積排阻色譜分析，上述單一多糖LCP1的重均分子量(Mw)為1.236xl()6道爾頓、固有粘度(h])為1.875dL/g、回旋半徑(Rg)為42.72nm、多分散性指數(shù)(Pd)為1.202和Mark-Houwink指數(shù)(a)為0.654。本發(fā)明還提供上述單一多糖LCP1的制備方法，其可以采用硫酸銨沉淀法從干酪乳桿菌胞外多糖中分離，包括下列步驟在濃度為0.8lw/w。/。的干酪乳桿菌胞外多糖水溶液中，加入硫酸銨至其濃度為15~15.5w/w%，靜置l小時(shí)，然后4"C、9000rpm離心30分鐘，沉淀部分用水溶解，然后采用分子截留極限為12，000Dalton的膜在4。C透析48小時(shí)，再將截留液干燥。根據(jù)本發(fā)明，所說的干酪乳桿菌胞外多糖是指按照現(xiàn)有技術(shù)，如上述本申請(qǐng)人:的專利申請(qǐng)，將干酪乳桿菌a"cto6a"7/w在含乳培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，例如在2040'C下，將干酪乳桿菌LC2WCGMCCNO.0828菌株在無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵1672小時(shí)得發(fā)酵液，也可以先發(fā)酵648小時(shí)，獲得發(fā)酵種子液，再繼續(xù)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，其中，所述的無菌培養(yǎng)基含有0,010.0g/L酵母浸出物，0.060.0g/L的單糖、雙糖和/或寡聚糖，0.010.0g/L蛋白胨和60.0160.0g/L的脫脂奶粉；然后將上述發(fā)酵液在95100'C加熱1030分鐘，離心或過濾獲得發(fā)酵上清液;再加入24倍體積的80100體積％乙醇于上述發(fā)酵上清液中，離心或過濾收集沉淀物，在溫度不超過115-C下干燥得多糖粗品。較佳的是采用三氯乙酸法去除蛋白和透析法去除其它雜質(zhì)后的純化的胞外多糖。本發(fā)明上述干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1具有顯著的抗高血壓作用。按每天每公斤體重口服15毫克該多糖，可以明顯使收縮壓明顯降低，而且降壓效果可以持續(xù)10小時(shí)以上。因此，本發(fā)明單一多糖LCP1可以用以制備預(yù)防和治療高血壓病的藥品；或者飲食品，例如液態(tài)奶、酸奶及乳飲料等乳制品。由此，本發(fā)明還提供一種防治高血壓病的藥物組合物，其包括作為活性成分的上述本發(fā)明干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1。本發(fā)明另還提供一種乳制品，其包括上述本發(fā)明干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1。圖1為本發(fā)明從干酪乳桿菌胞外多糖中采用硫酸銨沉淀法分離單一多糖LCP1的操作流程圖。圖2為本發(fā)明單一多糖LCP1凝膠柱層析洗脫曲線圖。圖3為本發(fā)明單一多糖LCP1的紫外掃描圖譜。圖4為本發(fā)明單一多糖LCP1的紅外圖譜。圖5為本發(fā)明單一多糖LCP1的高效毛細(xì)管電泳圖。圖6為本發(fā)明單一多糖LCP1的高效體積排阻色譜(HPSEC)圖。圖7為本發(fā)明單一多糖LCP1的單糖組成離子色譜圖。圖8為本發(fā)明單一多糖LCP1的iHNMR譜圖。圖9為本發(fā)明單一多糖LCP1的。CNMR譜圖。圖10為本發(fā)明單一多糖LCP1的HSQC譜圖。圖11為本發(fā)明單一多糖LCP1的COSY45譜圖。圖12為本發(fā)明單一多糖LCP1的ROESY譜圖。圖13為本發(fā)明單一多糖LCP1的HMBC譜圖。具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。實(shí)施例1干酪乳桿菌aactok/c///wsc"sez')胞外多糖的制備參照上述專利申請(qǐng)文件，先制得干酪乳桿菌(丄acto6""7/wowe/)胞外多糖，具體步驟為-將干酪乳桿菌LC2WCGMCCNO.0828接種到添加0.ly。-0.5。/。(w/v)酵母浸出物、l-3n/。(w/v)葡萄糖、總?cè)楣腆w含量為10%(w/w)的無菌脫脂奶中，37"C培養(yǎng)24小時(shí)，然后按l-5v/v。/。接種量轉(zhuǎn)接到上述無菌脫脂奶中，35-37"C發(fā)酵24小時(shí)；然后通過加熱，將發(fā)酵乳的溫度提升至95'C-10(TC，并保溫10分鐘；待冷卻至室溫后，通過離心方式獲得發(fā)酵乳上清液，上清液加入2-3倍體積經(jīng)過預(yù)冷的95%(v/v)酒精，在0-6t:放置過夜；通過離心或過濾的方式收集沉淀物，經(jīng)過冷凍干燥或低溫烘干即可獲得胞外多糖粗品。將上述胞外多糖粗品用蒸餾水溶解，加入pronaseE(蛋白酶E，EC3.4.24.31;SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)，酶與多糖粗品的比例為1:1000(w/w)，混合物在37*€保溫1小時(shí)；然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最終濃度為10%(w/w)，在4。C放置過夜，采用4。C、9000rpm離心20分鐘或過濾的方式去除沉淀物；去除沉淀后的胞外多糖溶液采用分子截留極限為12000Dalton的膜對(duì)蒸餾水透析，在4"C透析72小時(shí)，中間多次換水；經(jīng)過透析后的多糖溶液經(jīng)過真空冷凍干燥，獲得初步純化的干酪乳桿菌胞外多實(shí)施例2本發(fā)明單一多糖LCP1的分離純化采用硫酸銨分級(jí)沉淀的方法。將8.0-10.0g實(shí)施例1制得的初步純化的干酪乳桿菌胞外多糖溶于1000ml去離子水中，在80-90'C保溫30分鐘，使之完全溶解；待冷卻至室溫(25°C)后，一邊攪拌，一邊緩慢加入硫酸銨，至加入的硫酸銨濃度達(dá)到15-15.5%(w/w)，靜置1小時(shí)，然后采用4°C、9000rpm離心30分鐘。沉淀部分用200ml去離子水溶解，然后采用分子截留極限為12000Dalton的膜對(duì)該溶液在4'C透析48小時(shí)，中間多次換水。透析后的多糖溶液經(jīng)過真空冷凍干燥，獲得本發(fā)明單一多糖LCP1。其分離過程如圖1所示。將本發(fā)明單一多糖LCP1通過SepharoseCL-6B凝膠柱(D1.6X100cm,上海滬西分析儀器廠)進(jìn)行色譜分離，30mg樣品溶于3ml去離子水中，上柱。用0.1mol/LNaCl溶液洗脫，流速0.3mL/min，用硫酸-苯酚法在入=490nm檢測(cè)洗脫液中多糖含量，采用紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)A-280nm處吸光度，結(jié)果見圖2。實(shí)施例3本發(fā)明單一多糖LCP1的理化性質(zhì)測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析1、LCP1純度鑒定和分子質(zhì)量測(cè)定1.1LCP1的紫外光譜，如圖3所示。1.2LCP1的紅夕卜光譜，如圖4所示。1.3毛細(xì)管電泳檢測(cè)LCP1的純度毛細(xì)管電泳技術(shù)的基本原理是根據(jù)在電場(chǎng)作用下離子遷移的速度不同而對(duì)組分進(jìn)行分離和分析，雖然中性多糖不帶電荷，但是它可以在堿性條件下與硼酸鹽形成絡(luò)合陰離子，在毛細(xì)管電泳中進(jìn)行遷移，并可以利用多糖羥基200nm處的吸收峰進(jìn)行測(cè)定。分析方法流動(dòng)相含Na2HP04(40mM)、硼酸鈉(IOmM)和SDS(40mM)，并用HC1調(diào)pH為9.0，用流動(dòng)相配制LCP17濃度為3mg/mL溶液，毛細(xì)管柱采用未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(直徑75)im，長(zhǎng)60cm)，在25KV電壓下電泳20min，200nm檢測(cè)。LCP1毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖5，顯示了LCP1為單一峰，這進(jìn)一步確定了LCP1為一種分子量均一的純多糖。因此，通過上述檢測(cè)過程，證明所獲得的LCP1，是一種不含蛋白成分的單一多糖。1.4LCP1分子量和理化特性分析采用高效體積排阻色譜分析(HPSEC)法。將LCP1溶解在0.1mol/L的NaN03溶液中，5(TC攪拌溶解lh，冷卻，用0.45pm尼龍膜過濾后進(jìn)樣，以已知分子量、固有粘度和dn/dc(比折光指數(shù)增量)的兩種普魯蘭多糖為標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定。高效體積排阻色譜系統(tǒng)包括ShimadzuSCL-10Avp泵和自動(dòng)進(jìn)樣器；Viscotek檢測(cè)系統(tǒng)(示差折光檢測(cè)器、粘度計(jì)和右角激光光散射檢測(cè)器)；二根串聯(lián)色譜柱(ShodexOhpakKB-806M和Ultrahydrogellinear)。以0.1mol/L的NaNO3為流動(dòng)相，流速為0.6mL/min，進(jìn)樣量100^L。使用Viscotek公司提供的TriSEC軟件計(jì)算LCPl的平均分子量、固有粘度、回旋半徑、多分散性指數(shù)和Mark-Houwink指數(shù)。LCP1高效體積排阻色譜圖(圖6)顯示LCP1為一均勻?qū)ΨQ的峰，圖中LS、RI和DP三線分別為激光光散射、示差折光和粘度信號(hào)響應(yīng)值。LCP1的重均分子量(Mw)、固有粘度(h])、回旋半徑(Rg)、多分散性指數(shù)(Pd)和Mark-Houwink指數(shù)(a)測(cè)定結(jié)果見表1，LCP1的平均分子量為1.236x106Da。回旋半徑又稱回轉(zhuǎn)半徑，是單個(gè)高分子分子鏈在空間伸展程度的一種尺度，適于對(duì)高分子聚合物分子尺寸的表征，HPSEC測(cè)得的LCP1回旋半徑為42.72nm。多分散性指數(shù)是衡量樣品相對(duì)分子質(zhì)量分布均一性的參數(shù)，Pd=Mw/Mn(Mn為數(shù)均分子量)，Pd越接近1說明樣品均一性越好，LCP1多分散性指數(shù)為1.202，說明LCP1分子量分布范圍非常窄，分子大小比較均勻。當(dāng)Mark-Houwink指數(shù)a為0.5-0.8時(shí)表明聚合物分子是一種無規(guī)巻曲的構(gòu)型，oKO.5時(shí)分子構(gòu)型接近球形，而aX).8時(shí)分子構(gòu)型是桿狀，HPSEC測(cè)得a為0.654，故LCP1分子在O.lmol/LNaN03溶液中呈無規(guī)巻曲構(gòu)型。表1LCP1的Mw、[Ti]、Rg、Pd和Mark-Houwink指數(shù)a腦飾,Wr萄LCP11,236,0001.87542.721.2020.6542、干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1的結(jié)構(gòu)分析采用部分酸水解、Smith降解和甲基化分析等方法，結(jié)合GC-MS、NMR和FT-IR等測(cè)試手段對(duì)LCP1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。2.1LCP1單糖組成分析采用離子色譜法測(cè)定單糖組成。準(zhǔn)確稱取LCP1樣品10.0025.00mg，溶于1mL1mol/L的硫酸溶液，10(TC水解2h，水解液稀釋20倍，通過高效離子色譜(HPAEC-PAD)分析其單糖組成。離子色譜測(cè)定條件為，色譜柱CarbopacePHI.PGI;流速1.0mL/min;進(jìn)樣量20pL;檢測(cè)器脈沖安培檢測(cè)器，金電極。采用NaOH溶液線性梯度洗脫(NaOH濃度100mmol/L~300mmol/L)。LCP1單糖組成的HPAEC-PAD色譜圖見圖7，結(jié)果顯示LCP1主要由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比約為3:5:2(見表2)。表2LCP1的單糖組成樣品鼠李糖(mol%)葡萄糖(mol°/。)半乳糖(mol%)LCP149.0932.2018.712.2LCP1的甲基化分析稱取約23mg經(jīng)過充分干燥的本發(fā)明單一多糖LCP1樣品于具塞反應(yīng)瓶中，加入無水DMSO充分溶解后，分別加入NaOH干燥粉末和碘甲烷進(jìn)行甲基化反應(yīng)，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，過Na2S04柱，收集濾液，N2揮發(fā)至干。甲基化反應(yīng)產(chǎn)物用TFA溶液水解，反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后用N2揮發(fā)至干，再用NaBD4進(jìn)行還原；將還原產(chǎn)物反復(fù)用乙酸/甲醇液以及甲醇除去硼酸根，N2揮發(fā)至干；加入0.5mL乙酸酐于10(TC進(jìn)行衍生，反應(yīng)結(jié)束后用N2揮發(fā)至干，即為部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。用二氯甲烷萃取，過Na2S04柱，收集濾液，采用GC-MS分析，結(jié)果如表3。GC-MS分析條件OV1701毛細(xì)管柱(0)0.25mmX30m，膜厚0.25mm)，程序升溫起始溫度150。C,以3r/min升溫至25(TC，停留10min，載氣為氦氣。EI+源，電子能量70eV，接口溫度250。C，離子源溫度20(TC，檢測(cè)器電壓350V。表3LCP1的甲基化分析(mol.%)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>甲基化分析結(jié)果表明LCP1主要由l-Rha、1，3-Rha、l-Glc、1,4-Glc、1，2-Gal和1,3,4，6-Glc組成，通過峰面積計(jì)算得到的其含量摩爾比約為2:1:2:2:2:1，Rha、Glc和Gal各單糖含量摩爾比約為3:5:2，即鼠李糖(Rha):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)=3:5:2。2.31111^111、13CNMR、HSQC、HMBC分析1111^111主要用于確定多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu)型。通常cc型糖苷異頭碳的質(zhì)子信號(hào)大于35.0，A型糖苷異頭碳的質(zhì)子信號(hào)一般小于S5.0，耦合常數(shù)3J1)2也有助于解析異頭質(zhì)子。此外，'HNMR的特征信號(hào)可以確定某些糖殘基或基團(tuán)異頭質(zhì)子(HI)和6位脫氧糖的甲基(H6)信號(hào)的線寬和積分可用于區(qū)別糖單元的類型及其相對(duì)含量；6位脫氧糖的甲基(H6)質(zhì)子信號(hào)出現(xiàn)在高場(chǎng)區(qū)S0.81.5;乙?；募谆|(zhì)子信號(hào)出現(xiàn)在低場(chǎng)區(qū)S1.82.3。LCP1的^NMR譜圖如圖8。'HNMR圖譜顯示高場(chǎng)區(qū)31.22和c51.32處較強(qiáng)的共振信號(hào)為Rha殘基的甲基質(zhì)子信號(hào)，此信號(hào)通常以兩個(gè)分得很開的成對(duì)峰出現(xiàn)，表明Rha殘基有2種不同的糖苷鍵連接方式，這與甲基化分析結(jié)果相符，部分酸水解產(chǎn)物^NMR結(jié)果與甲基化綜合分析確定31.32信號(hào)為l，3-Rha的甲基質(zhì)子信號(hào)，31.22信號(hào)為l-Rha的甲基質(zhì)子信號(hào)；32.01和(52.15為(9-乙?；募谆|(zhì)子信號(hào)，兩重峰說明乙?；〈恢冒l(fā)生在糖鏈中糖殘基的不同位置。"CNMR可通過異頭碳的共振區(qū)"90~110)峰的個(gè)數(shù)確定糖殘基的數(shù)量和相對(duì)含量。通常，&型糖苷異頭碳的化學(xué)位移在395~101范圍內(nèi)，而多數(shù)/^型糖苷異頭碳的化學(xué)位移位于(5101105。此外，由13CNMR的特征信號(hào)可以確定某些糖殘基或基團(tuán)，如乙?；奶夹盘?hào)出現(xiàn)在低場(chǎng)區(qū)S170~180;6位脫氧糖的甲基碳信號(hào)出現(xiàn)在高場(chǎng)區(qū)(51520;乙?；?CH3COO-)的甲基碳信號(hào)出現(xiàn)在較高場(chǎng)區(qū)32225。LCP1的"CNMR譜圖如圖9。HSQC是指異核單量子相干譜(HeteronuclearSingle-qauntumCoherence),它反映的是直接相連的iH、13C核之間的耦合關(guān)系(^CH)，其作用相應(yīng)于H,C-C0SY。LCP1的HSQC譜見圖10，由HSQC發(fā)現(xiàn)LCP1有10個(gè)異頭質(zhì)子。在確認(rèn)異頭質(zhì)子后，一般從異頭質(zhì)子的對(duì)角線峰出發(fā)，首先找到H1/H2的交叉峰。再由H2對(duì)角線出發(fā)峰出發(fā)，依次找出H3-H6的對(duì)角峰和化學(xué)位移。LCP1的COSY45和ROESY譜圖分別如圖11和圖12。HMBC(異核多量子相關(guān)譜，HeteronuclearMultiple-bondCorrelation)把^核與長(zhǎng)程耦合的13C關(guān)聯(lián)，提供分子骨架的結(jié)構(gòu)信息，作為一種序列分析工具給出糖單元間的連接次序。LCP1的HMBC譜圖見圖13。綜合以上譜圖分析，結(jié)合LCP1的部分酸水解和甲基化結(jié)果，對(duì)LCP1糖殘基的^和13CNMR的化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表4和表5。表4lcp1糖殘基的^nmr的化學(xué)位移(5)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.4LCP1—級(jí)結(jié)構(gòu)表征綜合以上LCP1的1D和2DNMR譜圖分析結(jié)果，結(jié)合單糖組成、紅外光譜、甲基化分析，確定LCP1具有的結(jié)構(gòu)特征為1.LCP1含有1，4-連接P-D-葡萄糖，1,3，4，6-連接(3-D-葡萄糖和1，3-連接鼠李糖按2:1:1比例構(gòu)成的主鏈；2.在1,3，4,6-連接葡萄糖的3位及6位有分支，在3位取代有單個(gè)的ot-L-鼠李糖，而在6位取代有由兩個(gè)1,2,6-連接半乳糖為核心構(gòu)成的支鏈，半乳糖的2位及6位又分別取代有鼠李糖及葡萄糖；3.&及13C-NMR譜均顯示該多糖中含有乙?；?，HMBC譜中乙?；|(zhì)子與糖環(huán)碳原子無相關(guān)，但ROESY譜中，乙?；|(zhì)子葡萄糖的H2(3.21)有弱相關(guān)峰，表明它可能取代于葡萄糖的2位；根據(jù)以上結(jié)構(gòu)特征，LCP1的分子結(jié)構(gòu)如上式I所示。其中，根據(jù)上述高效體積排阻層析過程中單個(gè)洗脫峰開始和結(jié)束時(shí)的分子量除以重復(fù)單位的分子量(1656Dalton)可以估算出n約為3001000范圍。試驗(yàn)實(shí)施例1本發(fā)明干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用17周齡，S自發(fā)性高血壓大鼠16只，隨機(jī)分為2組，每組8只。對(duì)照組給予麥芽糊精15mg/kg/d。試驗(yàn)組給予LC2W胞外多糖組分LCP115mg/kg/d。大鼠在灌胃前一周開始測(cè)壓，待血壓穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。大鼠每天灌胃一次，連續(xù)七天，并分別在灌胃的第l、3、5和7天測(cè)定大鼠血壓。在第一天實(shí)驗(yàn)中，先測(cè)定大鼠灌胃前血壓，然后灌胃，并分別測(cè)定灌胃后2，4，6，8，10，24小時(shí)大鼠血壓，觀察樣品對(duì)大鼠血壓的作用。在第三、第五和第七天的實(shí)驗(yàn)中，測(cè)壓的時(shí)間分別定在灌胃前和灌胃后2小時(shí)、4小時(shí)。結(jié)果如下單次灌胃時(shí)，LC2W胞外多糖組分LCP1灌胃前大鼠的收縮壓為187±8mmHg，灌胃后2，4和6小時(shí)分別下降至164±6，168±6和177士6mmHg，較灌胃前均顯著下降(P<0.01)(表6);而對(duì)心率沒有明顯影響(表7)。表6LCP1單次灌胃對(duì)SHR血壓的影響(i士SD，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01vs0h;#P<0.05,##P<0.01vs對(duì)照組表7LCP1單次灌胃對(duì)SHR心率的影響(J土SD,n-8)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01vs0h;#P<0.05，##P<0.01vs對(duì)照組干酪乳桿菌胞外多糖的單組分LCP1在大鼠連續(xù)灌胃過程中，觀察第一天、第三、第五和第七天灌胃后2小時(shí)和4小時(shí)的大鼠血壓變化，結(jié)果顯示LCP1在灌胃第一、三、五和第七天均有明顯的降壓作用，見表8;對(duì)照組大鼠血壓無明顯差化，見表9。表8LC2W胞外多糖單組分LCP1多次灌胃后對(duì)SHR血壓的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01vs0h;#P<0.05，##P<0.01vs對(duì)照組為麥芽糊精表9對(duì)照組麥芽糊精多次灌胃后對(duì)SHR血壓的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01vs0h;#P<0.05，##P<0.01vs對(duì)照組麥芽糊精LCPl在第三天灌胃后2小時(shí)出現(xiàn)一次性的心率減慢。在其它時(shí)間測(cè)定所獲得的心率無明顯的變化，見表IO。表10LC2W胞外多糖的單一多糖LCPl多次灌胃后對(duì)SHR心率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*P<0.05，**P<0.01vs0h;#P<0.05，##P<0.01vs對(duì)照組麥芽糊精結(jié)論干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖組分LCPl單次灌胃對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠有較強(qiáng)和持續(xù)的降壓作用，效應(yīng)峰值約為灌胃后2小時(shí)，藥后24小時(shí)恢試驗(yàn)實(shí)施例2干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1對(duì)正常Wistar大鼠血壓的影響采用尾動(dòng)脈間接測(cè)壓法，觀察干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1對(duì)正常Wistar大鼠血壓的影響。干酪乳桿菌胞外多糖的單組分LCPl按5mg/kg和25mg/kg的劑量灌胃，分別測(cè)定大鼠在灌胃前和灌胃的2、4、6、8、10、及24小時(shí)收縮壓和心率的變化。12周齡，Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為3組對(duì)照組給予麥芽糊精15mg/kg，試驗(yàn)組分別給予干酪乳桿菌LC2W胞外多糖單組分LCP15mg/kg和25mg/kg。每組8只大鼠。大鼠在灌胃前一周開始測(cè)壓二次，待血壓基線穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。分別測(cè)定大鼠在灌胃前和灌胃后2、4、6、8、10、及24小時(shí)收縮壓和心率的變化，觀察樣品對(duì)大鼠血壓和心率的影響。結(jié)果顯示干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1對(duì)Wistar大鼠的收縮壓和心率沒有明顯影響(PX).05)。見表11和表12。表ll單一多糖LCP1對(duì)Wistar大鼠血壓的影響(亍土SD，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表12單一多糖LCP1對(duì)Wistar大鼠心率的影響(7士SD，n=8)血壓0h2h4h6h8h10h24h胞外多糖5mg/kg373±25377±36377±24374±21384±19382±17377±16胞外多糖25mg/kg382±17377±21371±18373±14375±16372±14385±15麥芽糊精15mg/kg372±21367±22374土18367±14374±18381±8376±15*p<0.05，**p<0.01結(jié)論本發(fā)明干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1對(duì)Wistar大鼠的收縮壓和心率沒有明顯影響。權(quán)利要求1、一種具有下述結(jié)構(gòu)式I的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)胞外多糖的單一多糖LCP1，其中，n＝300～1000。2、如權(quán)利要求1所述的單一多糖LCP1，其特征在于所述的單一多糖LCP1的重均分子量為1.236><106道爾頓、固有粘度為1.875dL/g、回旋半徑為42.72nm、多分散性指數(shù)為1.202和Mark-Houwink指數(shù)為0.654。3、一種如權(quán)利要求1或2所述的單一多糖LCP1的制備方法，其采用硫酸銨沉淀法從干酪乳桿菌胞外多糖中分離，包括下列步驟在濃度為0.8lw/w。/。的干酪乳桿菌胞外多糖水溶液中，加入硫酸銨至其濃度為15-15.5w/w%，靜置1小時(shí)，然后4。C、9000rpm離心30分鐘，沉淀部分用水溶解，然后采用分子截留極限為12000Dalton的膜在4。C透析48小時(shí)，再將截留液干燥。4、如權(quán)利要求1或2所述的干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1在制備防治高血壓病的藥品或飲食品中的應(yīng)用。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的飲食品為乳制品。6、一種防治高血壓病的藥物組合物，其包括作為活性成分的如權(quán)利要求1或2所述的干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1。7、一種乳制品，其包括如權(quán)利要求1或2所述的干酪乳桿菌胞外多糖的單一多糖LCP1。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有右述結(jié)構(gòu)式I的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)胞外多糖的單一多糖LCP1，其中，n＝300～1000。本發(fā)明還公開了上述單一多糖LCP1的制備方法及其在抗高血壓方面的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P9/12GK101314620SQ20071004138公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2007年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者錦葉,吳正鈞,王蔭榆,艾連中,郭本恒,瑨韓申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司